王保國，曹 奕，陳倩倩，張靜波，高 紡，張 璨，施婧婧，周文婷

(1.安徽中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院，安徽 合肥 230061；2.安徽中醫(yī)藥大學，安徽 合肥 230012)

缺血性腦卒中是臨床常見的一種缺血性腦血管病，占急性腦血管病的70%左右，具有高發(fā)病率、高致殘率、高死亡率的特點，給社會帶來了嚴重的經(jīng)濟負擔[1]。缺血性腦卒中后缺血區(qū)域血管新生具有至關重要的作用，是保證缺血腦組織在短時間內重新獲取氧分的內源性保護機制，側支血管的建立可改善缺血區(qū)域微循環(huán)，增加局部腦缺血區(qū)血流灌注，從而促進機體神經(jīng)功能缺損癥狀的恢復[2]。腦梗死后缺血區(qū)域血管新生是由多種生物因子及多條信號通路共同參與的復雜過程[3]。促紅細胞生成素(erythropoietin，EPO)是一種由肝臟、腎臟分泌的酸性糖蛋白，與其相應受體結合后可使相鄰受體發(fā)生同源二聚化，導致JAK酪氨酸激酶激活，JAK是一種非受體型酪氨酸蛋白激酶，該族成員有7個同源區(qū)，其中2區(qū)為偽激酶區(qū)，因其既能催化與之相連的細胞因子受體發(fā)生酪氨酸磷酸化，從而激活多個下游信號通路，其中JAK2及其介導的STAT5通路是常見的下游信號通路之一，而此信號通路是目前已發(fā)現(xiàn)的與血管新生有關的一條分子信號通路[4]。有學者運用EPO對大腦中動脈局灶性腦缺血再灌注模型(middle cerebral artery occlusion/reperfusion model，MCAO/R)大鼠進行干預后發(fā)現(xiàn)，缺血區(qū)域存在血管新生現(xiàn)象，同時研究[5]證實了小鼠腦缺血區(qū)域血管新生現(xiàn)象與EPO介導的內皮細胞增殖分化有關。

近些年來中醫(yī)臨床對于缺血性腦卒中的治療也在逐步發(fā)展，針灸作為臨床常見中醫(yī)療法之一，其干預缺血性腦卒中機制是一種多種途徑共同參與的復雜過程，如改善缺血區(qū)微循環(huán)、促進缺血區(qū)血管新生、對抗腦缺血后炎癥反應、保護腦組織、改善神經(jīng)功能缺損、改善血液流變性[6]。中醫(yī)刺絡療法具有活血化瘀、祛瘀生新之功，結合督脈上通于腦竅的特性，取其要穴百會、大椎進行刺絡治療，可使腦竅“瘀血祛、新血生”，以達祛瘀生新之效。前期研究[7]表明，百會、大椎刺絡可調節(jié)缺血性腦卒中患者腦組織氧合血紅蛋白飽和度及血流量，改善血液流變學的各項指標，能顯著改善患者的神經(jīng)功能缺損癥狀，但其作用機制仍不清晰。因此，為進一步研究百會、大椎刺絡改善缺血性腦卒中后血管新生的作用機制，本研究以EPO介導的JAK2/STAT5信號通路調控血管新生的機制為切入點，探討百會、大椎刺絡治療缺血性腦卒中的作用機制。

1 材料

1.1 試劑 蘇木精染色液(批號 BA-4041)、伊紅染色液(醇溶性)(批號 BA-4022)：Baso；中性樹膠(批號 10004160)：國藥集團；Trizol(批號 15596018)：Life technogies；SYBR Green染料(批號 E096-01B)：novoprotein；RNA引物：上海生工生物工程股份有限公司；PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒(批號 RR047A)：TaKaRa；P-JAK2(批號 ab32101)：Abcam；P-STAT5(批號 bs-5620R)：北京博奧森生物技術有限公司；血管內皮生長因子(vascular endothetial grow factor,VEGF)(批號 SC-7269)：Santa Cruz；β-actin(批號 TA-09)、山羊抗兔IgG(批號 ZB-2301)、山羊抗小鼠IgG(批號 ZB-2305)：北京中杉生物技術有限公司；ECL超敏發(fā)光試劑盒(批號 340958)：Thermo。

