杜雪純,李保勝,喬樹偉,歐燕珍,李 珍,孟維艷

（吉林大學(xué)口腔醫(yī)院口腔種植科，吉林 長(zhǎng)春 130021）

牙周炎是導(dǎo)致我國(guó)成年人牙齒缺失的首要疾病，目前認(rèn)為牙周微生物與免疫系統(tǒng)相互影響所引發(fā)的炎癥反應(yīng)是牙周組織破壞的原因之一，過(guò)度的炎癥反應(yīng)會(huì)加重牙周軟硬組織的損害［1-2］。在牙周炎發(fā)病過(guò)程中，巨噬細(xì)胞對(duì)牙周組織穩(wěn)態(tài)起重要的調(diào) 節(jié) 作 用。研 究［3-4］表 明：牙 齦 卟 啉 單 胞 菌（Porphyromonas gingivalis，P.g）作為牙周炎的主要致病菌之一，其表面的脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）可以促使巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)榇傺仔途奘杉?xì)胞，分泌出多種炎性細(xì)胞因子進(jìn)而使炎癥反應(yīng)加重。

鐵死亡是一種依賴于鐵離子的程序性細(xì)胞死亡方式，區(qū)別于細(xì)胞凋亡、焦亡和壞死等程序性細(xì)胞死亡方式，鐵死亡的發(fā)生由脂質(zhì)過(guò)氧化引起，從而導(dǎo)致活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平升高及鐵離子積累［5-6］。研究［7-8］顯示：鐵死亡的發(fā)生與多種炎癥性疾病相關(guān)，如急性肺損傷和膿毒癥等，而其在牙周炎的發(fā)病機(jī)制中研究較少。已有研究［9-10］顯示：牙周炎水平的丁酸可以誘導(dǎo)牙周韌帶成纖維細(xì)胞發(fā)生鐵死亡，且牙周組織中鐵死亡相關(guān)基因表達(dá)增加。有學(xué)者［11-12］發(fā)現(xiàn)：在大腸桿菌LPS誘導(dǎo)下，心肌細(xì)胞及人支氣管上皮細(xì)胞發(fā)生鐵死亡，而P.g-LPS是否可以引發(fā)巨噬細(xì)胞發(fā)生鐵死亡尚不清楚。因此本研究初步探究P.g-LPS對(duì)巨噬細(xì)胞中鐵死亡相關(guān)因子表達(dá)水平的影響，為牙周炎發(fā)病機(jī)制及治療的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、主要試劑和儀器小鼠巨噬細(xì)胞系RAW264.7細(xì)胞（上海中科院細(xì)胞所）。DMEM培養(yǎng)基、PBS、1%青-鏈霉素和胰蛋白酶（美國(guó)Hyclone公司），P.g-LPS（美國(guó)InvivoGen公司），總RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和實(shí)時(shí)熒光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR）試劑盒（上海翌圣公司），ROS檢測(cè)試劑盒、丙二醛（malondialdehyde，MDA）檢測(cè)試劑盒、RIPA裂解液、SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液（5×）和BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司），亞鐵離子熒光探針（Ferrousion fluorescent probe，F(xiàn)eRhoNox-1）（上海懋康生物技術(shù)有限公司），DAPI（北京索萊寶公司），β-actin抗體（66009-1-Ig）（美國(guó)ProteinTech公司），長(zhǎng)鏈酯酰輔酶A合成酶4（long-chain acyl-CoA synthetase 4，ACSL4）抗體（ab155282）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶4（glutathione peroxidase 4，GPX4）抗 體（ab125066）和 轉(zhuǎn) 鐵 蛋 白 受 體1（transferrin receptor 1，TfR1） 抗 體（ab214039）（美國(guó)Abcam公司），ECL化學(xué)發(fā)光液（蘇州新賽美 公 司）。RT-qPCR擴(kuò) 增 儀MX3005P（美 國(guó)Agilent公司），酶標(biāo)儀（美國(guó)Bio-TEK公司），Vanox熒光倒置顯微鏡（日本Olympus公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組將RAW264．7細(xì)胞接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，密度為每孔2×105個(gè)細(xì)胞，37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，對(duì)照組細(xì)胞不做任何處理，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞加入10 mg·L－1P.g-LPS分別處理6、12和24 h。

