王博銳，尚建麗，許丹丹，王德國

(1.河南科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，河南 洛陽 471000；2.許昌學(xué)院 食品與藥學(xué)院；河南省食品安全生物標(biāo)識快檢技術(shù)重點實驗室，河南 許昌 461000)

隨著人們消費(fèi)水平的提高，消費(fèi)者逐漸傾向于高蛋白含量、低脂肪含量肉類[1].羊肉營養(yǎng)價值豐富，蛋白質(zhì)含量高且優(yōu)質(zhì)，脂肪含量較低[2].目前，肉類摻假是常見的食品安全問題.羊肉及羊肉制品摻假的檢測技術(shù)有感官鑒別法[3]、同位素質(zhì)譜法[4]、酶聯(lián)免疫吸附法[5]、紅外光譜[6]、核酸檢測技術(shù)[7]等.其中傳統(tǒng)方法各有優(yōu)缺點.核酸檢測方法因特異性強(qiáng)、靈敏度高和結(jié)果更加準(zhǔn)確而被廣泛應(yīng)用于物種鑒定[8].因此，亟需建立一種方便、快速，能夠廣泛應(yīng)用于基層的羊肉制品檢測方法.

梯型熔解溫度等溫擴(kuò)增技術(shù)(LMTIA)是2021年WANG[9]等通過借鑒環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)(LAMP)[10]和PCR技術(shù)等開發(fā)的一種新型核酸擴(kuò)增技術(shù)，該方法適用范圍廣、反應(yīng)時間短、操作簡單，且靈敏度高、特異性強(qiáng).截至目前，還沒有使用LMTIA進(jìn)行羊肉的源基因檢測研究.因此，通過建立LMTIA檢測羊肉源性成分的方法，以期為羊肉摻假檢測提供技術(shù)支持.

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

羊肉、雞肉、鴨肉、豬肉均購于許昌喜盈門超市；狗肉、貓肉購于淘寶.

試劑：通用型Real-time LMTIA反應(yīng)預(yù)混液，德歌生物技術(shù)(山東)有限公司；DEPC處理水，生工生物工程(上海)股份有限公司；引物，通用生物系統(tǒng)(安徽)有限公司；磁珠法動物DNA提取試劑盒，天根生化科技(北京)有限公司.

儀器：Eppendorf移液槍，德國艾本德股份公司；電熱恒溫水浴鍋，常州普天儀器制造有限公司；高速冷凍離心機(jī)，德國Sigma公司；實時熒光定量PCR儀，鯤鵬基因(北京)科技有限責(zé)任公司；電子天平，上海佑科儀器儀表有限公司；立式低溫冰箱，青島海爾集團(tuán)有限公司；勻漿機(jī)，上海凈信科技；Nano Drop One超微量核酸蛋白測定儀，美國Thermo Fisher Scientific公司.

1.2 試驗方法

1.2.1 LMTIA靶序列的選擇及引物設(shè)計

根據(jù)LMTIA引物設(shè)計方法，在GenBank上查找篩選羊肉轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(internal transcribed spacer，ITS)(GenBank ID：HM437212.1)上符合梯型結(jié)構(gòu)的序列，并使用BLAST對比其序列特異性，最后以所選靶序列使用引物設(shè)計軟件Primer 3 Plus設(shè)計LMTIA引物.

1.2.2 DNA制備

羊肉的DNA提?。焊鶕?jù)磁珠法動物DNA提取試劑盒說明書操作提取羊肉的DNA.用電子天平稱取羊肉的肌肉組織30 mg(剔除脂肪和筋腱組織)，剪碎，放置于2 mL離心管中，按照試劑盒的操作方法進(jìn)行DNA的提取.最終得到模板DNA，小心吸取溶液，將其轉(zhuǎn)移至新的離心管中，振蕩混勻，并將其置于-20 ℃冰箱中保存，提取的羊肉DNA主要用于建立LMTIA反應(yīng)體系.

1.2.3 LMTIA反應(yīng)溫度優(yōu)化

以10 μL體系進(jìn)行LMTIA反應(yīng)體系的優(yōu)化，10 μL反應(yīng)體系中包括3.6 μL通用型Real-time LMTIA預(yù)混液，0.06 μL引物F和引物B，0.02 μL引物L(fēng)F和引物L(fēng)B，2 μL羊肉DNA，然后加入DEPC水補(bǔ)足10 μL.用Step One Plus PCR儀分別在55、56、57、58 ℃進(jìn)行恒溫擴(kuò)增反應(yīng).

1.2.4 LMTIA的特異性測試

用雞肉、鴨肉、豬肉、貓肉、狗肉的DNA測試LMTIA的特異性，使用TIANGEN公司的磁珠法動物組織基因組DNA提取試劑盒提取幾種肉的DNA，提取出來的DNA作為模板進(jìn)行測試LMTIA的特異性.

1.2.5 LMTIA靈敏度測試

將提取出來的羊肉DNA用DEPC水分別稀釋至10 ng/μL、1 ng/μL、100 pg/μL、10 pg/μL，用移液槍分別移取每個梯度的DNA溶液作為DNA模板加入LMTIA反應(yīng)體系中，測試LMTIA的靈敏度.