1.2 儀器 生物組織自動脫水機(ZT-12M)、生物組織包埋機(YB-7LF)、生物組織烤片機(YT-7FB)：湖北亞光；徠卡切片機(RM2016)：Leica；顯微鏡(CX41)：OLYMPUS；高速冷凍離心機(JW-3021HR)：安徽嘉文儀器裝備有限公司；熒光定量PCR儀(PIKOREAL 96)：Thermo Scientific；普通PCR儀(K960)：杭州晶格科學儀器有限公司；超微量分光光度計(OD1000+)：南京五義科技有限公司；Western電泳儀(EPS300)、轉膜儀(VE-186)：上海天能科技有限公司；自動曝光儀(JS-1070P)：上海培清科技有限公司。

2 方法

2.1 實驗動物與分組 SD雄性大鼠150只，SPF級，體質量(220±20)g，日齡42～49 d，購于江蘇省邳州市東方養(yǎng)殖有限公司，生產(chǎn)許可證號：SCXK(蘇)2017-0003。實驗動物在安徽中醫(yī)藥大學實驗動物中心飼養(yǎng)，飼養(yǎng)條件為Ⅱ級，光照周期12 h/12 h，室溫為22～25 ℃，相對濕度為45%～60%，自由進食、飲水。適應性飼養(yǎng)7 d后將150只SD大鼠隨機分為正常對照組、假手術組、模型對照組、刺絡治療組、刺絡+EPO拮抗組，每組30只。

2.2 模型制備及干預方法 正常對照組不進行手術，假手術組僅分離血管而不插線栓，模型對照組、刺絡治療組、刺絡+EPO拮抗組采用改良的Zea-Longa法制備MCAO/R模型大鼠，并參考經(jīng)典的Zea-Longa法判定模型成功與否[8-10]。模型制備后刺絡治療組、刺絡+EPO拮抗組采用“百會”“大椎”穴刺絡進行干預，取穴標準參照《常用動物腧穴圖譜》[11]。將大鼠固定于鼠板上，采用特制的大鼠頭部固定器固定大鼠頭部，在保持其清醒狀態(tài)下剃毛標記，百會、大椎穴采用0.45號一次性使用無菌注射針(江蘇蘇云醫(yī)療器材有限公司，生產(chǎn)批號：20200221)點刺，使其出血，每次每穴1滴(出血量為0.05 mL)，每隔24 h進行刺絡治療1次，連續(xù)治療3周，并于取材前1 h進行最后1次刺絡治療。刺絡+EPO拮抗組在刺絡前將脂質體-siEPO2復合物按5 mg/kg劑量對大鼠進行腹腔注射，使之進入合成EPO的靶細胞，在細胞內引起針對EPO的RNA干擾效應。

2.3 取材及指標檢測

2.3.1 組織取材 采用2%戊巴比妥鈉按2 mL/kg劑量腹腔注射麻醉大鼠后，剪開腹腔，腹主動脈放血后斷頭處理大鼠，每組取一半大鼠全腦于4%多聚甲醛(預冷)中固定24 h后常規(guī)脫水、石蠟包埋制作切片(厚度為5 μm)；每組另一半大鼠取左腦頂葉組織置于凍存管中，保存于-80 ℃冰箱中。

2.3.2 蘇木精-伊紅染色觀察各組大鼠腦皮質病理形態(tài) 將各組大鼠腦皮質組織樣品在冰凍切片條件下完成均質化，進行固定、組織脫水、包埋，待蠟液出現(xiàn)凝固層后，冰浴凝固，用加熱的外科刀按組織塊位置修整蠟片，然后浸入蘇木精染液與伊紅染液染色5 min，1%鹽酸乙醇溶液分化數(shù)秒，稀碳酸鋰水溶液藍化30 s，純水沖洗后入伊紅染色液(醇溶性)染色10～30 s，95%乙醇Ⅰ、Ⅱ中各調色約10 s，無水乙醇Ⅰ、Ⅱ中各脫水2 min，苯酚-二甲苯、二甲苯Ⅰ、Ⅱ中各透明2 min，中性樹膠封片，使用顯微鏡進行拍照以觀察腦皮質組織病理狀態(tài)。