1.3 RT-qPCR法檢測(cè)2組RAW264.7細(xì)胞中ACSL4、GPX4和TfR1 mRNA表達(dá)水平達(dá)到測(cè)定時(shí)間后棄去孔板內(nèi)各孔培養(yǎng)液，加入PBS緩沖液沖洗3次后，再將1 mL TRIzol加入各孔中反應(yīng)5 min，提取總RNA，將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA，反應(yīng)條件為25℃、5 min，42℃、30 min，85℃、5 min。反應(yīng)結(jié)束后采用RT-qPCR法檢測(cè)2組RAW264.7細(xì)胞中ACSL4、GPX4和TfR1 mRNA表達(dá)水平，擴(kuò)增反應(yīng)條件為95℃、5 min，95℃、10 s，60℃、30 s，循環(huán)數(shù)為40次。引物序列：ACSL4，上游引物5′-CCCTGAAGGATTTGAGATTCACA-3′，下 游引 物5′-CCTTAGGTCGGCCAGTAGAAC-3′；GPX4，上 游 引 物5′-AAGGACCTGCCCCACTATTTC-3′，下 游 引 物5′-ACGCTGGATTTTCGGGTCT-3′；TfR1，上 游 引 物5′-GGTTCGTACAGCAGCAGAGGTG-3′，下 游 引 物5′-TCCACGAGCAGAATACAGCCATTG-3′；β-actin，上游引 物5′-GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTA-3′，下 游 引 物5′-GACTCATCGTACTCCTGCTTGCTG-3′。采用2－ΔΔCt法計(jì)算2組細(xì)胞中目的基因mRNA表達(dá)水平。

1.42′，7′-二氯熒光素二乙酸酯（2′，7′-dichlorodihydrofluorescein diacetate，DCFH-DA）熒光探針?lè)z測(cè)2組RAW264.7細(xì)胞中ROS水平棄去孔板內(nèi)各孔培養(yǎng)液并用PBS緩沖液沖洗，加入10 mg·L－1DAPI室溫染色10 min后PBS緩沖液沖洗3次，再加入10 μmol·L－1DCFH-DA 37℃避光孵育40 min，PBS緩沖液洗去DCFH-DA后，熒光顯微鏡下觀察，并采用Image J軟件分析熒光強(qiáng)度，以DCFH-DA熒光強(qiáng)度與DAPI熒光強(qiáng)度比值代表ROS水平。

1.5 硫代巴比妥酸（thiobarbituric acid，TBA）法檢測(cè)2組RAW264.7細(xì)胞中MDA水平棄去孔板內(nèi)各孔培養(yǎng)液并用冷PBS緩沖液沖洗，每孔加入200 μL裂解液，充分裂解后10 000 g～12 000 g離心10 min，取上清，采用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定樣品的蛋白濃度，100 μL樣品加入200 μL MDA檢測(cè)工作液混勻，100℃水浴15 min，冷卻至室溫后1 000 g離心10 min。從上清中取200 μL加入至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，于532 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度（A）值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算MDA水平（mmol·g－1）。

1.6 FeRhonox-1法檢測(cè)2組RAW264.7細(xì)胞中亞鐵離子（Fe2+）水平棄去孔板內(nèi)各孔培養(yǎng)液并用冷PBS緩沖液沖洗2次，加入5 μmol·L－1FeRhonox-1后，37℃避光孵育40 min，PBS緩沖液沖洗2次，室溫避光放置30 min，熒光顯微鏡下觀察，并采用Image J軟件分析熒光強(qiáng)度，以熒光強(qiáng)度代表Fe2+水平，熒光強(qiáng)度單位為AU。

