李永春，趙美榮

（赤峰學(xué)院 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古 赤峰 024000）

臭椿（Ailanthus altissima（Mill.）Swingle），屬于苦木科臭椿屬植物，資源十分豐富，常作為土農(nóng)藥用于殺蟲(chóng)、抑菌、除草等農(nóng)業(yè)領(lǐng)域[1]。canthin-6-one是一種吲哚類(lèi)生物堿，為臭椿的主要活性成分之一[2]。研究表明，臭椿canthin-6-one對(duì)黃瓜枯萎病菌、禾谷鐮刀菌、冬瓜枯萎病菌、牡丹炭疽病菌等多種植物病原真菌具有一定的抑菌活性，其中對(duì)黃瓜枯萎病菌的抑菌作用較強(qiáng)，最小抑菌濃度（MIC）為32μg·mL-1，具有作為植物源抑菌劑的潛力[3,4]。然而，生物堿往往具有一定的毒性，如果作為抑菌劑使用，臭椿canthin-6-one是否對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育產(chǎn)生不利影響，目前這方面的研究還未見(jiàn)報(bào)道。因此，為了進(jìn)一步研究臭椿canthin-6-one在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)領(lǐng)域中的應(yīng)用潛力，探討canthin-6-one對(duì)植物生長(zhǎng)生理的影響，本研究以黃瓜為試驗(yàn)材料，分析該物質(zhì)對(duì)黃瓜種子萌發(fā)生長(zhǎng)、幼苗生理生化特性的影響，為臭椿canthin-6-one資源的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)，研制天然植物抑菌劑提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黃瓜種子（津研四號(hào)）：由天津市宏程芹菜研究所提供。

canthin-6-one為實(shí)驗(yàn)室利用臭椿莖皮為材料制備，純度98%，以0.5%的二甲基亞砜（DMSO）制成不同濃度（16、32、64μg·mL-1）的溶液，備用。試驗(yàn)所用試劑為分析純。

1.2 試驗(yàn)儀器

電子天平（BSA224S型，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；恒溫振蕩箱（DDHZ-300型，太倉(cāng)市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠）；光照培養(yǎng)箱（GZX-300BS-Ⅲ型，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司）；紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)（TU-1810PC型，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；高速冷凍離心機(jī)（3K30型，德國(guó)SIGMA公司）。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

萌發(fā)試驗(yàn)：挑選均勻一致的黃瓜種子，分別用不同濃度的canthin-6-one溶液于黑暗處浸種處理24小時(shí)，其中0.5%的DMSO溶液為溶劑對(duì)照，蒸餾水作正常對(duì)照。將浸種處理的黃瓜種子播種在鋪有雙層濾紙的培養(yǎng)皿中，每個(gè)處理播種50粒種子，蒸餾水保持濕潤(rùn)，每個(gè)處理設(shè)三個(gè)重復(fù)，置于人工氣候箱中（溫度28℃/23℃、光/暗周期為14h/10h的）培養(yǎng)。7天后統(tǒng)計(jì)發(fā)芽種子數(shù)，測(cè)量種苗主根長(zhǎng)、株高及鮮重。

生理試驗(yàn)：將不同浸種處理后的黃瓜種子，恒溫催芽，播種到營(yíng)養(yǎng)缽（直徑15cm，蛭石和培養(yǎng)土的比例1：1）中，每個(gè)處理設(shè)三個(gè)重復(fù)，置于人工氣候箱（溫度28℃/23℃、光/暗周期為14h/10h）進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)，待黃瓜幼苗長(zhǎng)至5～8葉時(shí)，隨機(jī)采取葉片，測(cè)其生理生化指標(biāo)。

1.4 測(cè)定指標(biāo)

1.4.1 萌發(fā)生長(zhǎng)測(cè)定

以胚根與種子等長(zhǎng)作為發(fā)芽標(biāo)準(zhǔn)，每天觀察不同處理黃瓜種子的萌發(fā)情況，第7天統(tǒng)計(jì)發(fā)芽率，發(fā)芽率=供試種子發(fā)芽數(shù)/供試種子數(shù)×100%[5]。發(fā)芽結(jié)束后，隨機(jī)各取20株幼苗，吸干表面水分，測(cè)其主根長(zhǎng)度、株高、幼苗鮮重。

