辛 磊 蒙艷錦 錢 豐 容萬韜

眼優(yōu)角蚱成蟲腸道細(xì)菌的分離及鑒定

辛 磊 蒙艷錦 錢 豐 容萬韜

（河池學(xué)院化學(xué)與生物工程學(xué)院，廣西 宜州 546300）

為明確眼優(yōu)角蚱的取食消化機(jī)制和營養(yǎng)生理，對其成蟲腸道細(xì)菌進(jìn)行研究。文章叢自然界采集的眼優(yōu)角蚱成蟲腸道中按傳統(tǒng)方法分離純化，共獲得10株細(xì)菌，對其形態(tài)、生理生化指標(biāo)進(jìn)行系統(tǒng)研究及分子生物學(xué)鑒定。結(jié)果表明，10株菌株革蘭氏染色均呈陽性，均具有纖維素降解能力。編號為MYJ01、MYJ03、MYJ05、MYJ06、MYJ07、MYJ08、MYJ09、MYJ10的8株菌株為桿菌，能代謝葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、甘露醇等，但不能代謝乳糖、棉子糖；MYJ02、MYJ04這兩株為球菌，不能代謝乳糖、棉子糖、纖維二糖。經(jīng)鑒定前者為枯草芽孢桿菌，后者為沃氏葡萄球菌。

眼優(yōu)角蚱；腸道細(xì)菌；分離鑒定

引言

眼優(yōu)角蚱（）屬于刺翼蚱科優(yōu)角蚱屬，為該科的優(yōu)勢種[1]。體型偏中小型，褐色，廣泛分布在中國溫度較適宜的東南部地區(qū)[2]。眼優(yōu)角蚱好生活在陰涼、有水流、布滿青苔和地衣的地方，適應(yīng)性強(qiáng)。這種生活偏好性與它們的取食習(xí)性有關(guān)，特別是腐殖質(zhì)豐富的地方。它們主要以幼嫩的苔蘚和腐殖質(zhì)為食，這些地方不僅有豐富的食物，而且復(fù)雜的環(huán)境還給它們提供了躲避天敵的良好場所。

昆蟲是目前已知的動物群體中種類最多的一類生物[3]。在很大的程度上昆蟲的多樣性離不開與其共生的微生物[4]。共生微生物是由于宿主昆蟲在進(jìn)食和消化的時侯，有一小部分的微生物停留在腸道內(nèi)的上皮組織中[5]，會以各種形式參與宿主昆蟲的生長及發(fā)育[6]。除了這些，它們與宿主昆蟲之間的關(guān)系還有著復(fù)雜的相互作用，對宿主的病理等方面也會產(chǎn)生影響。昆蟲腸道是一個十分重要的器官，內(nèi)部環(huán)境極其特殊，常伴隨著宿主昆蟲的取食、消化、排泄等活動而不斷改變[7]。腸道內(nèi)棲息著種類豐富的微生物，這些微生物的存在對宿主昆蟲的許多生命活動產(chǎn)生極大的影響[8]。

腸道微生物是指棲息于宿主消化道內(nèi)所有微生物的總稱[9]。研究者們對這些微生物進(jìn)行研究時發(fā)現(xiàn)，宿主昆蟲多樣化的生境及取食行為，在極大的程度上得益于有益菌的貢獻(xiàn)。據(jù)統(tǒng)計，微生物總量大約是占昆蟲生物量的1%～10%，是宿主昆蟲體內(nèi)是不可缺少的重要組成部分[10]。對昆蟲腸道微生物的研究，旨在打破其內(nèi)部環(huán)境，使其不能正常生長和發(fā)育，從而控制害蟲的發(fā)生。腸道微生物的種類組成對宿主昆蟲許多生理活動有很大的作用，尤其是在昆蟲的取食、消化和營養(yǎng)作用等方面。

