徐立國(通訊作者) 楊自兵 徐 杰 孫繼峰

( 日照市中心醫(yī)院 ， 山東 日照 276800 )

椎間盤退行性疾病(Degenerative disc disease DDD)在全球范圍內(nèi)仍然是一個普遍的折磨人的疾病，對經(jīng)濟的影響比較大，并且可導(dǎo)致生活質(zhì)量的下降。背部疼痛與神經(jīng)功能缺損與椎間盤退變相關(guān)。雖然已投入很多的努力來理解DDD的病因與腰痛的發(fā)病關(guān)系，但進展不是很明顯。在上個世紀的大部分時間，傳統(tǒng)觀點認為腰椎間盤突出癥的病因主要是由于年齡、性別、職業(yè)、吸煙和暴露于車輛的振動等。最近的研究表明，遺傳可能是椎間盤突出癥的主要責(zé)任原因。自1998年以來，對于與椎間盤退變的幾個基因的鑒定表明遺傳的影響已被證實。現(xiàn)在許多研究人員一致認為腰椎間盤突出癥似乎是類似其他的復(fù)雜疾病，其病因有環(huán)境和遺傳的影響。了解椎間盤退變性疾病的病理生理機制仍然是一個重要的研究重點，因為椎間盤發(fā)生的年齡相關(guān)性變化與腰痛是緊密聯(lián)系在一起的，并且與其它相關(guān)的神經(jīng)功能缺損亦有聯(lián)系。椎間盤為全身最大的無血管結(jié)構(gòu)，數(shù)量有限的血管滲透到關(guān)節(jié)軟骨終板的表面區(qū)域和外圍纖維環(huán)的外1/3處。但是沒有血管位于髓核細胞中[1]。它必需的營養(yǎng)包括氧氣和血糖主要是通過擴散方式到達髓核細胞，因此構(gòu)成了髓核細胞中的一個低氧狀態(tài)和環(huán)境。另外，在椎間盤退化過程中這種低氧環(huán)境可以通過軟骨終板通透性的缺失得到加強。在許多疾病過程中，炎癥為一個重要的細胞應(yīng)激伴隨著明顯的病理學(xué)并發(fā)癥，例如腦缺血、癌癥和慢性變性疾病。 TNF-α為一種研究最多的促炎性分子，可以促進軟骨聚集蛋白聚糖降解、促進分解代謝和促炎性細胞因子NGF的表達，沒有任何恢復(fù)。TNF-α為脂肪細胞因子(adipokine)與牛椎間盤極大數(shù)量的衰老細胞相聯(lián)系。因此涉及到變性的椎間盤的無能力通過自己重新植入。令人好奇的是，雖然許多研究已經(jīng)將研究焦點集中于TNF-α在椎間盤退行性病變中的作用，但Hoyland和其同事建議在退化性椎間盤中TNF-α替換IL-Iβ為基質(zhì)降解的關(guān)鍵調(diào)節(jié)子：IL-1在臨床上與慢性腰痛相關(guān)的椎間盤中呈高度表達，并且對抗IL-Iβ的治療方法可抑制基質(zhì)降解，IL-1在退變性人類椎間盤中為上調(diào)狀態(tài)，誘導(dǎo)MMPT、MMP13和ADAMTS(解聚素和金屬蛋白酶且伴有凝血酶敏感蛋白圖譜)生成，表明了正常椎間盤自我平衡的反常調(diào)節(jié)。TNF-α阻斷劑對基質(zhì)降解活性不產(chǎn)生作用，表明它在椎間盤退行性病變中的上調(diào)與基質(zhì)降解沒有關(guān)系，但是附近的神經(jīng)根刺激具有聯(lián)系，這在別的實驗中得到確認。因此TNF-α可能會促成椎間盤疼痛，在神經(jīng)內(nèi)向生長進入椎間盤退行性裂縫發(fā)生的案例中。有研究證明，CTGF對于椎間盤細胞的合成代謝具有非常重要的調(diào)節(jié)作用。有研究證明，轉(zhuǎn)化生長因子β經(jīng)由Smad3 /AP - 1通路對椎間盤髓核細胞內(nèi)的結(jié)締組織生長因子的表達水平進行調(diào)節(jié)，CTGF在退變骨化椎間盤的表達明顯高于正常組，但在椎間盤退變中CTGF的作用不是很了解[2]。研究發(fā)現(xiàn)椎間盤變性與血管生成相關(guān)，結(jié)締組織生長因子與新生血管的形成關(guān)系非常密切，研究者在對采集的21個椎間盤樣本進行的形態(tài)學(xué)觀察中發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)生退行性病變的椎間盤中，結(jié)締組織生長因子在病變椎間盤中的表達水平要高于其在正常椎間盤中的表達水平，尤其是在椎間盤樣本的新生血管形成區(qū)域，因此研究者認為結(jié)締組織生長因子在某種條件下會加速椎間盤的退行性病變的發(fā)生速度，椎間盤退行性病變的具體機制猜測可能與相關(guān)的新生血管形成具有某種聯(lián)系。本研究觀察復(fù)方丹參注射液對大鼠退行性椎間盤病變中TNF-ɑ與CTGF的表達影響。為復(fù)方丹參注射液預(yù)防和治療椎間盤退變和腰椎間盤退行性疾病的分子機理提供一個新的理論依據(jù)。報告如下。

