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HPLC-Q-TOF-MS在線篩選鑒定牡丹花中的抗氧化成分

2022-10-18 07:38田璇劉宇朱文卿鄭振佳
山東科學 2022年5期
關鍵詞:負離子分子量牡丹花

田璇,劉宇,朱文卿,鄭振佳

(山東農(nóng)業(yè)大學 食品科學與工程學院 山東省高校食品加工技術與質(zhì)量控制重點實驗室, 山東 泰安 271018)

牡丹(PaeoniasuffruticosaAndr.)是毛茛科芍藥屬木本植物,有“花中之王”的美譽,是較好的天然營養(yǎng)保健資源,其中鳳丹牡丹花被國家衛(wèi)計委批準為新食品原料[1-2]?,F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)牡丹具有抗腫瘤、抗炎、抗過敏、抗血栓和預防動脈粥樣硬化等作用[3-6],牡丹花具有清除超氧陰離子、羥基自由基和過氧化氫,保護DNA,防止低密度脂蛋白氧化損傷等作用[7-9],其主要抗氧化物質(zhì)是黃酮類和花色苷類成分[10-11],分析其黃酮、花色苷類成分需要多種對照品進行比對,成本較高。前期有研究嘗試通過高效液相色譜-電噴霧質(zhì)譜聯(lián)用技術分析牡丹花中的部分成分[12],但無法同時實現(xiàn)對其抗氧化活性成分的同步篩選。

高效液相色譜-飛行時間質(zhì)譜(high performance liquid chromatography-quadrupole time of flight mass spectrometry,HPLC-Q-TOF-MS)技術的優(yōu)點是速度快、靈敏度和選擇性高,目前在食品和中藥方面已有較多應用[13-15]?;?,1-二甲苯-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhdrazyl,DPPH)在線清除結合高分辨質(zhì)譜鑒定抗氧化成分的方法,現(xiàn)已廣泛應用于天然產(chǎn)物中抗氧化成分的快速篩選與鑒定[16-19]。該方法的主要流程為抗氧化成分與自由基反應在517 nm處形成負峰,結合高分辨質(zhì)譜獲得的精準分子量進行化合物的鑒定,從而實現(xiàn)樣品中抗氧化成分的快速、定向和準確識別。

本研究以牡丹花為研究對象,在線篩選鑒別其抗氧化成分,為牡丹花的成分分析及其資源利用提供參考。

1 儀器與材料

1.1 材料與試劑

牡丹花干制品(山東省菏澤市康普生物科技有限公司)。DPPH(美國Sigma公司),乙腈(色譜純,瑞士Oceanpak公司),純凈水(娃哈哈集團有限公司)。

1.2 儀器與設備

Rigol L-3000泵(北京普源精電科技有限公司),Thermo Fisher UltiMate 3000高效液相色譜儀(美國賽默飛世爾公司),Waters ACQUITY UPLC H-CLASS 超高效液相色譜儀(美國沃特世公司)和Bruker impact Ⅱ高分辨飛行時間質(zhì)譜儀(德國布魯克科技有限公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品與DPPH反應液的制備

牡丹花粉碎后過80目篩,精密稱取1.0 g樣品,加入80 mL 95%乙醇溶液回流提取30 min,轉移至100 mL容量瓶中并用95%乙醇定容,混勻,過0.45 μm有機濾膜,冷藏貯存。

將DPPH用80%乙腈溶解并配制成溶液,濃度為6×10-5mol/L,備用。

1.3.2 牡丹花中抗氧化成分在線篩選與分析

采用UltiMate 3000高效液相色譜系統(tǒng)對牡丹花樣品進行在線抗氧化成分篩選。實驗流程參照文獻[20]方法進行改良,樣品經(jīng)過色譜柱分離后與L-3000泵輸出的DPPH溶液混合,混合液在反應池中反應后流入圖像二極管陣列檢測器(DAD,photo-diode-array-detector)進行檢測。鑒于DPPH自由基在517 nm處被抗氧化活性成分清除后形成倒峰,對比樣品最佳吸收波長下的液相圖和DPPH自由基反應后的液相圖可以篩選出抗氧化成分,結合獲取的精準分子量,實現(xiàn)牡丹花中抗氧化成分的在線篩選與鑒定。

1.3.3 儀器及工作條件

液相色譜工作條件:色譜柱Waters X-Bridge C18(250 mm×4.6 mm,5 μm);乙腈(A)-水(0.1%甲酸),梯度洗脫程序 0~6 min(5%~10%A),6~7 min(10%~12%A),7~22 min(12%A),22~27 min(12%~13%A),27~28 min(13%~19%A),28~45 min(19%~20%A),45~60 min(30%~35%A);流速1.0 mL/min;檢測波長280 nm;進樣量5 μL;柱溫25 ℃。

DPPH溶液反應條件:反應器為PEEK盤管(10 m×0.25 mm),流動相為DPPH-甲醇溶液。

質(zhì)譜工作條件:分別采用電噴霧正、負離子模式;全掃描范圍m/z50~1 500,離子源ESI,毛細管電壓3 500 V,霧化氣壓0.2 MPa,干燥氣流速8 L/min,干燥氣溫度200 ℃,碰撞能量90 eV。

