袁育珺,楊秀玲,胡志堅(jiān),張素梅

（1.九江學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，江西 九江 332000；2.九江學(xué)院附屬醫(yī)院院感科，江西 九江 332000；3.安徽省/省部共建教育部重要遺傳病基因資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥 230032）

肺癌位于全球癌癥死亡排名中的首位［1］。我國(guó)作為世界上最大的發(fā)展中國(guó)家，隨著人口老齡化、工業(yè)化和城市化進(jìn)程加快，肺癌在我國(guó)也是威脅人群健康最主要的惡性腫瘤［2］。非小細(xì)胞肺癌（nonsmall cell lung cancer，NSCLC）在臨床肺癌診療中約占80%～85%［3］。外科手術(shù)、化療、放療、靶向治療和免疫治療是目前主要的治療手段，在臨床上廣泛應(yīng)用，也取得了良好的療效，但NSCLC患者5年生存率仍為10%～15%［4］。此外，耐藥的快速進(jìn)展影響NSCLC患者化療和靶向治療的有效性，亦影響NSCLC患者的生存率。因此，發(fā)現(xiàn)新的藥物和靶點(diǎn)有助于開發(fā)新的NSCLC治療方案。中藥是藥用化合物的天然寶庫，同時(shí)也是發(fā)現(xiàn)新型活性化合物的重要途徑。靛玉紅是大青葉和板藍(lán)根等中藥的有效成分，具有抗菌消炎、抗增殖、抗腫瘤和抗肥胖等生物學(xué)效應(yīng)［5-7］。中藥靛玉紅衍生物［靛玉紅-3′-（2，3二羥丙基）-肟（E804），簡(jiǎn)稱E804］作為中藥靛玉紅的有效成分，已被證實(shí)具有抗炎和抗信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）信號(hào)通路等作 用［8］，然而E804對(duì)NSCLC A549細(xì)胞的抑制作用尚未完全闡明。本研究采用E804處理A549細(xì)胞，探討其促細(xì)胞凋亡作用，并闡明其可能的分子機(jī)制，為E804抗NSCLC的臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、主要試劑和儀器NSCLC A549細(xì)胞由中國(guó)科技大學(xué)生命科學(xué)院友情提供，九江學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科保存。DMEM、青霉素、鏈霉素、小牛血清和胰酶均購自北京索萊寶科技有限公司；E804購自武漢遠(yuǎn)成生物科技有限公司，分裝后于－20℃冰箱保存；流式細(xì)胞術(shù)試劑盒購自合肥碧云天生物試劑公司；B細(xì)胞淋巴瘤2（B-cell lymphoma 2，Bcl-2）、Bcl-2相 關(guān)X蛋 白（Bcl-2related X protein，Bax）、裂解的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3（cleaved cysteinyl aspartate specific proteinase-3，cleaved caspase-3）、裂解的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶9（cleaved cysteinyl aspartate specific proteinase-9，cleaved caspase-9）和β-actin及Janus激酶1（Janus kinase 1，JAK1）/STAT3通路相關(guān)蛋白［JAK1、磷酸化JAK1（phosphorylated JAK1，p-JAK1）、STAT3和 磷 酸 化STAT3（phosphorylated STAT3，p-STAT3）］均購自美國(guó)Santa Cruz公司，分裝后于－70℃冰箱保存；MTT試劑盒購自美國(guó)Sigma公司；二抗（抗鼠和抗兔）均購自美國(guó)Pierce公司。倒置顯微鏡購自日本Nikon公司，電泳槽、電泳儀和蛋白凝膠成像儀購自美國(guó)Bio-Rad公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)液氮中取出A549細(xì)胞，37℃水浴迅速解凍，接種于含10%小牛血清、100 U·mL－1青霉素和100 mg·L－1鏈霉素DMEM培養(yǎng)基中，于37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。次日換液1次，待細(xì)胞平鋪約80%，胰酶消化傳代。繼續(xù)傳代培養(yǎng)，待細(xì)胞形態(tài)穩(wěn)定，－20℃冰箱凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 MTT法檢測(cè)各組細(xì)胞增殖率取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)A549細(xì)胞，胰酶消化備用。細(xì)胞分為對(duì)照組（0 μmol·L－1E804）和 經(jīng)2.5、5.0、10.0、20.0及50.0 μmol·L－1E804處 理 的E804組，分 別 處 理72 h；細(xì) 胞 分 為2.5、5.0和10.0 μmol·L－1E804組，細(xì)胞分別處理24、48和72 h。MTT實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格按照參考文獻(xiàn)［9］方法進(jìn)行，于570 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)吸光度（A）值，計(jì)算細(xì)胞增殖率。細(xì)胞增殖率=（對(duì)照孔A值－實(shí)驗(yàn)孔A值）/對(duì)照孔A值×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞遷移能力取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期A549細(xì)胞，超凈工作臺(tái)內(nèi)制備細(xì)胞懸液，細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，稀釋為6 000 mL－1密度接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。次日換液繼續(xù)培養(yǎng)。倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞覆蓋和生長(zhǎng)情況，當(dāng)細(xì)胞覆蓋率約達(dá)80%時(shí)，棄上清，PBS緩沖液洗滌2次，高壓滅菌劃痕筆輕輕于各孔 正 中 央 劃“十”字，PBS緩沖液洗滌3次。各組細(xì)胞于處理0 h做好標(biāo)記并拍照，處理72 h后拍照，觀察細(xì)胞遷移距離。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 軟瓊脂克隆實(shí)驗(yàn)觀察各組細(xì)胞克隆形成情況取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期A549細(xì)胞，超凈工作臺(tái)內(nèi)胰酶消化，制成細(xì)胞懸液，細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，以6 000 mL－1密度接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。處理72 h后電子顯微鏡下觀察各組A549細(xì)胞形態(tài)表現(xiàn)及分化情況并拍照。各組細(xì)胞經(jīng)E804處理72 h后，棄上清，超凈工作臺(tái)內(nèi)制備細(xì)胞懸液，細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，以7 000 mL－1密度接種于預(yù)先鋪好0.6%軟瓊脂6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。將培養(yǎng)板置于濕盒（防干燥），存放于細(xì)胞室CO2培養(yǎng)箱中保存2周，倒置顯微鏡下觀察各組細(xì)胞克隆形成情況。棄上清，甲醇固定，MTT染液染色，電子顯微鏡下觀察克隆形成數(shù)和形態(tài)表現(xiàn)。