2.3.3 RT-PCR法檢測各組大鼠缺血腦皮質中EPO、VEGF的mRNA表達水平 取樣本加入適量TRIzol試劑，通過勻漿機進行勻漿處理，隨后進行分層、沉淀、清洗及溶解等步驟制得RNA備用，制備過程注意使用無酶槍頭。取制備好的總RNA進行反轉錄成cDNA，然后加入SYBR Green染料與VEGF、EPO及β-actin上下游引物混合離心(引物序列見表1)，隨后于PCR儀上進行擴增，循環(huán)完成后作溶解曲線。以采集到的熒光信號值進行相對定量分析。

表1 所選基因引物序列

2.3.4 Western Blot法檢測各組大鼠腦皮質中P-JAK2、P-STAT5、VEGF蛋白表達水平 取100 mg組織，加入600 μL RIPA裂解液(含蛋白酶抑制劑)后勻漿，提取蛋白，測量蛋白濃度，沸水浴變性后備用。將提取的總蛋白進行電泳、轉膜。5%脫脂奶粉，分別孵育P-JAK2、P-STAT5、VEGF及β-actin(1∶1 000)抗體，4 ℃過夜。洗膜，室溫孵育二抗1.5 h(山羊抗小鼠1∶20 000，山羊抗兔1∶20 000)。洗膜，均勻涂抹ECL超敏化學發(fā)光液，于成像系統(tǒng)曝光拍照，使用Image J軟件對各組蛋白的相對灰度值進行分析。

3 結果

3.1 各組大鼠腦皮質病理形態(tài)學觀察 正常對照組與假手術組神經(jīng)細胞數(shù)量多，排列整齊，形態(tài)基本正常，細胞核位于細胞中央；模型對照組及刺絡+EPO拮抗組大鼠腦組織疏松，神經(jīng)細胞排列紊亂，細胞核固縮，顏色深染。與模型對照組相比，刺絡治療組腦組織形態(tài)明顯恢復，細胞核固縮較模型組程度低，神經(jīng)細胞正常結構消失但大體形態(tài)存在。見圖1。

3.2 各組大鼠腦皮質中EPO、VEGF mRNA表達水平比較 與正常對照組比較，假手術組大鼠腦皮質中EPO、VEGF mRNA表達水平差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，模型對照組大鼠腦皮質中EPO、VEGF mRNA表達水平顯著升高(P<0.05)；與模型對照組比較，刺絡治療組大鼠腦皮質中EPO、VEGF mRNA表達水平進一步升高(P<0.05)；與刺絡治療組比較，刺絡+EPO拮抗組大鼠腦皮質中EPO、VEGF mRNA表達水平降低(P<0.05)。見圖2。

注:A.正常對照組;B.假手術組;C.模型對照組;D.刺絡治療組;E.刺絡+EPO拮抗組;箭頭所示為神經(jīng)細胞核固縮

注：與正常對照組比較，*P<0.05；與模型對照組比較，△P<0.05；與刺絡治療組比較，#P<0.05

3.3 各組大鼠腦皮質中P-JAK2、P-STAT5、VEGF蛋白表達水平比較 與正常對照組比較，假手術組大鼠腦皮質中P-JAK2、P-STAT5、VEGF蛋白表達水平差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，模型對照組大鼠腦皮質中P-JAK2、P-STAT5、VEGF蛋白表達水平顯著升高(P<0.05)；與模型對照組比較，刺絡治療組大鼠腦皮質中P-JAK2、P-STAT5、VEGF蛋白表達水平進一步升高(P<0.05)；與刺絡治療組比較，刺絡+EPO拮抗組大鼠腦皮質中P-JAK2、P-STAT5、VEGF蛋白表達水平降低(P<0.05)。見圖3。