目前，國內(nèi)外對眼優(yōu)角蚱的研究主要集中在其生活史及其生物學(xué)特性方面，以昆蟲營養(yǎng)學(xué)與生理為主要目標(biāo)而開展的研究少之又少。就國內(nèi)而言，對昆蟲腸道細(xì)菌等微生物的研究所涉及到的昆蟲只有極少數(shù)[11]，主要是家蠶、松毛蟲和桑粒肩天牛等[12]。隨著時代的快速發(fā)展，特別是在科學(xué)技術(shù)方面，分子生物學(xué)技術(shù)得到廣泛的應(yīng)用，昆蟲腸道細(xì)菌的潛在價值得到研究者們的發(fā)掘，尤其是在農(nóng)業(yè)方面對害蟲的預(yù)防和控制、環(huán)境資源的保護(hù)以及工業(yè)生產(chǎn)等領(lǐng)域已經(jīng)給人們帶來了意想不到的成果[12]。如在天牛腸道微生物中分離得出具有降解木質(zhì)纖維素能力的細(xì)菌[12]；蜜蜂腸道微生物有抵抗病原體作用[13]；從白蟻、蟑螂和甲蟲等昆蟲腸道中分離出了多種纖維素、半纖維素降解菌[14]；杜貝貝等[15,16]對不同家蠶腸道微生物進(jìn)行測序研究，發(fā)現(xiàn)對宿主家蠶有益的細(xì)菌；黃粉蟲和大麥蟲腸道微生物對塑料多聚物的降解[17]；劉小改等[18]采用16S rDNA基因測序技術(shù)對稻縱卷葉螟4齡幼蟲的腸道微生物進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)許多有益菌。而關(guān)于眼優(yōu)角蚱腸道細(xì)菌分離及其鑒定方面的研究屬于空白狀態(tài)。本研究采用傳統(tǒng)的平板法對眼優(yōu)角蚱成蟲消化道內(nèi)菌群進(jìn)行分離、純化及生理生化代謝試驗，并結(jié)合細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊[19,20]和16S rDNA等技術(shù)進(jìn)行鑒定，為后續(xù)研究眼優(yōu)角蚱取食消化機(jī)制、營養(yǎng)生理提供一定的技術(shù)支持和理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗蟲源

選取當(dāng)?shù)卮笮∫恢碌慕】党上x雌雄各5只作為實驗材料，將雌雄分開放入飼養(yǎng)盒中，并做好標(biāo)記。

1.1.2 培養(yǎng)基

培養(yǎng)基的種類情況如表1所示。

表1 培養(yǎng)基種類

培養(yǎng)基類型蛋白胨牛肉膏氯化鈉瓊脂蒸餾水pH 牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（NA）10 g3 g5 g15 g～20 g1000 mL7.2～7.4 牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（NB）10 g3 g5 g—1000 mL7.2～7.4 各種生理生化培養(yǎng)基糖發(fā)酵培養(yǎng)基、苯丙氨酸瓊脂培養(yǎng)基、氨基酸脫羧酶培養(yǎng)基等

1.1.3 儀器和試劑

生化恒溫培養(yǎng)箱、無菌操作臺、光學(xué)顯微鏡、高壓蒸汽滅菌鍋等；乙醇（75%）、次氯酸鈉溶液（35%）、3%H2O2溶液、溴甲酚紫、甲基紅、革蘭氏染色試劑。

1.2 腸道細(xì)菌分離與純化

1.2.1 蟲體表面消毒

將采集分類好的活體眼優(yōu)角蚱成蟲置于室內(nèi)進(jìn)行24 h饑餓處理后，在無菌條件下分別置于75%的乙醇中浸泡10 s殺死，用無菌水清洗；再浸入35%的次氯酸鈉溶液消毒2 min～3 min，用無菌水再清洗；最后再置于75%的乙醇中消毒，無菌水清洗干凈，備用。

1.2.2 制備消化道稀釋液

將上述蟲體在無菌條件下進(jìn)行解剖，取出整條腸道。將其放入已滅菌的研缽中充分研磨并加入10 mL無菌水形成勻漿，后轉(zhuǎn)入試管振蕩約5 min。移液管移取1 mL菌懸液加入盛有9 mL無菌水的試管中，振蕩混勻；以此類推逐級稀釋制成10-1、10-2……10-8不同稀釋度的腸道菌懸液，并做好標(biāo)記，備用。

1.2.3 平板涂布法

取10-6、10-7、10-8這3個稀釋度的菌懸液，用涂抹法進(jìn)行分離培養(yǎng)，每個稀釋度重復(fù)3次，分別置于37℃恒溫箱中倒置培養(yǎng)24 h[21,22]，依次做好標(biāo)記。

1.3 腸道細(xì)菌的鑒定

1.3.1 細(xì)菌革蘭氏染色和形態(tài)觀察

將分離得到的菌株進(jìn)行純化培養(yǎng)，觀察其菌落的外觀形態(tài)特征；菌落表面顏色的觀察；菌落是否具有一定的透明度等。革蘭氏染色的顯色反應(yīng)結(jié)果通過光學(xué)顯微鏡進(jìn)行觀察并記錄[23]。

1.3.2 細(xì)菌的生理生化試驗

將純化后的菌株培養(yǎng)物進(jìn)行吲哚試驗、淀粉水解試驗、V-P試驗、甲基紅試驗、檸檬酸鹽試驗、苯丙氨酸脫氫酶試驗、明膠液化試驗、氫化酶試驗、鳥氨酸脫羧酶試驗等各項生理生化試驗，根據(jù)相應(yīng)的試驗方法，置于恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，觀察并做好記錄。再結(jié)合《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》進(jìn)行結(jié)果判斷。