1.7 Western blotting法檢測(cè)2組RAW264.7細(xì)胞中ACSL4、GPX4和TfR1蛋白表達(dá)水平棄去孔板內(nèi)各孔培養(yǎng)液并用冷PBS緩沖液沖洗，加入RIPA裂解液充分裂解后收集于離心管中，并采用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白濃度。蛋白變性后進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，并與ACSL4、GPX4、TfR1和β-actin一抗（1∶1 000）4℃孵育過(guò)夜。次日，洗膜3次后，室溫?fù)u床孵育二抗1 h（1∶1 000）?；瘜W(xué)發(fā)光顯影后采用Image J軟件分析蛋白條帶灰度值，以β-actin為內(nèi)參，計(jì)算目的蛋白表達(dá)水平。目的蛋白表達(dá)水平=目的蛋白條帶灰度值/β-actin蛋白條帶灰度值。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用GraghPad Prism 8.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。各組細(xì)胞中ACSL4、GPX4和TfR1 mRNA及蛋白表達(dá)水平，各組細(xì)胞中ROS、MDA及Fe2+水平均符合正態(tài)分布，以±s表示，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，2組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組RAW264.7細(xì)胞中ACSL4、GPX4和TfR1 mRNA表達(dá)水平與對(duì)照組比較，處理12和24 h后，實(shí)驗(yàn)組RAW264.7細(xì)胞中ACSL4 mRNA表達(dá)水平明顯升高（P＜0.05）；處理6、12和24 h后，GPX4 mRNA表達(dá)水平均降低（P＜0.05）；處 理12和24 h后，ACSL4和TfR1 mRNA表 達(dá)水平升高（P＜0.05）；與6 h時(shí)比較，12和24 h時(shí)實(shí)驗(yàn)組RAW264.7細(xì)胞中ACSL4和TfR1 mRNA表達(dá)水平明顯升高（P＜0.05），GPX4 mRNA表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05）；與12 h時(shí)比較，24 h時(shí)實(shí)驗(yàn)組RAW264.7細(xì) 胞中ACSL4和TfR1 mRNA表達(dá)水平明顯升高（P＜0.05），GPX4 mRNA表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05）。見表1。

表1 各 組RAW264.7細(xì) 胞 中ACSL4、GPX4和TfR1 mRNA表達(dá)水平Tab.1 Expression levels of ACSL4,GPX4 and TfR1 mRNA in RAW264.7 cells in various groups (n=3，±s）

表1 各 組RAW264.7細(xì) 胞 中ACSL4、GPX4和TfR1 mRNA表達(dá)水平Tab.1 Expression levels of ACSL4,GPX4 and TfR1 mRNA in RAW264.7 cells in various groups (n=3，±s）

*P＜0.05 compared with control group；△P＜0.05 compared with 6 h group；#P＜0.05 compared with 12 h group.

Group Control Experimental 6 h 12 h 24 h ACSL4 1.00±0.13 1.37±0.12 1.87±0.20*△2.31±0.12*△#GPX4 1.00±0.03 0.54±0.04*0.37±0.02*△0.30±0.02*△#TfR1 1.00±0.04 1.12±0.06 1.62±0.08*△1.96±0.18*△#

2.2 各組RAW264.7細(xì)胞中ROS水平與對(duì)照組比較，處理6、12和24 h后實(shí)驗(yàn)組RAW264.7細(xì)胞中ROS水平呈時(shí)間依賴性升高（P＜0.05）。見圖1和2。

圖1 DCFH-DA熒光探針?lè)z測(cè)各組RAW264.7細(xì)胞中ROS水平（×40）Fig.1 Levels of ROS in RAW264.7 cells in various groups detected by DCFH-DA fluorescence probe method（×40）

2.3 各組RAW264.7細(xì)胞中MDA水平與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組RAW264.7細(xì)胞中MDA水平呈時(shí)間依賴性升高（P＜0.05），并在24 h達(dá)到高峰。見表2。

2.4 各組RAW264.7細(xì)胞內(nèi)Fe2+水平與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組RAW264.7細(xì)胞中Fe2+水平升高（P＜0.05），且在24 h達(dá)到高峰。見表2和圖3。

圖3 各組RAW264.7細(xì)胞中Fe2+熒光染色情況(Bar=50 μm)Fig.3 Fluorescence staining of Fe2+in RAW264.7 cells in various groups(Bar=50 μm)

表2 各組RAW264.7細(xì)胞中MDA和Fe2+水平Tab.2 Levels of MDA and Fe2+in RAW264.7 cells in various groups (n=3，±s）

表2 各組RAW264.7細(xì)胞中MDA和Fe2+水平Tab.2 Levels of MDA and Fe2+in RAW264.7 cells in various groups (n=3，±s）

*P＜0.05 compared with control group；△P＜0.05 compared with 6 h group；#P＜0.05 compared with 12 h group.

