魏 玲，金 華，王億平

(安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院腎內(nèi)科，安徽 合肥 230031)

膜性腎病是一組由免疫復(fù)合物介導(dǎo)的足細(xì)胞病變，臨床表現(xiàn)為大量蛋白尿，為腎病綜合征常見(jiàn)的病理類(lèi)型之一[1]。膜性腎病傳統(tǒng)治療為激素聯(lián)合免疫抑制劑，但部分患者出現(xiàn)感染、股骨頭壞死、肝腎毒性、腫瘤等嚴(yán)重不良反應(yīng)[2]，且病情不易控制或反復(fù)，最終進(jìn)展至終末期腎病，對(duì)患者生活質(zhì)量造成嚴(yán)重影響。探索膜性腎病的發(fā)病機(jī)制和治療方法已成為臨床研究的重點(diǎn)。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，持續(xù)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是足細(xì)胞損傷的重要因素，而自噬對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的足細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用，該機(jī)制有望成為防治足細(xì)胞病變的重要途徑[3-4]。中醫(yī)藥治療膜性腎病體現(xiàn)出一定的優(yōu)勢(shì)，既往研究[5-6]證實(shí)參地顆粒在治療腎小球疾病中已取得顯著療效，并有研究[7]表明參地顆?？捎行д{(diào)節(jié)自噬的活性。大鼠尾靜脈注射陽(yáng)離子化牛血清白蛋白(cationic bovine serum albumin，C-BSA)是制作膜性腎病的經(jīng)典模型。本研究將進(jìn)一步觀(guān)察參地顆粒對(duì)C-BSA致腎病大鼠腎臟內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及足細(xì)胞自噬的干預(yù)作用，從而探討其治療膜性腎病的作用機(jī)制。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 2月齡清潔級(jí)雄性SD大鼠40只，體質(zhì)量(200±20)g，購(gòu)自安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[動(dòng)物生產(chǎn)許可號(hào)：SCXK(魯)2019-0003]，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物與試劑 參地顆粒(皖藥制字BZ20080025，由人參、熟地黃、茯苓、五味子、桑螵蛸、雞內(nèi)金、川芎組成，顆粒劑每袋10 g，含生藥34 g)：安徽省中醫(yī)院制劑中心研制。纈沙坦膠囊(國(guó)藥準(zhǔn)字H20040217，每片80 mg)：北京諾華制藥有限公司。C-BSA(批號(hào)725M036)：北京索萊寶科技有限公司。弗氏不完全佐劑(F5506，批號(hào)SLBL9742V)：Sigma公司。尿蛋白濃度測(cè)定試劑盒(批號(hào)20201204)：南京建成公司。

2 方法

2.1 模型復(fù)制及分組 采用單純隨機(jī)抽樣法將40只大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、參地顆粒組、纈沙坦組，每組10只。除正常組外，其余30只大鼠均采用尾靜脈注射C-BSA建立膜性腎病模型[8]。預(yù)免疫：取C-BSA 100 mg溶解于生理鹽水15 mL中，與等量不完全弗氏佐劑混合，充分乳化。每只大鼠取混合液1 mL，在雙側(cè)腋下、腹股溝作多點(diǎn)皮下注射，隔日1次，共3次。正式免疫：按照16 mg/kg尾靜脈注射C-BSA，每周3次，連續(xù)4周。用代謝籠中收集的大鼠24 h尿液進(jìn)行尿蛋白檢測(cè)，24 h尿蛋白(24-hour urine protein,24hUPro)量≥20 mg視為模型復(fù)制成功，<20 mg者予以剔除。正常組大鼠以相同的注射方式注射等容積生理鹽水。

2.2 給藥方法 正常組、模型組每日均給予10 mL/kg 生理鹽水灌胃；參地顆粒組每日給予4.0 g/kg參地顆粒水溶液灌胃，灌胃方法和劑量參照《中藥藥理研究方法學(xué)》相關(guān)章節(jié)[9]計(jì)算得出；纈沙坦組每日給予20 mg/kg纈沙坦膠囊混懸液灌胃。每日1次，每次3 mL，連續(xù)給藥8周。

2.3 標(biāo)本采集及檢測(cè)方法 給藥8周后，用代謝籠收集大鼠24 h尿液，采用比色法測(cè)定尿蛋白濃度(24hUPro量=尿蛋白濃度×24 h尿量)。再用2%的戊巴比妥麻醉大鼠，摘取右側(cè)腎臟放入凍存管內(nèi)，投放到液氮中，再轉(zhuǎn)入-80 ℃超低溫冰箱保存，以備Western blot檢測(cè)。