1.3.3 同化碳（氮）源試驗

碳（氮）源主要是微生物進(jìn)行健康生長所必需的各種化合營養(yǎng)物質(zhì)，在研究和制備各種微生物的培養(yǎng)基中具有重要的地位和作用，為保證微生物的正常生長發(fā)育提供了物質(zhì)依據(jù)。

將滅菌的無碳培養(yǎng)基倒入平板并做好標(biāo)記。置于室內(nèi)冷卻凝固后，在其背面進(jìn)行區(qū)域劃分。另外再取一滅過菌的移液管，按照編號吸取0.2 mL已純化菌株的菌懸液滴在各個平板上并涂抹均勻。用接種環(huán)于各種碳源中取一定量放到與編號相適當(dāng)?shù)奈恢蒙?，做好?biāo)記，將平板倒置，放入28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，3 d～7 d后即可取出觀察，將所觀察到的現(xiàn)象進(jìn)行記錄。同化氮源的試驗方法與同化碳源相同。

1.3.4 糖（醇）發(fā)酵試驗

糖（醇）發(fā)酵生化反應(yīng)試驗的使用很普遍，特別是在腸道細(xì)菌的鑒別方面起著重要的作用。根據(jù)相關(guān)的研究可知，大部分的細(xì)菌都能利用糖類作為生長所需的碳源，即便是這樣它們在分解糖的能力上也是存在很大的差異。在無菌操作下，用接種環(huán)挑取少許已純化的菌種放入各個糖類發(fā)酵試驗用的液體培養(yǎng)基中。本試驗中是否產(chǎn)酸可利用溴甲酚紫[pH5.2（黃色）～pH6.8（紫色）]酸堿指示劑來檢驗，當(dāng)發(fā)酵產(chǎn)酸時，可使培養(yǎng)基由紫色變黃色。如產(chǎn)氣，小管中會收集到一部分氣體，不產(chǎn)氣則管中無氣體。用記號筆在標(biāo)簽上標(biāo)明培養(yǎng)基的種類名稱和所接種的菌株編號，再將其貼至試管外壁。置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后取出進(jìn)行觀察，并記錄結(jié)果。本次試驗所用到的糖類分別為葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、半乳糖、海藻糖、棉子糖、纖維二糖、甘露醇。

1.3.5 纖維素水解試驗

纖維素為大分子多糖，而剛果紅可以和大分子的多糖進(jìn)行牢固地結(jié)合。纖維素酶把培養(yǎng)基中的纖維素降解為小分子糖，使得剛果紅不能與之結(jié)合，就會在沖洗后脫落呈現(xiàn)出一個透明圈。

在無菌環(huán)境下進(jìn)行操作，用接種環(huán)挑取少量已純化的菌種放入纖維素平板培養(yǎng)基中進(jìn)行劃線，并置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行37 h培養(yǎng)。再加入剛果紅進(jìn)行染色10 min～15 min，棄去染液，再用1 mol/L NaCl溶液進(jìn)行多次沖洗[24]。判斷的依據(jù)是看沖洗后是否形成透明圈，能夠產(chǎn)生透明圈就說明該細(xì)菌具有纖維素分解的能力[25]。

1.3.6 細(xì)菌分子學(xué)鑒定

將分離純化得到的10個樣送到上海派森諾生物科技有限公司進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定，最后再利用MEGA7.0軟件進(jìn)行同源性比較，并進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建。

2 結(jié)果與分析

2.1 腸道細(xì)菌的分離純化

從NA培養(yǎng)基中挑取表征各異的菌落，分離得到10株菌株，編號分別命名為MYJ01、MYJ02、MYJ03、MYJ04、MYJ05、MYJ06、MYJ07、MYJ08、MYJ09、MYJ10，其中MYJ01～MYJ05和MYJ09這六株是從雄性眼優(yōu)角蚱腸道中分離得到；MYJ06～MYJ08和MYJ10四株為其雌性中分離得到。

2.2 細(xì)菌革蘭氏染色和形態(tài)觀察結(jié)果

10株菌株的染色結(jié)果均呈革蘭氏陽性，結(jié)果見表2。8株為桿狀菌，MYJ01、MYJ03、MYJ05、MYJ07、MYJ09這5株菌株為長桿狀，MYJ06、MYJ08、MYJ10這3株為短桿狀，MYJ02、MYJ04這2株為粗大的球狀菌，成單，雙鏈或不規(guī)則的葡萄狀排列，見圖1。