1.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期A549細(xì)胞，超凈工作臺(tái)內(nèi)制備細(xì)胞懸液，細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，以6 000 mL－1密度接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。次日換液，E804處理72 h，制備細(xì)胞懸液計(jì)數(shù)為1×106mL－1。AnnexinⅤ-FITC和PI雙染按說明書操作，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率。細(xì)胞凋亡率=凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

1.7 Western blotting檢測(cè)各組細(xì)胞中目的蛋白表達(dá)水平按參考文獻(xiàn)［9］方法提取各組細(xì)胞總蛋白，BCA測(cè)定各組細(xì)胞蛋白濃度，加熱變性后，取約25 μg相應(yīng)蛋白樣品于10%SDS-PAGE凝膠進(jìn)行電泳，將相應(yīng)的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫下封閉1 h，加入Bcl-2（1∶800）、Bax（1∶1 100）、cleaved caspase-3（1∶1 500）、cleaved caspase-9（1∶1 000）、β-actin（1∶2 000）、JAK1（1∶800）、p-JAK1（1∶1 500）、STAT3（1∶1 000）和p-STAT3（1∶1 200），置于4℃過夜；次日加入相應(yīng)二抗（1∶1 500）室溫下孵育2 h，PBS緩沖液洗膜3次，暗室內(nèi)ECL顯影并拍照，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。采用Image Pro 4.5軟件分析蛋白條帶灰度值，計(jì)算目的蛋白表達(dá)水平。目的蛋白表達(dá)水平=目的蛋白條帶灰度值/內(nèi)參蛋白條帶灰度值。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用GraphPad Prism 8統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。各組細(xì)胞增殖率、遷移距離、克隆形成數(shù)、細(xì)胞凋亡率、凋亡相關(guān)蛋白和JAK1/STAT3信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平均符合正態(tài)分布，以±s表示，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組細(xì)胞增殖率E804作用72 h后MTT檢測(cè) 結(jié) 果 顯 示：與 對(duì) 照 組 比 較，2.5、5.0和10.0 μmol·L－1E804組 細(xì) 胞 增 殖 率 降 低（P＜0.01）；與10.0 μmol·L－1E804組 比 較，20.0和50.0 μmol·L－1E804組細(xì)胞增殖率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。E804作用24、48和72 h后，與E804作 用0 h比 較，2.5、5.0和10.0 μmol·L－1E804組細(xì)胞增殖率均隨著時(shí)間延長(zhǎng)逐漸降低（P＜0.05或P＜0.01）。見圖1。