資料與方法

1 實驗動物：健康成年家兔36只，(由濰坊醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供)，雌雄不拘，體質(zhì)量范圍在2.3-2.8kg。隨機分為觀察組、模型組、空白組，每組12只。模型組和觀察組每只家兔 L3-4, L4-5椎間盤行針刺手術(shù)，空白組不進行手術(shù)干預(yù)。

2 實驗儀器:(1)PRIM-R臺式高速低溫離心機(德國賀利氏儀器公司)；(2)H2-881S臺式水浴恒溫震蕩器(太倉市科教器材廠)；(3)FA2004電子天平(中國上海天平廠)；(4)Eppendorf移液器(德國)；(5)BH-2型生物光學(xué)顯微鏡及照相系統(tǒng)(日本OLYMPUS公司)；(6)攝像及FR-988生物顯微圖像分析系統(tǒng)(上海復(fù)日科技有限公司)；(7)Glanz微波爐(廣東順德加用電器有限公司)：(8)KQ5200超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；(9)YXQG41780-A型高壓消毒鍋中國(上海醫(yī)用核子儀器廠)；(10)PC721分光光度計(上海棱光技術(shù)有限公司)；(11)MDF-330型立式超低溫冰箱(日本Sanyo公司)；(12)YDS-10液氮生物容器(四川亞西機器廠)；(13)YL3型回轉(zhuǎn)式切片機(上海儀表廠)；(14)XY-86型振動切片機(浙江象山科學(xué)精密儀器廠)；(15)202-3型干燥箱(上海市實驗儀器廠)。

3 手術(shù)方法：首先用碘伏對作業(yè)區(qū)進行消毒，然后無菌手術(shù)洞巾覆蓋作業(yè)區(qū)，手術(shù)的前外側(cè)入路切口大約為6.0cm-8.0cm的長度(右肋緣下至髂前上棘斜切口)，手術(shù)刀逐層對皮膚的淺與深筋膜層進行分離，并進行腹外斜肌、腹內(nèi)斜肌等肌肉的分離，按照家兔肌肉纖維的方向。沿腹內(nèi)斜肌及腹橫肌之間向后分離肌肉及筋膜，分離至與豎脊肌相搭界的筋膜，縱向剪開，為腹膜前間隙。順著腹膜外間隙剝離，并將肌肉向內(nèi)側(cè)，對脊柱前的血管、組織等進行鈍性分離。鈍性分離腹膜外間隙到腰椎橫突前外側(cè)，第十二肋定位曝光揭示預(yù)穿刺椎間盤對于椎前階段的血管要進行小心仔細的分離，用直徑為1mm的注射器針頭穿刺所暴露的椎間盤，針頭的穿刺深度大約控制在5mm左右，針頭穿刺到達制定深度后時間維持5秒即可撥出穿刺針頭。模型組的每個椎間盤只常規(guī)穿刺1針。穿刺完成后對家兔進行徹底止血，用碘伏對手術(shù)視野進行2次沖洗，隨后逐層縫合關(guān)閉切口層。觀察組行椎間盤內(nèi)注射復(fù)方丹參注射液 ( 正大青春寶藥業(yè)有限公司 )，每周1次。

