徐偉 黃晨 謝美明 廖冬發(fā)

西部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院戰(zhàn)創(chuàng)傷救治中心，四川 成都 610083

骨組織是一種不斷經(jīng)歷重塑的動(dòng)態(tài)組織，由成骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨形成和破骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨吸收兩個(gè)過程維持其動(dòng)態(tài)平衡[1]。炎癥反應(yīng)與骨穩(wěn)態(tài)維持密切相關(guān)[2]。急性炎癥疾病如膿毒血癥和全身多發(fā)創(chuàng)傷可導(dǎo)致骨穩(wěn)態(tài)失衡。在骨髓炎、化膿性關(guān)節(jié)炎和植入物感染等骨科感染患者中，骨吸收增加和骨形成減少是其重要的病理特征[3]。

脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)是革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁的主要成分。LPS誘導(dǎo)的炎癥模型廣泛應(yīng)用于抗炎、免疫、損傷等研究[4]。LPS誘導(dǎo)的炎癥模型可以較好的模擬細(xì)菌感染過程，其可通過激活破骨細(xì)胞中的Toll樣受體4 (Toll-like receptor 4, TLR4)，導(dǎo)致骨吸收增加，引起骨量丟失和骨破壞[5]。然而，在炎癥性疾病中，LPS對(duì)骨形成功能的影響存在矛盾和爭(zhēng)議，同時(shí)，LPS對(duì)骨形成的影響機(jī)制尚未完全闡明[6-9]。

骨髓去除模型(bone marrow ablation, BMX)是一種損傷誘導(dǎo)的骨髓腔內(nèi)膜內(nèi)成骨的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停瑥V泛用于研究相關(guān)生長(zhǎng)因子或基因在體內(nèi)骨形成和骨重建中的作用。BMX后的骨形成過程包括血腫形成、間充質(zhì)細(xì)胞遷移增殖、成骨分化、形成新的骨組織，然后破骨細(xì)胞重吸收骨組織和骨髓重建過程，一般在BMX術(shù)后1周骨形成達(dá)到高峰[10]。本研究中，我們通過建立小鼠脛骨BMX模型，觀察LPS對(duì)BMX后早期骨形成的影響并初步探討其機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

2月齡雄性SPF級(jí) C57BL/6J小鼠，飼養(yǎng)于西部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，重量20～25 g。所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的喂養(yǎng)和取材操作嚴(yán)格按照西部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理委員會(huì)許可進(jìn)行(批準(zhǔn)號(hào)：2021EC2-07)，符合動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的倫理要求。

1.2 小鼠脛骨BMX模型制作

參照既往文獻(xiàn)報(bào)道的方法制作小鼠脛骨BMX模型[10]。簡(jiǎn)而言之，用戊巴比妥鈉(100 mg/kg，腹腔注射)麻醉小鼠后，取左側(cè)膝關(guān)節(jié)備皮并用碘伏消毒。在膝關(guān)節(jié)前內(nèi)側(cè)做5 mm皮膚切口，切開髕腱內(nèi)側(cè)的關(guān)節(jié)囊，使髕骨脫位，暴露脛骨平臺(tái)。采用25號(hào)注射針頭輕輕扭轉(zhuǎn)，在脛骨平臺(tái)鉆孔，進(jìn)入骨髓腔。采用27號(hào)針頭注射器沿著圓孔插入髓腔后，向脛骨髓腔內(nèi)快速注射3 mL溫鹽水，去除骨髓。將髕骨復(fù)位后，用7-0可吸收縫線縫合關(guān)節(jié)囊。皮膚用5-0尼龍線縫合。麻醉蘇醒后，所有小鼠都可以自由活動(dòng)，并在手術(shù)后自由進(jìn)食和飲水。

1.3 LPS腹腔注射

BMX術(shù)后24 h，實(shí)驗(yàn)組小鼠給予一次劑量的LPS(0111：B4，Sigma)腹腔注射(10 mg/kg),對(duì)照組給予等量PBS腹腔注射。分別于BMX術(shù)后4 d或者7 d取材。