10株菌株在菌落形態(tài)上有一定的細(xì)微差別，MYJ01、MYJ03、MYJ05、MYJ07、MYJ09這5株長桿狀的菌中MYJ01的菌落特征為污白色，邊緣不規(guī)則，菌落粗糙，有褶皺，中央凸起不透明；MYJ03的菌落特征為微帶黃色，邊緣圓形，菌落粗糙，有褶皺，不透明；MYJ05的菌落特征為乳白色，邊緣不規(guī)則，菌落表面有褶皺，不透明；MYJ07的菌落特征為污白色，邊緣不規(guī)則，菌落粗糙，有褶皺，中央凸起，不透明；MYJ09的菌落特征為微帶黃色，邊緣不規(guī)則，中等菌落，有褶皺，不透明。根據(jù)觀察到的微小特征差異將它們逐一分離。同樣的方式將MYJ06、MYJ08、MYJ10這3株短桿菌進(jìn)行分離。與其他8株差別較大的是MYJ02和MYJ04這2株，MYJ02為白色，邊緣整齊，菌落光滑微凸起，不透明；MYJ04為淡淡的黃色，邊緣整齊，菌落光滑微凸起，不透明。它們的菌落表征都比較相似，但表面顏色有一定差異，所以將它們分為兩株菌。

從表2中可以看出雌性眼優(yōu)角蚱腸道微生物分離出的MYJ06、MYJ07、MYJ08、MYJ10，這4株菌株均為桿狀菌。雄性眼優(yōu)角蚱不同于雌性的是MYJ02、MYJ04這2株為球狀菌。MYJ01、MYJ03和MYJ05-MYJ10這幾株菌株在NA培養(yǎng)基上菌落特征和涂片鏡檢結(jié)果符合《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊》（第八版）對芽孢桿菌屬的描述，據(jù)此初步判斷這8株桿狀菌為芽孢桿菌屬疑似菌株。根據(jù)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊中的描述MYJ02、MYJ04這2株球狀菌初步判斷為葡萄球菌屬疑似菌株。

表2 細(xì)菌革蘭氏染色和觀察結(jié)果

菌株菌落形態(tài)革蘭氏染色鏡檢結(jié)果 MYJ01污白色，邊緣不規(guī)則，菌落粗糙，有褶皺，中央凸起，不透明+，長桿菌 MYJ02白色，邊緣整齊，菌落光滑微凸起，不透明+，球狀、多葡萄狀排列 MYJ03微帶黃色，邊緣圓形，菌落粗糙，有褶皺，不透明+，長桿菌 MYJ04淡黃色，邊緣整齊，菌落光滑微凸起，不透明+，球狀、多葡萄狀排列 MYJ05乳白色，邊緣不規(guī)則，菌落表面有褶皺，不透明+，長桿菌 MYJ06乳白色，圓形，中等菌落且粗糙，有褶皺，不透明+，短桿菌 MYJ07污白色，邊緣不規(guī)則，菌落粗糙，有褶皺，中央凸起，不透明+，長桿菌 MYJ08污白色，邊緣圓形，菌落較大，有褶皺，中央凸起，不透明+，短桿菌 MYJ09微帶黃色，邊緣不規(guī)則，中等菌落，有褶皺，不透明+，長桿菌 MYJ10污白色，邊緣圓形，菌落粗糙，中央凸起，有褶皺，不透明+，短桿菌

注：+：陽性；-：陰性。

a. MYJ01菌株；b. MYJ02菌株；c. MYJ03菌株；d. MYJ04菌株；e. MYJ05菌株；f. MYJ06菌株；g. MYJ07菌株；h. MYJ08菌株；i. MYJ09菌株；j. MYJ10菌株。

2.3 細(xì)菌的生理生化試驗結(jié)果

腸道細(xì)菌的生理生化試驗結(jié)果如表3所示，在接觸酶試驗中10株菌株均有氣泡產(chǎn)生，說明這幾株菌株含有過氧化氫酶，呈陽性。

硫化氫試驗結(jié)果顯示，每一株菌株都是呈現(xiàn)陰性，說明它們不能在培養(yǎng)基中分解醋酸鉛中的硫代硫酸鈉。在淀粉水解試驗中滴加碘液后10株菌株的菌落周圍都有透明圈出現(xiàn)，呈陽性。說明這10株菌株都能通過分泌一種淀粉酶將菌落周圍培養(yǎng)基中的淀粉進(jìn)行水解。

苯丙氨酸脫氫酶試驗時向培養(yǎng)基中滴加10% FeCl3溶液后，培養(yǎng)基沒有產(chǎn)生綠色反應(yīng)，說明這幾株細(xì)菌不具有苯丙氨酸脫氫酶，不能使其生成苯丙酮酸，遇三氯化鐵指示劑不能呈現(xiàn)綠色現(xiàn)象為陰性。

明膠液化試驗中明膠有明顯的液化現(xiàn)象，說明這幾株細(xì)菌能產(chǎn)生明膠酶，能使明膠先水解為多肽、后進(jìn)一步水解為氨基酸，呈陽性。

精氨酸雙水解酶試驗結(jié)果中培養(yǎng)基沒有變?yōu)樽仙?，說明精氨酸不能經(jīng)過兩次水解生成腐胺，使培養(yǎng)基不呈堿性，結(jié)果的現(xiàn)象為黃色，呈陰性。