注：A.正常對照組；B.假手術組；C.模型對照組；D.刺絡治療組；E.刺絡+EPO拮抗組；與正常對照組比較，*P<0.05；與模型對照組比較，△P<0.05；與刺絡治療組比較，# P<0.05

4 討論

缺血性腦卒中是中國常見的老年患者突發(fā)疾病，《中國腦卒中防治報告(2019)》中指出，中國缺血性腦卒中的發(fā)病率、致殘率與死亡率均處于較高水平[12]。因此，有效的預防和治療方法及其作用機制是目前臨床研究的熱點。對于缺血性腦卒中，缺血是腦卒中的始因和核心，并貫穿疾病病理演變的全過程[13]。本研究通過改良的Zea-Longa法制備MCAO/R模型大鼠作為研究對象，研究結果顯示，模型對照組大鼠腦皮質病理損傷明顯，提示MCAO/R大鼠模型復制成功。國內研究結果顯示，刺絡療法可改變微循環(huán)障礙，減輕紅細胞聚集現(xiàn)象，增加血氧含量，并減少血管滲出，從而改善腦梗死患者的血液高凝狀態(tài)[14-15]。另有研究[16]認為，刺絡療法可能是通過血流動力學調節(jié)血管內皮細胞的分泌功能，進而強化血管功能，改善局部微循環(huán)。中醫(yī)針灸理論中，百會穴為“百穴之巔”[17]，大椎穴為“諸陽之會”[18]，兩穴同為督脈要穴。兩穴合用，取其刺絡，可瀉陽之亢、祛絡之瘀，以達祛瘀生新之效。本研究顯示，通過百會、大椎刺絡治療，MCAO/R大鼠腦組織、神經(jīng)細胞等病理損傷情況得到顯著改善。

血源性EPO作為一種巨大糖蛋白，有研究[19]表明，在腦缺血后EPO因為血腦屏障的破壞而進入腦部，并與特異性受體結合，以胞吞等方式通過血腦屏障運輸?shù)竭_腦靶位起到保護受損腦組織的作用。EPO與受體結合后引起受體的構象發(fā)生改變，促使相鄰的2個受體互相靠近發(fā)生同源二聚化，導致2個JAK2 酪氨酸激酶激活，然后促紅細胞生成素受體的多個酪氨酸殘基被磷酸化，激活JAK/STAT通路，促進紅系祖細胞的增殖和分化[20]。本研究結果顯示，MCAO/R大鼠腦皮質區(qū)EPO、P-JAK2、P-STAT5的表達水平顯著上升，百會、大椎刺絡治療后，MCAO/R大鼠腦皮質區(qū)EPO、P-JAK2、P-STAT5的表達水平進一步上升。而當通過EPO抑制劑抑制EPO的表達時，大鼠腦組織中P-JAK2與P-STAT5表達水平顯著降低，提示EPO能通過介導JAK2/STAT5通路發(fā)揮作用。

VEGF是一種分泌的二聚體蛋白，參與許多生物學過程，如維持內皮細胞完整性，增加微血管密度，提高短暫性腦缺血后神經(jīng)細胞存活[21-23]。其不僅能促進血管內皮細胞的增殖，增加血管通透性，最主要的功能還是參與血管新生。研究[24-25]表明，VEGF還是JAK/STAT通路下游的關鍵因子。本研究結果顯示，百會、大椎刺絡能夠顯著提升MCAO/R大鼠腦皮質區(qū)的VEGF水平，提示局部血管新生水平增加，當通過EPO抑制劑抑制EPO表達時，大鼠腦組織中VEGF表達水平顯著降低，提示抑制EPO的表達能夠抑制MCAO/R大鼠梗死區(qū)域血管新生。

綜上所述，百會、大椎刺絡治療MCAO/R模型大鼠能夠促進腦血管新生，其機制可能與上調EPO的表達，激活JAK2/STAT5信號通路有關。