1.4 骨組織蘇木精-伊紅(HE)染色和形態(tài)計(jì)量

骨組織HE染色參照文獻(xiàn)[11]方法進(jìn)行。簡(jiǎn)而言之，脛骨取材后去除肌肉組織，將標(biāo)本固定于4 %多聚甲醛中24 h，然后采用15 %乙二胺四乙酸進(jìn)行脫鈣2周。脫鈣后采用標(biāo)準(zhǔn)流程進(jìn)行石蠟包埋和切片，然后采用蘇木精-伊紅(HE)染色液(碧云天)進(jìn)行染色。

組織形態(tài)計(jì)量學(xué)分析采用OsteoMeasure(OsteoMetrics, USA)軟件進(jìn)行，計(jì)量參數(shù)按照文獻(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)[12]進(jìn)行分析。脛骨中新生骨組織骨體積與組織體積比(bone volume/tissue volume, BV/TV)測(cè)量的感興趣區(qū)在脛骨近端生長(zhǎng)板下方1.5 mm處測(cè)量，長(zhǎng)度為1.5 mm。

1.5 免疫組織化學(xué)(Immunohistochemistry, IHC)

參照文獻(xiàn)[10]方法對(duì)脛骨脫鈣切片進(jìn)行IHC染色。本研究使用的特異性抗體如下: b-catenin抗體(1∶200稀釋，CST, 9562 S)，Runx2抗體(1∶100稀釋，Santa Cruz, sc-12488)和PCNA抗體(1∶100稀釋，Santa Cruz, sc-25280)。

1.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-PCR)

采用Trizol試劑(Invitrogen)從小鼠脛骨干組織區(qū)域提取總RNA。采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(大連寶生物)合成 cDNA，根據(jù)試劑操作手冊(cè)采用定量 PCR 試劑盒進(jìn)行定量PCR。所有樣本重復(fù)3次，采用管家基因(cyclophilinA)為內(nèi)部參照。定量PCR所用引物如表1。

表1 定量PCR引物Table 1 RT-PCR primers in 5’-3’ direction

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用 SPSS 25.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)數(shù)資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，所有數(shù)據(jù)經(jīng)正態(tài)性檢驗(yàn)均符合正態(tài)分布，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，采用Levene方差等同性檢驗(yàn)檢驗(yàn)方差是否具有齊性，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 成功建立BMX模型

為了排除脛骨干骺端原有骨小梁的干擾，我們選取脛骨干部位進(jìn)行分析。HE染色顯示，未手術(shù)組(Control)脛骨干骨髓腔中充滿核藍(lán)染的間充質(zhì)細(xì)胞，幾乎無骨組織(圖1)。BMX術(shù)后1周，HE染色顯示，脛骨干骨髓腔中大量新生骨組織占滿骨髓腔(圖1)。上述結(jié)果顯示BMX誘導(dǎo)的骨形成模型建立成功。

注：BMX后1周，HE染色顯示脛骨干骨髓腔中充滿新生骨組織，而未手術(shù)對(duì)照組脛骨干骨髓腔中只有少量骨小梁存在，BMX模型建立成功。bar=100 μm。圖1 建立小鼠脛骨BMX模型Fig.1 Establishment of BMX model in mice tibia

2.2 LPS抑制BMX后早期骨形成

為了研究LPS對(duì)BMX骨形成的影響，我們對(duì)BMX后1周小鼠脛骨取材，進(jìn)行組織病理分析。HE染色顯示，LPS處理后脛骨骨髓腔中新生骨組織較對(duì)照組減少(圖2A)。進(jìn)一步采用組織形態(tài)計(jì)量顯示，LPS處理后新生骨組織BV/TV較對(duì)照組顯著減少(圖2B)。上述結(jié)果提示LPS抑制BMX后骨形成。

注：A：BMX后1周脛骨干組織病理切片后HE染色，bar=100μm；B：組織形態(tài)計(jì)量新生骨組織BV/TV。與PBS對(duì)照組相比，**P<0.01。圖2 LPS抑制BMX后早期骨形成Fig.2 LPS inhibits bone formation after BMX