V-P試驗中MYJ01、MYJ03和MYJ05-MYJ10這幾株菌株的培養(yǎng)液變成了紅色，結(jié)果為陽性；甲基紅試驗與V-P試驗結(jié)果相反，培養(yǎng)液為黃色，說明這幾株菌株不能使葡萄糖產(chǎn)生有機(jī)酸，為陰性；而MYJ02、MYJ04這兩株正好與前面的8株相反。

檸檬酸鹽試驗中MYJ01、MYJ03和MYJ05-MYJ10這8株培養(yǎng)基顯現(xiàn)紅色，說明這幾株菌能利用檸檬酸鹽作為生長的營養(yǎng)物質(zhì)，呈陽性；剩余兩株為陰性。

糖類利用實驗中MYJ01、MYJ03和MYJ05-MYJ10這幾株菌株能夠利用葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、纖維二糖、木糖、海藻糖、果糖等，呈陽性，不能利用乳糖。不同的是MYJ02、MYJ04這兩株菌株除了乳糖不能利用之外，還不能利用甘露醇、纖維二糖、木糖、棉子糖、阿拉伯糖，呈陰性。

表3 細(xì)菌的生理生化試驗結(jié)果

項目MYJ01MYJ02MYJ03MYJ04MYJ05MYJ06MYJ07MYJ08MYJ09MYJ10 接觸酶＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋ 硫化氫產(chǎn)生－－－－－－－－－－ 淀粉水解＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋ V-P＋－＋－＋＋＋＋＋＋ 甲基紅（M.R）－＋－＋－－－－－－ 檸檬酸鹽＋－＋－＋＋＋＋＋＋ 苯丙氨酸脫氫酶－－－－－－－－－－ 明膠液化＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋ 精氨酸雙水解酶－－－－－－－－－－ 葡萄糖＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋ 蔗糖＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋ 麥芽糖＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋ 乳糖－－－－－－－－－－ 甘露醇＋_＋_＋＋＋＋＋＋ 纖維二糖＋－＋－＋＋＋＋＋＋ 木糖＋－＋－＋＋＋＋＋＋ 海藻糖＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋ 棉子糖＋－＋－＋＋＋＋＋＋ 果糖＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋ 阿拉伯糖＋－＋－＋＋＋＋＋＋

注：＋：陽性；－：陰性。

2.4 同化碳源、氮源利用結(jié)果

同化碳源、氮源利用結(jié)果如表4所示，從眼優(yōu)角蚱成蟲腸道中分離出的細(xì)菌菌株在體外對葡萄糖、蔗糖等糖類有機(jī)的碳源利用率較高，對無機(jī)碳源的利用相對來說比較低。從表中還可以看出這幾株菌株在氮源與無機(jī)碳源的利用率上都是比較低，不能很好地利用這部分物質(zhì)作為生長所需的主要碳氮來源。MYJ01、MYJ03和MYJ05-MYJ10在大部分利用碳源和氮源的利用率上都相同，其中要特別注意的是MYJ09在尿素的利用上與其他幾株的結(jié)果不一樣，可能是由于實驗員操作經(jīng)驗不規(guī)范和觀察不仔細(xì)導(dǎo)致試驗產(chǎn)生誤差引起的。MYJ02、MYJ04這兩株菌株在碳源、氮源的利用率上均相同，說明這兩株菌株對生長所需的營養(yǎng)物質(zhì)相同。

表4 同化碳源、氮源利用結(jié)果

編號碳源氮源 葡萄糖蔗糖乳糖木糖甘露醇可溶性淀粉明膠硝酸銨尿素蛋白胨 MYJ01＋＋－＋＋＋－＋－＋ MYJ02＋＋－－＋＋－－＋＋ MYJ03＋＋－＋＋＋－＋－＋ MYJ04＋＋－－＋＋－－＋＋ MYJ05＋＋－＋＋＋－＋－＋ MYJ06＋＋－＋＋＋－＋－＋ MYJ07＋＋－＋＋＋－＋－＋ MYJ08＋＋－＋＋＋－＋－＋ MYJ09＋＋－＋＋＋－＋＋＋ MYJ10＋＋－＋＋＋－＋－＋

注：＋：陽性；－：陰性。

2.5 糖（醇）發(fā)酵試驗結(jié)果

糖醇發(fā)酵試驗結(jié)果見表5，MYJ01、MYJ03和MYJ05- MYJ10這8株菌株能夠?qū)⑵咸烟沁M(jìn)行發(fā)酵，結(jié)果顯示產(chǎn)酸而不產(chǎn)氣，可以代謝部分糖類和甘露醇，能使溴甲酚紫指示劑呈現(xiàn)黃色，為陽性；不能代謝乳糖、棉子糖產(chǎn)酸，因而指示劑不變色，為陰性。