4 椎間盤組織樣品制備：用鋒利的刀片將中性甲醛固定液固定的組織作冠狀切片，厚3mm，流水沖洗1小時(以洗去固定液)，入上行梯度乙醇脫水(50%、70%、80%、95%、95%Ⅱ、100%、100%Ⅱ)各20-30分鐘，二甲苯透明2-3小時，浸蠟2-3小時，常規(guī)包埋。組織切片機切片，厚度為5-6μm，每隔100μm連續(xù)取3張，相鄰切片分為3套。2套分別用于免疫組織化學(xué)法測定TNF-ɑ和CTGF的表達，1套用于HE染色。TNF-ɑ和CTGF免疫組織化學(xué)染色測定按照說明書步驟嚴格執(zhí)行。

5 觀察指標：第 4、6、8、12 周時 , 分別處死各組家兔制備椎間盤切片，行組織切片HE染色和免疫組化染色，并對觀察組、模型組與空白組的椎間盤組織中的TNF-ɑ和CTGF的陽性表達分別進行定性、定位與半定量檢測，并對TNF-ɑ和CTGF的陽性表達率進行分析。

7 結(jié)果

7.1 模型組椎間盤鏡下組織學(xué)觀察：第4周鏡下觀察到外周纖維環(huán)的結(jié)構(gòu)較對照組明顯紊亂，并且軟骨終板細胞的層次分辨不清，組織結(jié)構(gòu)排列較紊亂；第6周鏡下觀察到椎間盤的髓核區(qū)域發(fā)生皺縮，外周纖維環(huán)發(fā)生破裂現(xiàn)象，第8周部分椎間盤的軟骨終板產(chǎn)生鈣化層，軟骨細胞的數(shù)量呈減少狀態(tài)。第12周鏡下觀察到椎間盤退行性變化非常明顯，部分軟骨終板的鈣化層發(fā)生增厚并產(chǎn)生骨化現(xiàn)象，軟骨細胞結(jié)構(gòu)非常紊亂，大部分的軟骨陷窩呈消失狀態(tài)，細胞核固縮現(xiàn)象明顯，并發(fā)生核碎裂、核溶解現(xiàn)象。潮線大部分增厚呈模糊狀態(tài)，與軟骨終板鄰近的髓核變性和纖維化。

7.2 免疫組化染色標記：(1)TNF-ɑ表達結(jié)果。模型組與空白組比較，TNF-ɑ表達明顯增多；觀察組與模型組比較，觀察組TNF-ɑ表達明顯減少，模型組TNF-ɑ隨時間延長而表達增多，至第12周略微降低，觀察組TNF-ɑ表達呈比較穩(wěn)定的狀態(tài)。病理學(xué)和統(tǒng)計學(xué)結(jié)果見表1。(2)CTGF表達的結(jié)果。模型組與空白組比較，CTGF表達明顯增多；觀察組與模型組比較，CTGF表達明顯減少，模型組CTGF隨時間延長而表達逐漸增多，觀察組CTGF表達呈比較穩(wěn)定的狀態(tài)。病理學(xué)和統(tǒng)計學(xué)結(jié)果見表2。