圖1 MTT法檢測(cè)各組細(xì)胞增殖率Fig.1 Proliferation rates of A549 cells in various groups detected by MTT assay

2.2 各組細(xì)胞遷移距離細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：與對(duì)照組比較，2.5、5.0和10.0 μmol·L－1E804組A549細(xì)胞遷移距離縮小（P＜0.05或P＜0.01）。見圖2和3。

圖2 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞遷移能力Fig.2 Migration abilities of cells in various groups detected by cell scratch assay

2.3 各組細(xì)胞克隆形成情況倒置顯微鏡和電子顯微鏡下觀察各組細(xì)胞克隆形成情況顯示：對(duì)照組A549細(xì)胞抱團(tuán)緊密、形態(tài)穩(wěn)定，且生長(zhǎng)迅速。與對(duì) 照 組 比 較，2.5、5.0和10.0 μmol·L－1E804組細(xì)胞抱團(tuán)不明顯，胞體形態(tài)多變，呈現(xiàn)分散和遲緩生長(zhǎng)的現(xiàn)象，且克隆形成數(shù)減少（P＜0.05）。見圖4～6。

圖4 倒置顯微鏡下觀察各組細(xì)胞克隆形成情況Fig.4 Clone formation of cells in various groups observed under inverted microscope

2.4 各組細(xì)胞凋亡率流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示：與對(duì)照組比較，2.5、5.0和10.0 μmol·L－1E804組細(xì)胞凋亡率升高（P＜0.05或P＜0.01）。見圖7和8。

圖7 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率Fig.7 Apoptotic rates of cells in various groups detected by flow cytometry

2.5 各組細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平Western blotting檢測(cè)結(jié)果顯示：與對(duì)照組比較，2.5、5.0和10.0 μmol·L－1E804組細(xì)胞中Bcl-2蛋白 表 達(dá) 水 平 降 低（P＜0.05或P＜0.01），Bax、cleaved caspase-3和cleaved caspase-9蛋白表達(dá)水平升高（P＜0.05或P＜0.01）。見圖9。

圖9 各組細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)電泳圖（A）和直條圖（B）Fig.9 Electrophoregram(A)and histogram(B)of expressions of apoptosis-related proteins in various groups

2.6 各組細(xì)胞中JAK1/STAT3信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平Western blotting檢測(cè)結(jié)果顯示：與對(duì)照組 比 較，2.5、5.0和10.0 μ mol·L－1E804組p-JAK1和p-STAT3蛋白表達(dá)水平降低（P＜0.05或P＜0.01），而JAK1和STAT3蛋白表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖10。

圖3 各組細(xì)胞遷移距離Fig.3 Migration distance of cells in various groups

圖10 各組細(xì)胞中JAK1/STAT3信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)電泳圖（A）和直條圖（B）Fig.10 Electrophoregram(A)and histogram(B)of expressions of JAK1/STAT3 signaling pathway-associated proteins in various groups

3 討 論

圖5 電子顯微鏡下觀察各組細(xì)胞克隆形態(tài)表現(xiàn)(MTT,×400)Fig.5 Morphology of clones of cells in various groups observed under electron microscope(MTT,×400)

惡性腫瘤對(duì)人類健康和生命構(gòu)成巨大威脅，是世界上造成死亡的主要原因之一。肺癌是常見的惡性腫瘤，晚期肺癌的5年生存率約為15%［1］。近年來，隨著分子生物學(xué)和臨床治療方案的不斷融合和創(chuàng)新，研究和發(fā)現(xiàn)新的分子靶向藥物已成為臨床治療的熱點(diǎn)，靶向治療已用于多種腫瘤的一線治療［10-11］。JAK1/STAT3信 號(hào) 通 路 作 為 連 接 炎 癥 和腫瘤的關(guān)鍵信號(hào)通路，直接影響細(xì)胞增殖、分化和凋亡等過程，其在包括NSCLC在內(nèi)的多種惡性腫瘤中被激活和過表達(dá)，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞異常增殖和惡性轉(zhuǎn)化［12-13］。研究［14］證實(shí)：E804作為中藥靛玉紅的有效成分，對(duì)JAK1/STAT3信號(hào)通路有抑制作用，可誘導(dǎo)人腫瘤細(xì)胞凋亡，但是否對(duì)肺癌細(xì)胞有相似作用尚不明確。