1.2.6 羊肉檢測限的確定

以雞肉為基底，制備羊肉不同質(zhì)量比例的混合模擬肉樣(0.1%、0.5%、1%、5%、10%)，用血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒(離心柱法)分別提取模擬肉樣的DNA，羊肉質(zhì)量占兩者總質(zhì)量的百分比分別為0.1%、0.5%、1%、5%、10%.首先分別稱取一定量(>5 g)的羊肉和雞肉的肌肉組織，置于5 mL的離心管中，用勻漿機(jī)將其研磨徹底，為后續(xù)稱量做準(zhǔn)備.然后分別按比例稱取0.1%(1.998 g雞肉+0.002 g羊肉)、0.5%(1.99 g雞肉+0.01 g羊肉)、1%(0.198 g雞肉+0.002 g羊肉)、5%(0.047 5 g雞肉+0.002 5 g羊肉)、10%(0.045 g雞肉+0.005 g羊肉)的混合肉.使用TIANGEN公司的血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒(離心柱法)提取DNA，即可得到不同羊肉質(zhì)量百分比的混合肉的模板DNA.將提取出來模板DNA加入LMTIA反應(yīng)體系中，進(jìn)行LMTIA反應(yīng)，測試摻假肉中羊肉的檢測限.

2 結(jié)果與討論

2.1 LMTIA引物的確定

經(jīng)過在GenBank上查找，并使用Oligo 7引物設(shè)計軟件分析篩選，確定的羊肉特有序列如圖1所示，序列的熔解溫度曲線形狀呈梯型.

圖1 靶序列的梯型熔解曲線

圖1所示的序列為靶標(biāo)，使用Primer 3 Plus引物設(shè)計軟件進(jìn)行LMTIA引物的設(shè)計，所設(shè)計的引物序列如表1所示.

表1 羊肉引物序列

2.2 LMTIA溫度的確定

用Step One Plus PCR儀分別在55、56、57、58 ℃進(jìn)行LMTIA等溫擴(kuò)增反應(yīng).如圖2所示，陰性對照均未出現(xiàn)擴(kuò)增，羊肉DNA均擴(kuò)增，結(jié)合擴(kuò)增效率選擇55 ℃為最適溫度.

圖2 LMTIA溫度優(yōu)化結(jié)果圖

2.3 LMTIA的特異性

用Step One Plus PCR儀，在55 ℃下進(jìn)行LMTIA擴(kuò)增反應(yīng)，陰性對照(DEPC水)、鴨肉、雞肉、豬肉貓肉和狗肉的DNA均未出現(xiàn)擴(kuò)增現(xiàn)象，只有陽性對照(羊肉DNA)出現(xiàn)了擴(kuò)增反應(yīng)，如圖3所示.結(jié)果表明，羊肉DNA模板的CT值與其他肉類差異明顯，說明該引物特異性較好，可用于羊肉中特異性基因的檢測.

圖3 LMTIA特異性結(jié)果圖

2.4 LMTIA的靈敏度

將梯度稀釋后的DNA稀釋液作為模板加入LMTIA反應(yīng)體系中，于55 ℃下測試LMTIA的靈敏度，結(jié)果如圖4所示：DNA濃度為100 pg/μL時，未出現(xiàn)擴(kuò)增現(xiàn)象；濃度為1和10 ng/μL時，均出現(xiàn)擴(kuò)增反應(yīng)，因此，該LMTIA體系的靈敏度為1 ng/μL.

圖4 LMTIA靈敏度結(jié)果圖

2.5 肉制品中羊肉源基因的檢測限

將1.2.6中所提取的不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的羊肉DNA加入LMTIA反應(yīng)體系中，在所優(yōu)化的最適溫度下進(jìn)行LMTIA擴(kuò)增反應(yīng)，結(jié)果如圖5所示.質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的混合肉樣在28循環(huán)處出現(xiàn)擴(kuò)增，陰性對照無擴(kuò)增.因此，該方法可檢測出混合肉樣中摻入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的羊肉源成分.

圖5 LMTIA檢測限結(jié)果圖

3 結(jié)論

研究建立了肉制品中羊肉源成分LMTIA檢測方法.該方法根據(jù)羊肉的特異性基因序列設(shè)計特異性引物，通過特異性與靈敏度測試，最終確定LMTIA方法反應(yīng)體系.在55 ℃反應(yīng)溫度下，該方法的特異性良好，最低檢測細(xì)胞核DNA濃度可達(dá)到1 ng/μL.該方法反應(yīng)時間短，不到30 min，相較于LAMP檢測技術(shù)，LMTIA可節(jié)約至少一倍的反應(yīng)時間.此外，該方法通過對模擬混合肉樣進(jìn)行檢測限測定，可檢測出羊肉質(zhì)量比在0.1%的混合肉及肉制品，在一定程度上為羊肉的摻假造假檢測提供技術(shù)支持，為其他肉類摻假檢測研究提供了借鑒，對于市場上的羊肉摻假檢測具有參考價值.