1.4.2 生理指標(biāo)測(cè)定

可溶性糖、丙二醛（MDA）、過(guò)氧化氫（H2O2）、蛋白質(zhì)含量測(cè)定以及過(guò)氧化物酶（POD）、超氧化物化歧化酶（SOD）、抗壞血酸過(guò)氧化物酶（APX）、過(guò)氧化氫酶（CAT）活性分別按照試劑盒（南京建成）步驟進(jìn)行測(cè)定。脯氨酸、葉綠素含量根據(jù)張志良等[6]的方法測(cè)定。維生素C含量的測(cè)定采用紫外分光光度法[7]。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

采用Microsoft Excel 2019進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。使用DPS15.10軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，差異顯著性分析采用Duncan新復(fù)極差法和one-way ANOVA法在P＜0.05水平下進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 canthin-6-one對(duì)黃瓜種子萌發(fā)生長(zhǎng)的影響

由canthin-6-one對(duì)黃瓜萌發(fā)及幼苗生長(zhǎng)的試驗(yàn)結(jié)果（表1）可見(jiàn)，DMSO（0.5%）溶劑處理對(duì)黃瓜種子萌發(fā)生長(zhǎng)無(wú)顯著影響。與對(duì)照相比，不同濃度的canthin-6-one浸種處理對(duì)黃瓜種子的萌發(fā)率、株高、鮮重的影響不顯著。主根長(zhǎng)在64μg·mL-1的canthin-6-one處理后有所減小，與蒸餾水處理相比降低了11%，其它濃度的canthin-6-one對(duì)主根長(zhǎng)無(wú)顯著影響（P＜0.05）。

表1 canthin-6-one對(duì)黃瓜萌發(fā)及幼苗生長(zhǎng)的影響

2.2 canthin-6-one對(duì)黃瓜幼苗代謝物質(zhì)含量的影響

2.2.1 canthin-6-one對(duì)黃瓜幼苗可溶性糖、可溶性蛋白、脯氨酸以及葉綠素含量的影響

通過(guò)測(cè)定黃瓜幼苗可溶性糖、可溶性蛋白、脯氨酸以及葉綠素含量分析臭椿canthin-6-one對(duì)植物生理狀況的影響，見(jiàn)圖1。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照相比，32μg·mL-1的canthin-6-one處理后，可溶性糖、脯氨酸、可溶性蛋白含量顯著增加，分別增加了17.9%、102.1%和12.8%，葉綠素含量在不同濃度藥劑處理下無(wú)顯著差異（P＜0.05）。

圖1 canthin-6-one處理后黃瓜幼苗可溶性糖（A）、脯氨酸（B）、可溶性蛋白（C）以及葉綠素（D）含量

2.2.2 canthin-6-one對(duì)黃瓜幼苗MDA、H2O2含量的影響

如圖2所示，MDA和H2O2含量在canthin-6-one處理與蒸餾水處理之間無(wú)顯著差異（P＜0.05）。MDA和H2O2常表示植物受氧化脅迫的程度，這一結(jié)果表明，在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，canthin-6-one處理不會(huì)對(duì)黃瓜幼苗造成氧化傷害。

圖2 canthin-6-one處理后黃瓜幼苗丙二醛（A）、過(guò)氧化氫（B）含量

2.2.3 canthin-6-one對(duì)黃瓜幼苗維生素C、類(lèi)胡蘿卜素含量的影響

由圖3A可知，canthin-6-one對(duì)黃瓜幼苗維生素C含量有明顯的促進(jìn)作用。經(jīng)濃度為32μg·mL-1的canthin-6-one處理后，維生素C含量比蒸餾水對(duì)照提高了50.6%，在64μg·mL-1時(shí)維生素C含量提高了約1.14倍，差異顯著（P＜0.05）。在濃度為0-32μg·mL-1內(nèi)，canthin-6-one沒(méi)有明顯改變類(lèi)胡蘿卜素含量，當(dāng)濃度為64μg·mL-1時(shí)，canthin-6-one處理使類(lèi)胡蘿卜素含量降低，比蒸餾水處理水平降低了31.9%（圖3B）。

圖3 canthin-6-one處理后黃瓜幼苗維生素C（A）、類(lèi)胡蘿卜素（B）的含量

2.3 canthin-6-one對(duì)黃瓜幼苗保護(hù)酶活性的影響

canthin-6-one對(duì)黃瓜幼苗四種抗氧化酶活性的影響結(jié)果見(jiàn)圖4。由圖可見(jiàn)，在不同濃度canthin-6-one處理?xiàng)l件后，SOD、POD活性無(wú)顯著變化（P＜0.05）（圖4A，圖4D）。，canthin-6-one處理后，CAT活性與溶劑對(duì)照相比無(wú)顯著差異（圖4B）。APX活性在canthin-6-one處理后增加顯著，在濃度為32μg·mL-1和64μg·mL-1時(shí)分別提高了32.2%和26.7%（圖4C）。