2.3 LPS抑制BMX后間充質(zhì)細(xì)胞增殖和成骨分化

為了研究LPS引起B(yǎng)MX后骨形成減少的機(jī)制，我們首先檢測(cè)了BMX后第4天骨髓腔中間充質(zhì)細(xì)胞增殖情況。增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen, PCNA)IHC結(jié)果顯示，LPS處理后PCNA陽性細(xì)胞較對(duì)照組明顯減少(圖3A)，提示LPS抑制BMX后間充質(zhì)細(xì)胞增殖。

進(jìn)一步我們研究了LPS對(duì)BMX后1周成骨分化功能的影響。IHC結(jié)果顯示，BMX后1周，LPS處理小鼠新生骨組織中Runx2陽性細(xì)胞較對(duì)照小鼠明顯減少(圖3B)。RT-PCR結(jié)果顯示，BMX后1周，LPS處理小鼠新生骨組織中成骨分化相關(guān)標(biāo)志基因Runx2、Op、Oc和AlpmRNA水平較對(duì)照小鼠明顯降低(圖3C)。上述結(jié)果提示，LPS處理可以抑制成骨分化。

注：A：BMX后4 d，PCNA IHC染色和PCNA陽性細(xì)胞定量；B：BMX后1周，Runx2 IHC染色和Runx2陽性細(xì)胞定量；C：BMX后1周，RT-PCR檢測(cè)成骨分化相關(guān)標(biāo)志基因Runx2、Op、Oc和Alp mRNA水平。與PBS對(duì)照組相比，*P<0.05，***P<0.001，bar=50 μm。圖3 LPS抑制BMX后間充質(zhì)細(xì)胞增殖和成骨分化Fig.3 LPS inhibits mesenchymal cells proliferation and osteogenic differentiation after BMX

2.4 LPS 抑制BMX后經(jīng)典的Wnt/β-catenin信號(hào)

β-catenin IHC結(jié)果顯示，BMX后1周，LPS處理小鼠新生骨組織中β-catenin陽性細(xì)胞數(shù)量較對(duì)照小鼠明顯減少。RT-PCR結(jié)果顯示，LPS處理小鼠新生骨組織中Wnt/β-catenin信號(hào)通路下游靶基因Lef1、Tcf1、CD44 和CyclinD1 mRNA水平較對(duì)照小鼠明顯降低。上述結(jié)果提示，LPS 抑制了經(jīng)典的Wnt/β-catenin信號(hào)。

注：A：BMX后1周，β-catenin IHC染色和β-catenin陽性細(xì)胞定量。B：BMX后1周，RT-PCR檢測(cè)新生骨組織中Wnt/β-catenin信號(hào)通路下游靶基因Lef1、Tcf1、CD 44 和Cyclin D1 mRNA水平。與PBS對(duì)照組相比，*P<0.05，***P<0.001，bar=50 μm。圖4 LPS 抑制BMX后經(jīng)典的Wnt/β-catenin信號(hào)Fig.4 LPS inhibits canonical Wnt/β-catenin signaling after BMX

3 討論

慢性炎癥性疾病如化膿性關(guān)節(jié)炎、骨髓炎和骨科內(nèi)固定物感染中的過度骨吸收和骨破壞部分是由細(xì)菌感染誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)引起[13]。LPS是革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁的一種可以誘導(dǎo)炎癥的糖脂質(zhì)成分，已被證實(shí)是革蘭氏陰性菌誘導(dǎo)骨破壞的介質(zhì)[14]。一般情況下，LPS及LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞因子可直接增強(qiáng)破骨細(xì)胞功能，增加骨吸收。然而，LPS對(duì)成骨細(xì)胞功能的影響以及在骨形成中的作用存在爭(zhēng)議[5]。本研究中，我們采用BMX模型，研究LPS對(duì)骨形成的作用。我們發(fā)現(xiàn)LPS可以在體內(nèi)抑制間充質(zhì)細(xì)胞增殖，抑制成骨分化，導(dǎo)致BMX后早期骨形成減少。進(jìn)一步機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，LPS抑制了BMX后經(jīng)典的Wnt/β-catenin信號(hào)通路。