MYJ02和MYJ04這兩株菌株可以代謝葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、海藻糖、甘露醇，指示劑變黃，呈陽性。不能代謝乳糖、棉子糖、纖維二糖，指示劑不變色，呈陰性。MYJ02和MYJ04這兩株菌株能夠?qū)⑵咸烟沁M(jìn)行發(fā)酵，結(jié)果顯示為產(chǎn)酸而不產(chǎn)氣，是葡萄球菌的一個很重要的生化特性。

結(jié)合以上生理生化指標(biāo)的試驗結(jié)果，再根據(jù)《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》和《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》，初步鑒定MYJ01、MYJ03和MYJ05-MYJ10這8株菌株為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），MYJ02和MYJ04這兩株菌株為沃氏葡萄球菌（Staphylococcus wameri）。

表5 糖發(fā)酵試驗結(jié)果

序號葡萄糖麥芽糖蔗糖乳糖海藻糖棉子糖纖維 二糖甘露醇 MYJ01＋＋＋－＋＋＋＋ MYJ02＋＋＋－＋－－＋ MYJ03＋＋＋－＋＋＋＋ MYJ04＋＋＋－＋－－＋ MYJ05＋＋＋－＋＋＋＋ MYJ06＋＋＋－＋＋＋＋ MYJ07＋＋＋－＋＋＋＋ MYJ08＋＋＋－＋＋＋＋ MYJ09＋＋＋－－＋＋＋ MYJ10＋＋＋－＋＋＋＋

注：“＋”表示陽性；“－”表示陰性。

2.6 纖維素試驗結(jié)果

纖維素試驗的結(jié)果如圖2所示，10株菌株的菌落周圍均能夠顯現(xiàn)纖維素酶水解圈。眼優(yōu)角蚱主要是以幼嫩苔蘚和腐殖質(zhì)為食，其中含有豐富的纖維素。腸道細(xì)菌能夠?qū)⒗w維素進(jìn)行降解，以促進(jìn)對食物的消化，提高對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收。

圖2 10株菌株的纖維素酶水解圈

2.7 16S rDNA測序結(jié)果

根據(jù)相關(guān)文章中可知，當(dāng)所測菌株與16S rDNA序列同源性大于99%時，可以認(rèn)為它們屬于是同一個種。經(jīng)16S rDNA測序結(jié)果，將測序得的序列在NCBI GEN BANK中進(jìn)行blast檢索。從中匹配出同源性較高的典型菌株，將10株菌株與典型菌株序列利用MEGA7.0軟件進(jìn)行多序列匹配排列并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。從圖3中可以看出，菌株MYJ01、MYJ03和MYJ05～MYJ10與枯草芽孢桿菌遺傳距離最小，親緣關(guān)系較近；而MYJ02、MYJ04與沃氏葡萄球菌遺傳距離最小，親緣關(guān)系較近。再結(jié)合分離純化得出的菌株的革蘭氏染色鏡檢結(jié)果、菌落的形態(tài)特征觀察、生理生化特征試驗，最后確定分離的10株細(xì)菌中MYJ02、MYJ04這2株屬于葡萄球菌屬沃氏葡萄球菌（Staphylococcus wameri）；剩余的8株屬于芽孢桿菌屬枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），此結(jié)果與形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果一致。

圖3 10株分離菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹

3 討論

本試驗對眼優(yōu)角蚱成蟲消化道內(nèi)菌群做了初步性研究。利用傳統(tǒng)分離純化方法共純化得到10株菌株。后對其主要的生理生化反應(yīng)進(jìn)行試驗，結(jié)合分子生物學(xué)技術(shù)，確定篩選分離出的10株菌株中MYJ01、MYJ03和MYJ05-MYJ10這8株菌株為枯草芽孢桿菌，MYJ02和MYJ04為沃氏葡萄球菌，其中優(yōu)勢種群為枯草芽孢桿菌。雌性成蟲腸道細(xì)菌種類相較于雄性成蟲來說，豐富度較低，推測原因可能是與分離方法及雌雄成蟲生活方式和生理功能有關(guān)。

本試驗分離得出的10株菌株都具有纖維降解的能力，這與蚱的取食特性有非常大的關(guān)系。從許多前人的研究中得知，能夠產(chǎn)生纖維素酶的腸道內(nèi)生細(xì)菌，在很大程度上可將纖維素進(jìn)行降解，目的是幫助宿主昆蟲消化掉它從外界攝入體內(nèi)的高纖維食物，將其難吸收的大分子物質(zhì)水解為可供身體活動利用的小分子物質(zhì)[26]。營養(yǎng)物質(zhì)的有效利用，可以加快宿主昆蟲對食物的消化，減少疾病的發(fā)生。這一特點對眼優(yōu)角蚱的取食消化機(jī)制及營養(yǎng)生理有重要的影響。