Western blot檢測(cè)方法：取100 mg腎組織加入1 mL組織裂解液及蛋白酶抑制劑制備組織勻漿，10 000 r/min離心40 min，收集上清液，提取細(xì)胞總蛋白，用BCA法測(cè)定蛋白含量。100 ℃變性10 min，每組取等量蛋白質(zhì)經(jīng)10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳后，電轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。10%脫脂奶粉-TBST溶液室溫封閉4 h后，置入加有一抗[一抗稀釋比例：葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(glucose regulated protein 78，GRP78)、人內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白(human endoplasmic reticulum stress-related protein，CHOP)為1∶500；Nephrin、Podocalyxin、微管相關(guān)蛋白輕鏈3(microtubule associated protein light chain 3，LC3)、Beclin1為1∶1 000；β-actin為1∶1 000]的10%奶粉-TBST，4 ℃冰箱孵育過(guò)夜；次日用TBST漂洗后加入HRP標(biāo)記的二抗(稀釋比例為1∶1 000)，室溫孵育2 h；TBST漂洗，加入增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑(enhanced chemiluminescence，ECL)后曝光；用Fluors凝膠成像系統(tǒng)分析蛋白條帶，蛋白的相對(duì)表達(dá)水平以目的蛋白光密度與β-actin條帶光密度的比值表示。

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠一般狀況 正常組大鼠活動(dòng)正常，反應(yīng)靈敏，毛色光亮，飲食正常，體質(zhì)量增加；模型組大鼠精神和毛發(fā)光澤度均較差，毛發(fā)脫落，攝食減少，尿量增多，大便稀，部分大鼠出現(xiàn)腹部皮下水腫。參地顆粒和纈沙坦組大鼠的精神狀態(tài)、毛發(fā)、飲食、二便等情況均有改善。模型復(fù)制期間，有10只大鼠死亡，其中2只為C-BSA溶液過(guò)量所致，1只為尾靜脈注射過(guò)程中當(dāng)場(chǎng)死亡，4只為尾靜脈注射次數(shù)過(guò)多，愈合不良，感染死亡；另外3只在模型后期死亡，為個(gè)體體質(zhì)較差不耐受所致。治療期間，有3只大鼠死亡，其中正常組死亡2只，為灌胃不當(dāng)，誤入氣管致死；模型組大鼠死亡1只，原因不明。

3.2 各組大鼠24hUpro含量比較 模型組大鼠24hUPro含量顯著高于正常組(P<0.05)。與模型組比較，參地顆粒組和纈沙坦組大鼠24hUPro含量顯著降低(P<0.05)，且參地顆粒組大鼠24hUPro含量顯著低于纈沙坦組(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠24hUpro含量比較

3.3 各組大鼠腎臟中GRP78、CHOP、Nephrin、Podocalyxin、Beclin1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白表達(dá)水平比較 與正常組比較，模型組大鼠腎組織中GRP78、CHOP、Beclin1蛋白相對(duì)表達(dá)水平和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值均顯著升高，Nephrin、Podocalyxin蛋白相對(duì)表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)。與模型組比較，參地顆粒組和纈沙坦組大鼠腎組織中GRP78、CHOP表達(dá)水平均顯著降低，而Nephrin和Podocalyxin表達(dá)水平則顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，參地顆粒組Beclin1表達(dá)水平，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值顯著升高(P<0.05)，而纈沙坦組升高不顯著(P>0.05)；且參地顆粒組GRP78、CHOP表達(dá)水平均顯著低于纈沙坦組(P<0.05)，參地顆粒組Podocalyxin、Beclin1表達(dá)水平和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值均顯著高于纈沙坦組(P<0.05)。見(jiàn)圖1、表2。

3.4 透射電子顯微鏡觀(guān)察腎小球變化 正常組大鼠的腎小球足細(xì)胞結(jié)構(gòu)清楚，未見(jiàn)足突融合，基底膜均勻且未見(jiàn)增厚，上皮下未見(jiàn)電子致密物形成；足細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)少量自噬小體形成。模型組大鼠的足突可見(jiàn)大部分融合或消失，基底膜彌漫性增厚，上皮下可見(jiàn)大塊電子致密物沉積；足細(xì)胞內(nèi)自噬小體數(shù)量較正常組增多。參地顆粒組和纈沙坦組大鼠的腎小球足突融合程度較模型組減輕，基底膜輕度增厚，伴有少量電子致密物沉積；參地顆粒組大鼠的足細(xì)胞內(nèi)自噬小體數(shù)量與模型組比較明顯增多，而纈沙坦組大鼠的足細(xì)胞內(nèi)自噬小體數(shù)量與模型組大致相當(dāng)。見(jiàn)圖2。