Group Control Experimental 6 h 12 h 24 h Level of MDA[mB/(mmol·g－1)]59.12±13.18 308.60±31.33*462.20±50.31*△697.50±30.16*△#Fluorescence intensity of Fe2+(AU)9.07±1.17 19.08±1.80*49.96±4.56*△68.34±4.61*△#

2.5 各組RAW264.7細(xì)胞中ACSL4、GPX4和TfR1蛋白表達(dá)水平與對(duì)照組比較，6 h時(shí)實(shí)驗(yàn)組RAW264.7細(xì)胞中ACSL4、GPX4和TfR1蛋白表達(dá)水平差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），12和24 h時(shí)實(shí)驗(yàn)組RAW264.7細(xì)胞中ACSL4和TfR1蛋白表達(dá)水平升高，且24 h時(shí)升高更明顯（P＜0.05），GPX4蛋白表達(dá)水平降低，且24 h時(shí)降低更明顯（P＜0.05）。見圖4。

圖4 各組RAW264.7細(xì)胞中ACSL4、GPX4和TfR1蛋白表達(dá)電泳圖（A）和直條圖（B-D）Fig.4 Electrophoregram(A)and histogram(B-D)of expressions of ACSL4,GPX4 and TfR1 proteins in RAW264.7 cells in various groups

3 討 論

牙周炎是口腔常見疾病，其發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明。有學(xué)者［13］認(rèn)為宿主對(duì)病原菌的持續(xù)免疫炎癥反應(yīng)是引起牙周組織損害的重要原因。而巨噬細(xì)胞是對(duì)抗牙周組織中相關(guān)致病菌的第一道防線，其在發(fā)揮吞噬病原菌功能的同時(shí)，過(guò)度活化也會(huì)加速牙周組織的破壞［14］。因此探討以巨噬細(xì)胞為中心的炎癥調(diào)節(jié)機(jī)制，對(duì)明確牙周炎發(fā)病機(jī)制及其治療策略具有重要意義。

鐵死亡被認(rèn)為是炎癥性疾病調(diào)控的新靶點(diǎn)［15］。研究［16-17］表明：巨噬細(xì)胞鐵死亡已作為動(dòng)脈粥樣硬化的藥理學(xué)靶點(diǎn)，且抑制巨噬細(xì)胞鐵死亡可以減輕急性腎損傷。目前，細(xì)胞焦亡、細(xì)胞凋亡和壞死性凋亡等程序性細(xì)胞死亡已被證實(shí)與牙周炎有關(guān)［18-19］，而鐵死亡在牙周炎的發(fā)病機(jī)制中研究較少。已有研究［9-10］表明：牙周炎水平的丁酸可激活核受體共激活因子4（nuclear receptor coactivator 4，NCOA4）介導(dǎo)的鐵蛋白吞噬，從而上調(diào)ROS水平，最終導(dǎo)致牙周韌帶組織中成纖維細(xì)胞發(fā)生鐵死亡，且慢性牙周炎患者牙齦組織中鐵死亡相關(guān)因子TfR1表達(dá)水平升高。

圖2 各組RAW264.7細(xì)胞中ROS水平Fig.2 Levels of ROS in RAW264.7 cells in various groups

鐵死亡是一種鐵依賴性的ROS過(guò)量積累導(dǎo)致的細(xì)胞死亡過(guò)程，其主要發(fā)生途徑包括脂質(zhì)代謝途徑、胱氨酸/谷氨酸反向轉(zhuǎn)運(yùn)體（System Xc－）/GPX4途徑及鐵代謝途徑［20-22］。脂質(zhì)代謝途徑中ACSL4是鐵死亡所必需的物質(zhì)，通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞膜磷脂的過(guò)氧化反應(yīng)來(lái)驅(qū)動(dòng)鐵死亡［23-24］；System Xc－/GPX4途徑中GPX4為關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑，可將脂質(zhì)過(guò)氧化物還原為脂質(zhì)醇從而阻止ROS的合成，進(jìn)而抑制鐵死亡［25］。鐵代謝途徑中TfR1是鐵死亡標(biāo)志物之一，其在細(xì)胞表面上的累積導(dǎo)致對(duì)鐵攝取需求的增加，最終鐵運(yùn)輸系統(tǒng)失衡，細(xì)胞發(fā)生鐵死亡［26］。