由于條件受限，本次試驗采用平板稀釋分離、斜面純化培養(yǎng)等方法對眼優(yōu)角蚱成蟲腸道細(xì)菌進(jìn)行培養(yǎng)，均屬于依靠傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)手段。從10株分離菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹分析，再結(jié)合前面所做的各類生理生化試驗得出結(jié)果，分離得到的細(xì)菌種類不多，許多微生物難以體外培養(yǎng)，因此，對于眼優(yōu)角蚱腸道細(xì)菌的多樣性有很大的局限[27,28]。從以往使用分子生物學(xué)方法研究的結(jié)果顯示，研究者們從自然界中只分離出了0.1%～1.0%的微生物，剩余99%以上的環(huán)境微生物是無法純培養(yǎng)的[29]。因此，以純培養(yǎng)技術(shù)為基礎(chǔ)對腸道微生物進(jìn)行的研究結(jié)果還是欠缺一定的代表性[30]，但仍可為后續(xù)研究作為參考。

4 結(jié)論

到目前為止，關(guān)于直翅目昆蟲腸道細(xì)菌的研究主要集中于蝗蟲類，對眼優(yōu)角蚱腸道細(xì)菌的分離與鑒定在其他學(xué)者的研究中并未提及。本試驗在眼優(yōu)角蚱成蟲腸道中分離及鑒定出了枯草芽孢桿菌和沃氏葡萄球菌。其中枯草芽孢桿菌在許多的領(lǐng)域里已得到開發(fā)，特別是畜牧業(yè)等方面的應(yīng)用?？莶菅挎邨U菌是一種廣泛分布于自然界和昆蟲腸道里的有益菌，其對外界惡劣的環(huán)境具有超強(qiáng)的抵抗能力，且生存能力頑強(qiáng)。雖然關(guān)于沃氏葡萄球菌的報道比較少，但其應(yīng)用潛力也很大，是一種在動物和人身上共有的常見細(xì)菌。沃氏葡萄球菌與人類某些疾病存在一定的關(guān)系，對這方面的研究還有待開發(fā)。從這些研究中看出，腸道細(xì)菌種類的分離和鑒別在人們生活中的很多方面都具有重要的影響。鑒別菌株種類為眼優(yōu)角蚱的取食消化機(jī)制和營養(yǎng)生理提供理論意義的同時，也為眼優(yōu)角蚱腸道內(nèi)生菌種的進(jìn)一步開發(fā)和利用奠定了研究基礎(chǔ)，因此，本試驗具有重要的潛在應(yīng)用價值。

[1] 鄧維安，劉夏. 廣西刺翼蚱科昆蟲生境選擇與生態(tài)適應(yīng)性的研究[J]. 河池學(xué)院學(xué)報，2018，38(5): 1-10.

[2] 肖舒晴，崔鵬，李曉東，等. 眼優(yōu)角蚱生活史及其生物學(xué)特性[J]. 環(huán)境昆蟲學(xué)報，2019，41(6): 1366-1374.

[3] Chapman R F, Simpson S J, Douglas A E. The Insects: Structure and function (5th edn.)[M]. Cambridge: Cambridge University Press, 2013.

[4] Kaltenpoth M, Engl T. Defensive microbial symbionts in Hymenoptera[J]. Functional Ecology, 2014, 28(2): 315-327.

[5] Crotti E, Balloi A, Hamdi C, et al. Microbial symbionts: a resource for the management of insect-related problems[J]. Microbial Biotechnology, 2012, 5(3): 307-317.

[6] 張靜，張博. 昆蟲腸道微生物研究進(jìn)展[J]. 科技創(chuàng)新與應(yīng)用，2017(5): 50.

[7] 黃旭，黃韻姍，張靜宇，等. 昆蟲體內(nèi)不同微生物間互作關(guān)系的研究進(jìn)展[J]. 中國生物防治學(xué)報，2015，31(6): 936-945.

[8] 周帆，龐志倡，余小強(qiáng)，等. 昆蟲腸道微生物的研究進(jìn)展和應(yīng)用前景[J]. 應(yīng)用昆蟲學(xué)報，2020，57(3): 600-607.

[9] Douglas A E. Multiorganismal insects: Diversity and functionof resident microorganisms[J]. Annual Review of Entomology, 2015, 60(1): 17-34.

[10] 向玉勇，徐中秋，柴新義. 金銀花尺蠖幼蟲腸道細(xì)菌分離與鑒定[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，45(2): 106-108.

[11] 張振宇，圣平，黃勝威，等. 昆蟲腸道微生物的多樣性、功能及應(yīng)用[J]. 生物資源，2017，39(4): 231-239.

[12] 盤碧瓊，蘇冉冉，鄭霞林，等. 天牛腸道細(xì)菌多樣性及其降解纖維素研究進(jìn)展[J]. 華中昆蟲研究，2020，16: 107-115.

[13] 張晴晴，歐陽芳，戈峰. 蜜蜂腸道微生物的多樣性及功能研究進(jìn)展[J]. 應(yīng)用昆蟲學(xué)報，2020，57(5): 1064-1075.