圖6 各組細(xì)胞克隆形成數(shù)Fig.6 Number of clone formation of cells in various groups

腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)失控和去分化是腫瘤惡性行為的生物學(xué)基礎(chǔ)［15］，因此探究腫瘤細(xì)胞的增殖和分化特性在腫瘤防治中具有重要意義。研究［16-17］表明：由植物中提取的天然藥物可能具有抗腫瘤細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)分化作用，如中藥旱蓮草提取物蟛蜞菊內(nèi)酯和中藥藤黃提取物藤黃酸等。本研究結(jié)果顯示：不同濃度E804可以明顯抑制NSCLC A549細(xì)胞增殖和遷移，表明E804對(duì)NSCLC A549細(xì)胞具有一定的殺傷作用，同時(shí)也提示E804對(duì)NSCLC發(fā)展可能有一定的抑制作用。本研究結(jié)果顯示：不同濃度E804處理A549細(xì)胞，呈現(xiàn)抱團(tuán)不明顯、分散生長(zhǎng)現(xiàn)象；胞體形態(tài)多變，呈現(xiàn)遲緩生長(zhǎng)的現(xiàn)象；同時(shí)可見漂浮著一些凋亡細(xì)胞，提示細(xì)胞出現(xiàn)增殖抑制和分化傾向。本研究中軟瓊脂克隆實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：E804具有抑制A549細(xì)胞克隆形成能力，進(jìn)一步證實(shí)其對(duì)A549細(xì)胞增殖的抑制作用。

圖8 各組細(xì)胞凋亡率Fig.8 Apoptotic rates of cells in various groups

細(xì)胞凋亡是機(jī)體維持自身穩(wěn)定的基本生理機(jī)制，是由部分基因產(chǎn)物及細(xì)胞因子參與的有序細(xì)胞自我消亡形式［18］。目前已被證實(shí)的線粒體凋亡通路是由外因或者藥物造成細(xì)胞損傷，Bcl-2家族促凋亡成員被激活，同時(shí)抗凋亡成員被抑制，凋亡基因作用于線粒體誘導(dǎo)其釋放大量細(xì)胞色素C，活化caspase-9前體，進(jìn)而激活caspase-3，引發(fā)caspases級(jí)聯(lián)反應(yīng)，從而誘發(fā)細(xì)胞凋亡［19］。本研究結(jié)果顯示：E804可以促進(jìn)NSCLC A549細(xì)胞凋亡，并且2.5、5.0和10.0 μmol·L－1E804組 細(xì) 胞 凋 亡 率 升高，E804可引起促凋亡基因Bax、cleaved caspase-3和cleaved caspase-9表達(dá)上調(diào)，抗凋亡基因Bcl-2表達(dá)下調(diào)，提示E804可能通過線粒體凋亡通路誘導(dǎo)NSCLC系A(chǔ)549細(xì) 胞 凋 亡。

STAT3是連接炎癥和腫瘤的關(guān)鍵信號(hào)通路分子［20］。腫瘤微環(huán)境中，炎癥細(xì)胞分泌炎癥因子白細(xì)胞介素6（interleukin-6，IL-6），高表達(dá)的炎癥因子IL-6通過與GP130/IL-6受體復(fù)合物相應(yīng)位點(diǎn)結(jié)合，激活I(lǐng)L-6/JAK1/STAT3信號(hào)通路，調(diào)控腫瘤 細(xì) 胞 增 殖、分 化 和 凋 亡［20-21］；研 究［12，22］顯 示：在肺癌等多種腫瘤組織和腫瘤細(xì)胞中JAK1/STAT3信號(hào)通路異常激活，并參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移過程。本研究中Western blotting法檢測(cè)結(jié)果顯示：E804能明顯抑制A549細(xì)胞JAK1和STAT3磷酸化，提示E804可能通過抑制JAK1/STAT3信號(hào)通路誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡。

綜上所述，E804可抑制A549細(xì)胞體外增殖、遷移和分化，并誘導(dǎo)其凋亡，其機(jī)制可能與下調(diào)JAK1/STAT3信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)有關(guān)。本研究結(jié)果為以E804為先導(dǎo)的新型小分子化合物治療NSCLC提供理論支持，為其臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。