骨髓炎的特征性病理表現(xiàn)是骨重建失衡和骨量丟失，但同時(shí)也存在著過度的新骨形成[14]。有研究發(fā)現(xiàn)細(xì)菌感染引起的炎癥反應(yīng)通常會(huì)導(dǎo)致骨溶解和骨愈合受損，但矛盾的是，它也有促進(jìn)骨形成的作用[15]。在人類內(nèi)毒素血癥患者中血清骨形成生物標(biāo)志物I型前膠原N末端前肽水平升高[8]。Xing等[9]在體外研究中發(fā)現(xiàn)，LPS可以促進(jìn)人牙周膜干細(xì)胞的成骨分化。而Nogueira等[16]研究發(fā)現(xiàn)LPS處理不影響大鼠脛骨鉆孔模型中的骨形成和骨愈合過程。在體外實(shí)驗(yàn)中，低濃度LPS可以促進(jìn)人BMSCs增殖和成骨分化，而高濃度LPS則抑制其增殖和成骨分化[17]。在成骨前體細(xì)胞(MC3T3-E1)中，LPS通過JNK通路誘導(dǎo)其凋亡，抑制其成骨分化[18]。LPS可以抑制BMP-2誘導(dǎo)的BMSCs成骨分化[19]。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，Yang等[5]研究發(fā)現(xiàn)，LPS可以時(shí)間依賴性的抑制小鼠骨形成。腹腔內(nèi)或局部注射LPS都會(huì)導(dǎo)致骨形成減少，導(dǎo)致骨愈合延遲[6-7]。造成上述結(jié)果不一致的可能原因與各研究中使用的材料和研究手段等不同有關(guān)。BMX是目前比較公認(rèn)的可以在短時(shí)間內(nèi)研究骨形成和骨重塑相關(guān)過程的模型。我們的研究發(fā)現(xiàn)LPS可以抑制BMX后早期的成骨分化和骨形成。

Wnt/β-catenin信號(hào)通路在成骨分化和骨形成中發(fā)揮著重要的作用[20]。近期有研究報(bào)道LPS與Wnt/β-catenin信號(hào)通路相互串話進(jìn)而調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞功能。Guo等[18]研究發(fā)現(xiàn)，LPS處理前成骨細(xì)胞系后，可以降低Wnt3a和β-catenin蛋白水平，升高GSK3β蛋白水平，進(jìn)而抑制其成骨分化。而Xing等[9]研究發(fā)現(xiàn)，LPS可以通過激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路，促進(jìn)人牙周膜干細(xì)胞的成骨分化。在本研究中我們發(fā)現(xiàn)，BMX后1周，LPS處理小鼠新生骨組織中β-catenin陽性細(xì)胞較對(duì)照小鼠降低，Wnt/β-catenin信號(hào)通路下游相關(guān)靶基因表達(dá)降低。我們的結(jié)果提示LPS可能通過負(fù)向調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin信號(hào)通路，從而抑制成骨分化，引起B(yǎng)MX后早期骨形成減少。

本研究中，我們僅探討了LPS對(duì)BMX后早期(BMX后1周)骨形成的影響，LPS對(duì)BMX后晚期(BMX后2周和3周)骨形成的影響需進(jìn)一步研究。同時(shí)，既往研究[17]報(bào)道，體外實(shí)驗(yàn)中LPS對(duì)BMSC的成骨分化和增殖影響具有劑量依賴性，LPS在體內(nèi)對(duì)BMX后骨形成的影響是否具有劑量依賴性，需要進(jìn)一步研究。本研究結(jié)果僅基于單個(gè)劑量和單個(gè)時(shí)間點(diǎn)，對(duì)相關(guān)機(jī)制的研究還不夠深入，后續(xù)我們將采用不同劑量的LPS處理小鼠，觀察不同劑量LPS對(duì)BMX后骨形成的影響。

綜上所述，我們的研究結(jié)果顯示，LPS處理可以抑制間充質(zhì)細(xì)胞的增殖和成骨分化，導(dǎo)致BMX后早期骨形成減少，Wnt/β-catenin信號(hào)通路可能參與LPS抑制BMX后早期骨形成的過程。上述研究結(jié)果將深化我們對(duì)LPS及其與Wnt/β-catenin信號(hào)相互串話在骨形成中的作用，為尋找骨感染后促進(jìn)骨再生的生物治療提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。