[14] 梅承，范碩，楊紅. 昆蟲腸道微生物分離培養(yǎng)策略及研究進(jìn)展[J]. 微生物學(xué)報，2018，58(6): 985-994.

[15] 杜貝貝，劉影俠，王海英，等. 不同家蠶品種腸道微生物多樣性初步分析[C]. 第十二屆家(柞)蠶遺傳育種暨良種繁育學(xué)術(shù)研討會論文集(摘要匯編)，2016.

[16] 郝志華，朱佳林，黃志君. 家蠶腸道微生物的研究進(jìn)展[J]. 廣東蠶業(yè)，2016，50(5): 1-6.

[17] 楊莉. 黃粉蟲和大麥蟲腸道微生物對塑料多聚物的降解研究[D]. 北京: 北京林業(yè)大學(xué)，2020.

[18] 劉小改，楊亞軍，廖秋菊，等. 稻縱卷葉螟腸道細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與多樣性分析[J]. 昆蟲學(xué)報，2016，59(9): 965-976.

[19] 東秀珠，蔡妙英. 常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(第2版)[M]. 北京: 科學(xué)出版社，2001．

[20] 布坎南，吉本斯. 伯杰細(xì)菌鑒定手冊(第8版)[M]. 北京: 科學(xué)出版社，1984．

[21] 王建梅. 3種蝗蟲的腸道微生物多樣性分析及纖維素降解菌的分離[D]. 保定: 河北大學(xué)，2020.

[22] 林夢丹，王國增，葉秀云，等. 產(chǎn)α-淀粉酶海洋微生物的篩選及酶學(xué)性質(zhì)研究[J]. 中國食品學(xué)報，2017，17(2): 77-84.

[23] 咸洪泉，郭立忠，李樹文. 微生物學(xué)實驗[M]. 北京: 高等教育出版社，2018.

[24] 謝柳，魯平才，趙釬. 一株凈水枯草芽孢桿菌的分離、鑒定及應(yīng)用[J]. 環(huán)保科技，2019，25(6): 1-4.

[25] 李繼兵. 五株芽孢桿菌新種的分離純化及其鑒定研究[D]. 上海: 上海海洋大學(xué)，2015.

[26] 李宏偉，楊曉潔，向奕舟，等. 草地貪夜蛾幼蟲腸道細(xì)菌的分離鑒定及纖維素降解細(xì)菌的篩選[J]. 應(yīng)用昆蟲學(xué)報，2020，57(3): 608-616.

[27] 林曉麗. 小菜蛾腸道細(xì)菌多樣性分析及兩株細(xì)菌的殺蟲活性研究[D]. 咸陽: 西北農(nóng)林科技大學(xué)，2014.

[28] 劉娟，劉曉飛，關(guān)統(tǒng)偉，等. 中華蜂體內(nèi)放線菌的分離、多樣性及抗菌活性研究[J]. 微生物學(xué)通報，2014，41(12): 2410-2422.

[29] 胡霞. 華山松大小蠹腸道微生物群落多樣性與幼蟲腸道纖維素降解菌的研究[D]. 咸陽: 西北農(nóng)林科技大學(xué)，2014.

[30] 向候君，蔡普默，季清娥，等. 昆蟲體內(nèi)共生菌鑒定方法的研究進(jìn)展[J]. 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)，2018，49(4): 689-696.

Isolation and Identification of Intestinal Bacteria of the Adult

In order to clarify the feeding and digestion mechanism and nutritional physiology of, the intestinal bacteria of its adult were studied. In this paper, 10 strains of bacteria were isolated and purified from the intestinal tract of adult Eucriotettix oculatus collected in nature by traditional methods. Their morphological, physiological and biochemical indexes were systematically studied and identified by molecular biology. The results showed that all the 10 strains were positive for Gram staining and had the ability of cellulose degradation. The 8 strains numbered MYJ01, MYJ03, MYJ05, MYJ06, MYJ07, MYJ08, MYJ09 and MYJ10 were bacilli, which can metabolize glucose, maltose, sucrose and mannitol, but cannot metabolize lactose and raftolose. MYJ02 and MYJ04 strains were cocci, which could not metabolize lactose, rafebiose and cellobiose. After identification, the former was identified as Bacillus subtilis and the latter as Staphylococcus wameri.

; intestinal bacteria; isolation and identification

S433

A

1008-1151(2022)09-0054-06

2022-06-02

國家自然科學(xué)基金項目（31560604、3170249）；廣西自然科學(xué)基金項目（2020GXNSFAA159116）；廣西中青年教師能力提升項目（2019KY0637）。

辛磊（1982－），男，山東泰安人，河池學(xué)院化學(xué)與生物工程學(xué)院高級實驗師，研究方向為昆蟲腸道微生物。