本研究根據(jù)參考文獻(xiàn)［27］采用10 mg·L－1P.g-LPS處 理RAW264.7細(xì) 胞6、12和24 h后，與對(duì)照組比較，12和24 h實(shí)驗(yàn)組RAW264.7細(xì)胞中ACSL4及TfR1 mRNA和蛋白表達(dá)水平升高，GPX4 mRNA和蛋白表達(dá)水平降低，與鐵死亡3條發(fā)生途徑中相關(guān)物質(zhì)的表達(dá)變化一致。研究［28-29］表明：在生理穩(wěn)態(tài)平衡下，ROS有助于調(diào)節(jié)多種細(xì)胞功能，然而過(guò)量的ROS可導(dǎo)致DNA和蛋白質(zhì)的損傷變性及脂質(zhì)的過(guò)氧化，而脂質(zhì)過(guò)氧化是牙周炎氧化損傷的關(guān)鍵機(jī)制。鐵死亡發(fā)生過(guò)程中，通過(guò)3條發(fā)生途徑使細(xì)胞內(nèi)ROS累積，細(xì)胞中多不飽和脂肪酸被過(guò)量的ROS氧化，導(dǎo)致最終產(chǎn)物MDA的生成，而MDA通常作為氧化應(yīng)激的指標(biāo)已被廣泛研究［30-32］。本研究分別檢測(cè)了10 mg·L－1P.g-LPS處 理6、12和24 h后RAW264．7細(xì) 胞 中ROS和MDA水平，結(jié)果表明：細(xì)胞中ROS和MDA水平呈時(shí)間依賴性升高，與ACSL4、GPX4和TfR1調(diào)控鐵死亡發(fā)生的特點(diǎn)相符合。WANG等［17］認(rèn)為：細(xì)胞中高水平鐵的存在是細(xì)胞執(zhí)行鐵死亡的必要條件。鐵離子代謝途徑中，F(xiàn)e3+經(jīng)TfR1轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入細(xì)胞后轉(zhuǎn)變?yōu)镕e2+，F(xiàn)e2+易與H2O2發(fā)生芬頓反應(yīng)，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生鐵死亡［33］。本研究檢測(cè)了10 mg·L－1P.g-LPS處 理6、12和24 h后RAW264.7細(xì)胞中Fe2+水平，結(jié)果表明：與對(duì)照組比較，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，F(xiàn)e2+水平升高，與TfR1的變化特點(diǎn)一致。

P.g-LPS是牙周炎發(fā)病機(jī)制中的主要毒力因子，具有有效激活宿主炎癥和先天防御反應(yīng)的能力［34］。Toll樣 受 體4（Toll-like receptor，TLR4）是模式識(shí)別分子（pattern recognition molecule，PRR）家族的成員之一，在炎癥信號(hào)通路通過(guò)識(shí)別病原體并調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)來(lái)發(fā)揮重要作用［35］。已有研究［36-38］表明：LPS是TLR4的唯一潛在配體，P.g-LPS僅通過(guò)TLR4發(fā)揮作用，同時(shí)可以上調(diào)巨噬細(xì)胞中TLR4表達(dá)。因此可以認(rèn)為P.g-LPS通過(guò)TLR4來(lái)觸發(fā)巨噬細(xì)胞發(fā)生炎癥。

綜上所述，P.g-LPS誘導(dǎo)下RAW264.7細(xì)胞中鐵死亡相關(guān)因子ACSL4和TfR1表達(dá)升高，GPX4表達(dá)降低，證明P.g-LPS對(duì)巨噬細(xì)胞中鐵死亡相關(guān)因子表達(dá)有影響。本研究結(jié)果為如何靶向控制細(xì)胞發(fā)生鐵死亡提供了更明確的思路，為牙周炎發(fā)病機(jī)制及今后牙周炎治療提供了參考依據(jù)。