圖4 canthin-6-one處理后黃瓜幼苗SOD（A）、CAT（B）、APX（C）、POD（D）的活性

3 討論

canthin-6-one生物堿是臭椿的主要次生代謝物質(zhì)之一，具有多種生物活性，目前其研究多集中在抗腫瘤、抗病毒等醫(yī)藥領(lǐng)域，而canthin-6-one優(yōu)良的抗植物病原真菌性能，使其在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域中的應(yīng)用具有較大潛力，因此，評(píng)估臭椿canthin-6-one對(duì)黃瓜植株生長(zhǎng)生理的影響，對(duì)于天然植物抑菌劑的開(kāi)發(fā)是十分必要的。

3.1 canthin-6-one維持黃瓜幼苗正常的生長(zhǎng)生理

在植物生活史中，種子萌發(fā)及種苗生長(zhǎng)是其重要階段。研究表明，植物生物堿對(duì)種子萌發(fā)及種苗生長(zhǎng)有促進(jìn)或抑制作用。例如，曼陀羅生物堿可以促進(jìn)綠豆種子萌發(fā)、種苗生長(zhǎng)[8]；高濃度曼陀羅生物堿抑制玉米幼苗生長(zhǎng)[9]；劉建新等[10]研究發(fā)現(xiàn)多裂駱駝蓬中水溶性生物堿抑制小麥種子萌發(fā)，而脂溶性生物堿沒(méi)有抑制作用，但都促進(jìn)小麥幼苗生長(zhǎng)。本研究結(jié)果表明，canthin-6-one除在濃度為64μg·mL-1時(shí)抑制主根長(zhǎng)外，對(duì)黃瓜種子萌發(fā)、種苗株高、鮮重均無(wú)顯著影響（表1）。這一結(jié)果與前人研究不完全一致，可能不同的植物對(duì)生物堿的響應(yīng)也不相同。

農(nóng)藥等外源物質(zhì)施用，通常會(huì)引起植物的生理響應(yīng)。可溶性糖、可溶性蛋白以及脯氨酸是植物逆境保護(hù)性物質(zhì)，可以調(diào)節(jié)植物逆境生理。MDA是膜脂過(guò)氧化產(chǎn)物，H2O2是一種活性氧，這兩種物質(zhì)常表示植物受到氧化脅迫傷害的程度[11]。本研究中0-64μg·mL-1的canthin-6-one處理對(duì)MDA和H2O2含量沒(méi)有顯著影響（圖2），32μg·mL-1的canthin-6-one處理可促進(jìn)保護(hù)性物質(zhì)含量顯著增加（圖1）。因此，臭椿canthin-6-one在作為抑菌劑使用時(shí)，不會(huì)對(duì)植物造成氧化傷害，可以維持黃瓜幼苗正常的生理特性。

3.2 canthin-6-one維持和保護(hù)黃瓜幼苗抗氧化系統(tǒng)

植物抗氧化系統(tǒng)是維持植物生長(zhǎng)的必要條件。SOD、POD、APX和CAT是植物主要抗氧化酶類(lèi)，維生素C、谷胱甘肽等是主要的抗氧化劑，這些物質(zhì)參與活性氧的清除或防止活性氧產(chǎn)生，保護(hù)植物體免受氧化脅迫傷害，提高植物抗逆性[11]。本研究中canthin-6-one可以促進(jìn)黃瓜幼苗抗氧化劑維生素C含量的提高，促進(jìn)APX和CAT活性，對(duì)SOD、POD活性沒(méi)有表現(xiàn)出明顯的影響（圖3、圖4），這些結(jié)果說(shuō)明canthin-6-one浸種處理可以維持和保護(hù)黃瓜幼苗的抗氧化系統(tǒng)。

4 結(jié)論

綜上所述，在試驗(yàn)濃度（0-64μg·mL-1）范圍內(nèi)，臭椿canthin-6-one浸種處理可維持黃瓜種子萌發(fā)及幼苗正常的生長(zhǎng)過(guò)程，提高生理調(diào)節(jié)物質(zhì)含量，維持和保護(hù)抗氧化酶活性。因此，臭椿canthin-6-one浸種處理對(duì)黃瓜植株生長(zhǎng)是安全有利的，且具有一定的生理調(diào)節(jié)活性。本研究初步評(píng)估了臭椿canthin-6-one浸種處理對(duì)植株生長(zhǎng)的影響，然而，臭椿canthin-6-one在植物生長(zhǎng)中的作用是多方面的，還需做進(jìn)一步研究。