注：A.正常組；B.模型組；C.參地顆粒組；D.纈沙坦組

表2 各組大鼠腎臟GRP78、CHOP、Nephrin、Podocalyxin、Beclin1、LC3-Ⅱ/L3-Ⅰ蛋白表達(dá)水平比較

注：A.正常組；B.模型組；C.纈沙坦組；D.參地顆粒組；紅色箭頭示自噬小體

4 討論

膜性腎病發(fā)病的核心環(huán)節(jié)是足細(xì)胞的病變[10]。足細(xì)胞是一種位于腎小球基底膜外側(cè)的終末分化細(xì)胞，而足細(xì)胞及相鄰足細(xì)胞足突之間的裂孔膜構(gòu)成蛋白等濾過(guò)的最后一道屏障。足細(xì)胞缺乏再生能力，因此足細(xì)胞的損傷或凋亡是導(dǎo)致腎小球疾病進(jìn)展直至走向終末期腎病的主要原因。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是一種維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的細(xì)胞器，在缺血、低氧、氧化應(yīng)激等應(yīng)激狀態(tài)下，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)環(huán)境被破壞，從而導(dǎo)致未折疊蛋白的積累，稱(chēng)為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激[11]。足細(xì)胞含有豐富的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)系統(tǒng)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是膜性腎病重要的發(fā)生機(jī)制之一，適度的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是細(xì)胞應(yīng)對(duì)外界刺激的保護(hù)機(jī)制，但發(fā)生在腎組織內(nèi)持續(xù)或過(guò)強(qiáng)的應(yīng)激反應(yīng)是誘導(dǎo)足細(xì)胞損傷或凋亡的機(jī)制之一[3]。在這種病理環(huán)境中，細(xì)胞通常通過(guò)形成自噬體清除受損蛋白及細(xì)胞器來(lái)進(jìn)行損傷修復(fù)[12]。與腎臟其他固有細(xì)胞相比，足細(xì)胞可維持較高自噬活性[13]，因此,足細(xì)胞損傷與自噬能力下降密切相關(guān)。在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激條件下，當(dāng)足細(xì)胞受到損傷時(shí)會(huì)即刻啟動(dòng)自噬功能，以減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激對(duì)足細(xì)胞造成的損傷，維持足細(xì)胞正常的結(jié)構(gòu)和功能[3]。

GRP78、CHOP是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的關(guān)鍵因子。GRP78是一種位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白，參與蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的糖基化修飾，在發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時(shí)明顯增多，故可作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的標(biāo)志性蛋白[14]，其表達(dá)水平反映了細(xì)胞應(yīng)激的嚴(yán)重程度。CHOP是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號(hào)通路下游重要的促凋亡因子，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和細(xì)胞損傷中具有重要作用，是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)多種細(xì)胞產(chǎn)生調(diào)亡的關(guān)鍵信號(hào)分子[15]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡通路可以增加CHOP基因的表達(dá)水平。本研究發(fā)現(xiàn)，作為膜性腎病的經(jīng)典動(dòng)物模型，C-BSA大鼠腎組織中GRP78、CHOP蛋白表達(dá)水平上升，而足細(xì)胞標(biāo)志蛋白Nephrin、Podocalyxin表達(dá)水平降低，提示C-BSA大鼠出現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及足細(xì)胞損傷。

LC3是自噬的重要標(biāo)志，當(dāng)自噬發(fā)生時(shí)，LC3從Ⅰ型(LC3-Ⅰ)轉(zhuǎn)換為Ⅱ型(LC3-Ⅱ)[16]，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值可以作為鑒定自噬活性的指標(biāo)。Beclin1是自噬起始的重要調(diào)節(jié)因子，其表達(dá)水平可直接反映自噬活性[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，C-BSA大鼠腎組織中Beclin1表達(dá)水平和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值均顯著上升，提示自噬被激活，這可能為足細(xì)胞損傷后所誘導(dǎo)的保護(hù)性反應(yīng)；增強(qiáng)自噬活性可減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及足細(xì)胞損傷，而抑制自噬活性可促進(jìn)上述損傷效應(yīng)。

近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，中醫(yī)藥在調(diào)節(jié)免疫功能、減少免疫抑制劑所帶來(lái)的代謝紊亂和免疫力下降等方面有獨(dú)特的作用。膜性腎病是慢性腎炎的主要病理類(lèi)型，其基本病機(jī)是脾腎虧虛、精微下注[18]。參地顆粒是根據(jù)清朝新安醫(yī)學(xué)名家程林所著《圣濟(jì)總錄纂要·卷十三·虛勞門(mén)》中的人參湯化裁而成，功效為健脾益腎、固攝精微。前期研究[19]顯示，該方能夠通過(guò)降低炎癥因子釋放和抑制炎癥反應(yīng)，具有改善慢性腎炎患者的臨床癥狀，減輕蛋白尿等作用。且近期研究[19-20]已證實(shí)其對(duì)慢性腎炎患者和模型大鼠的免疫功能紊亂具有一定調(diào)節(jié)作用。血管緊張素Ⅱ受體阻滯劑是目前治療膜性腎病蛋白尿的主要藥物?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究[21]發(fā)現(xiàn)，纈沙坦是一種細(xì)胞周期性藥物，能抑制細(xì)胞增殖活性，對(duì)抗原敏感性小淋巴細(xì)胞發(fā)揮非特異性殺傷作用，能改善腎小球內(nèi)毛細(xì)血管濾孔狀況，從而減少蛋白排出，發(fā)揮腎臟保護(hù)作用。故本研究采用纈沙坦作為陽(yáng)性對(duì)照藥物。

本研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，參地顆粒具有減輕C-BSA大鼠的足細(xì)胞損傷及蛋白尿作用，并且能夠增強(qiáng)自噬活性，抑制過(guò)度的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)，進(jìn)而發(fā)揮對(duì)足細(xì)胞的保護(hù)性作用。但是其具體作用機(jī)制仍有待于進(jìn)一步研究。