表1 椎間盤內(nèi) TNF-ɑ 的表達情況

表2 椎間盤內(nèi) CTGF的表達情況

討 論

在人類的椎間盤中發(fā)現(xiàn)大量的細胞因子，種類非常多，細胞因子的種類和數(shù)量依賴于椎間盤是否健康、退化或脫出。某些重要的研究已經(jīng)澄清炎癥因子可在椎間盤的自我平衡狀態(tài)中表達或退行性病變中表達。更為重要的是髓核細胞、纖維環(huán)細胞、天然椎間盤細胞(native IVD cells)可生成這些介質(zhì)。值得注意的是在椎間盤脫出(擠出組織、死骨)的患者案例中，椎間盤被其他類型的細胞侵入。例如腫瘤壞死因子-α在已死去的胎兒/幼兒和老年人成人的髓核細胞樣本中大量表達。然而腫瘤壞死因子-α在青年人或年輕成人的髓核細胞中很少表達。在低于25歲的年輕成人的纖維環(huán)中沒有發(fā)現(xiàn)腫瘤壞死因子-α的表達，但是在老年人的髓核細胞中顯著增多。而且鈣依賴性磷脂酶A2(calcium-dependent phospholipase A2 PLA2)為前列腺素E2(prostaglandin E2 PGE2)生成的調(diào)節(jié)因子，已經(jīng)在尸體標本和外科標本中被發(fā)現(xiàn)，并且中年患者的椎間盤的鈣依賴性磷脂酶A2的表達較高，相比于年輕的或年老的受試者，該現(xiàn)象表明鈣依賴性磷脂酶A2在維持自我動態(tài)平衡方面具有重要的生理學(xué)作用[3]。像腫瘤壞死因子-α和鈣依賴性磷脂酶A2等許多其他的炎癥性關(guān)鍵介質(zhì)都局限于非退行性人類椎間盤組織。重要的是椎間盤本來的酶的活性被研究，這表明在完整的椎間盤中，IL-1為關(guān)鍵的細胞因子，可介導(dǎo)椎間盤基質(zhì)變性，IL-1通過測量酶的活性來對抗明膠、膠原Ⅱ型和酪蛋白基質(zhì)(casein matrices)。而且在具有癥狀的退變性椎間盤中，MMP-10在mRNA和蛋白水平的表達呈增加狀態(tài)，與無癥狀的椎間盤比較，IL-1可能促進基質(zhì)的降解和傷害感受性的起始。許多已經(jīng)鑒定的因子并不是在天然的椎間盤中的自發(fā)性生成，免疫反應(yīng)性因子如IL-4、IL-6、IL-12和干擾素-γ在進行外科手術(shù)的椎間盤組織中呈中度表達，在脫出的椎間盤樣本中表達更高。而在對照組的非退行性椎間盤中卻不存在。早期研究在變性的椎間盤樣本中檢測到IL-1、細胞內(nèi)粘附因子-1(intracellular adhesion molecule-1 ICAM-1)、淋巴細胞功能相關(guān)抗原(lymphocyte function-associated antigen LFA)和成纖維細胞生長因子(fibroblast growth factor)的存在。對于某些免疫反應(yīng)性因子：IL-4、IL-6、IL-12、干擾素-γ、腫瘤壞死因子-α呈中度表達，但在脫出的退化性椎間盤中更為明顯，并且伴有實質(zhì)性的巨噬細胞浸潤。而且病理性椎間盤高度表達IL-17，表明Th17淋巴細胞在脫出椎間盤病變中涉及到，其他的研究已經(jīng)證明在脫出的椎間盤中有TNF-α、IL-Iβ、IL-6、IL-8、IL-20、PGE2和一氧化氮的高度表達。某些炎癥性關(guān)鍵介質(zhì)已經(jīng)被證明與人類的椎間盤疼痛相聯(lián)系。RANTES和IL-Iβ在疼痛性椎間盤組織中表達非常顯著，相比于無痛性椎間盤組織，與IL-6和IL-8的表達相反。在神經(jīng)生長因子(nerve growth factor NGF)中一個非常明顯的不同被觀察到，神經(jīng)細絲-68生長相關(guān)蛋白(neurofilament -68 growth-associated protein GAP)-43和P物質(zhì)在被入侵的神經(jīng)纖維、在內(nèi)和環(huán)繞在非脫出椎間盤的外層中發(fā)現(xiàn)，與椎關(guān)節(jié)強硬的椎間盤相比較[4]。另一項研究評估，在人類髓核細胞中的91種細胞因子和趨化因子相關(guān)性基因，表明髓核細胞為IL-6、CCL2、CCL7和CXCL8的來源。某些促炎性細胞因子通常在人類退變性椎間盤中表達水平增加，例如IL-Iβ和TNF-α，可能介導(dǎo)分解代謝反應(yīng)減少，蛋白聚糖的生成和加強MMP的表達[5]。

雖然某些椎間盤退行性病變與炎癥介質(zhì)有聯(lián)系，且在體外研究中已經(jīng)得到鑒定。但是在體內(nèi)研究中還未完全明確，最近的證據(jù)將重點集中于幾種分子的作用，研究的主體在大鼠、兔子和豬類動物模型中進行。在椎間盤脫出的大鼠動物模型中，髓核暴露可導(dǎo)致IL-6、TNF-α和TNF-γ水平的增加，其他細胞因子(IL-Iβ、IL-I0、IL-Iα和IL-I2)已經(jīng)在外科手術(shù)中增加，表達水平不再發(fā)生改變[6]。在另一項研究中，TNF-α在大鼠椎間盤脫出模型中的表達得到鑒定，TNF-α與根部疼痛相聯(lián)系。而且大鼠尾部環(huán)形切口的模型證明IL-Iβ在損傷后4天呈現(xiàn)短暫性高峰。這個模型以髓核體積減少為特征，環(huán)狀膠原層破裂、環(huán)形成纖維細胞組織化生成為軟骨樣細胞。然而TNF-α和IL-6的表達沒有觀察到顯著的變化。在家兔的腰椎環(huán)形切口模型中，IL-1α和TNF-α基因在全部的椎間盤中沒有觀察到發(fā)生變化，在損傷后的1周或3周內(nèi)。在相同的模型中，IL-1β、轉(zhuǎn)化生長因子和誘導(dǎo)性一氧化氮合酶在第3周后基因表達增加，但是在第6-12周表達水平下降，在24周形成第2個高峰，很可能顯示出長期的促炎性作用[7]。在家兔的椎間盤脫出模型中，TNF-α、IL-1β和MCP-1。MCP-1被描述為一個有能力的巨噬細胞化趨化因子被進行研究分析：TNF-α和IL-1β通過免疫組織化學(xué)技術(shù)在1天后被檢測到，隨后為MCP-1，損傷后3天檢測到。浸潤細胞主要為巨噬細胞在3天后也被觀察到。有趣的是，豬腰椎環(huán)形切口模型的IL-8表達水平的顯著增加，并且觀察到伴隨著IL-1表達水平的下降，在椎間盤進行椎間盤進行椎間盤切除后的第12周，同時沒有在椎間盤形態(tài)、蛋白聚糖含量以及在IL-6和TNF-α的表達水平方面觀察到差異性，未處理組和損傷組的椎間盤之間[8]。然而IL-1和IL-8具有促炎癥特性，研究者建議椎間盤切除手術(shù)有可能刺激椎間盤修復(fù)反應(yīng)的開始，鑒于IL-8作為同化類激素藥的表達水平增加，當分解代謝性的IL-1細胞因子表達水平降低時。

在椎間盤的骨生成方面，CTGF功能已經(jīng)被研究的非常廣泛。最近研究已經(jīng)說明，CTGF在多種骨骼組織中顯示出實質(zhì)性功能，其在成骨細胞、破骨細胞以及椎間盤和顱縫生長之間中的作用被研究的比較集中。軟骨：軟骨成骨的形成是一個動態(tài)過程，間質(zhì)細胞聚集分化導(dǎo)致生長平板軟骨細胞的形成，生長平板軟骨細胞在生長方面是以不同區(qū)域分布的，包括緩慢增殖儲備群體和快速增殖柱狀群體。伴隨著有絲分裂后肥大前區(qū)域和最后末端分化肥大區(qū)域。肥大軟骨細胞產(chǎn)生基質(zhì)隨后促進血管侵入和成骨細胞遷移導(dǎo)致軟骨模板與骨的更換[9]。 CTGF不在間充質(zhì)聚集區(qū)域進行表達，但是在生長板形成的早期階段可以檢測到。CTGF在增殖性軟骨細胞中以低水平表達，在肥大軟骨細胞中呈高水平表達。在生長板軟骨細胞的表達已經(jīng)確定其在CTGF促進中利用TCF/LEF功能域性通過經(jīng)典Wnt通路進行調(diào)節(jié)。這項發(fā)現(xiàn)解釋了CTGF在肥大軟骨細胞中的高水平表達的原因。在生長板包含有高濃度的穩(wěn)定性β-連接蛋白(β-catenin)。 CTGF剔除小鼠在出生高死亡率，并伴隨著嚴重性軟骨發(fā)育不全。CCN-/-軟骨細胞顯示出增殖和存活比率的降低，包括Ⅱ型膠原和聚集蛋白(主要的膠原和蛋白聚糖)[10]。

本研究表明，椎間盤內(nèi)注射復(fù)方丹參注射液能夠有效抑制炎性因子TNF-α和結(jié)締組織生長因子CTGF的表達，對椎間盤退行性病變的進展起到延緩作用。