2 結果與分析

2.1 高效液相色譜條件優(yōu)化

以乙腈-水(0.1%甲酸)為流動相,進行分析條件的摸索。分別考察了等度洗脫和梯度洗脫在不同檢測波長下對牡丹花樣品的分離情況。實驗表明等度洗脫難以實現(xiàn)樣品中化合物的有效分離,采用梯度洗脫的方式可以實現(xiàn)牡丹花樣品中多組分的有效分離。分析過程中分別比較了280 nm和350 nm下樣品的吸收情況和出峰數(shù)量,結果顯示280 nm下樣品中的響應值較好,色譜峰數(shù)量多于350 nm。因此,液相分析條件選用乙腈-水(0.1%甲酸)為流動相,在280 nm下進行梯度洗脫的分析條件。

2.2 抗氧化活性成分在線篩選

高效液相色譜儀進行抗氧化活性成分的篩選,其液相色譜分析結果見圖1。圖1(a)為牡丹花樣品的高效液相色譜圖,圖1(b)為在線清除自由基液相色譜圖,根據(jù)圖1(b)結果顯示牡丹花提取物中的化合物6、8、10、14和15共5種成分具有抗氧化活性。

圖1 牡丹花與在線清除自由基的HPLC圖Fig.1 HPLC chromatograms of peony flower and on-line free radical scavenging

2.3 質(zhì)譜條件優(yōu)化

分別考察正、負兩種離子模式下待測樣品的總離子流圖,分析結果見圖2。對總離子流圖進行比較后發(fā)現(xiàn),牡丹花中的主要待測組分在負離子模式下的響應值略高于正離子模式,在負離子模式下雜質(zhì)的干擾程度低于正離子模式。因此為獲得最佳的分析結果,本研究選取負離子模式為牡丹花成分分析的質(zhì)譜條件。

圖2 正負離子模式下牡丹花樣品的總離子流圖Fig.2 Total ion flow diagram in positive and negative ion modes of peony flower samples

2.4 牡丹花組分及其抗氧化成分的鑒定

在優(yōu)化后的色譜分析條件下,采用飛行時間質(zhì)譜對牡丹花中的化學成分進行鑒定。根據(jù)獲得的化合物的精確分子量信息與參考文獻相對比,進行化合物的推測,結果見表1。參考相關文獻[21-22]與牡丹中已知組分推測白牡丹花中具有抗氧化成分依次為6(沒食子酸乙酯)、8(未知)、10(11α,12α-epoxy-3β,23-dihydroxy-30-norolean-20(29)-en-28,13β-olide)、14(未知)和15(未知)共5種成分,其中3種未知組分有待于今后通過分離純化獲得單體后進行結構解析。

表1 牡丹花樣品的HPLC-Q-TOF-MS分析

表1(續(xù))

化合物1在負離子模式下得到的分子量為331.055 4,推測為1-沒食子酸酰葡萄糖或6-沒食子酸酰葡萄糖[23-24]。化合物4在負離子模式下得到的分子量為609.111 8,推測為山奈酚-3,7-二-O-葡萄糖苷或山柰酚3-O-β-D-半乳糖(2→1)-β-D-葡萄糖苷[25-26]?;衔?和11在負離子模式下得到的分子量分別為447.064 3和447.064 6,推測可能為木犀草素-7-O-葡萄糖苷或山奈酚-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷[25,27],與參考文獻[27]獲得的色譜峰進行對照,確定化合物11為山柰酚-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷,因此判斷化合物9為木犀草素-7-O-葡萄糖苷?;衔?2在負離子模式下得到的分子量為577.118 2,推測該化合物為芹菜素-7-O-新橘皮糖苷或芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖-4′-O-α-L-鼠李糖苷[27-28]。

對于同分異構體,由于幾種化合物分子量相同,且沒有參考文獻報道,即使通過多級質(zhì)譜也難以實現(xiàn)鑒定。后期可以考慮在獲得單體后進行進一步分析,特別是通過核磁共振中HMBC、HSQC和1H-1H-COSY等二維核磁進行最終確認。

3 結論

本研究依據(jù)飛行時間質(zhì)譜獲得的精準分子量,共鑒定了15種成分并在線篩選出5種具有抗氧化活性的物質(zhì),參考現(xiàn)有文獻,發(fā)現(xiàn)其中僅有沒食子酸乙酯和11α,12α-epoxy-3β,23-dihydroxy-30-norolean-20(29)-en-28,13β-olide兩種成分在牡丹成分研究中報道過,其他抗氧化組分均為首次發(fā)現(xiàn),有待于后期結合分離技術和核磁等結構確證技術進一步鑒定。此外,鑒定的其他組分多為黃酮類化合物,理論上也具有清除DPPH的效果,通過該模型未能體現(xiàn)其在線清除DPPH的特性,該現(xiàn)象也有待于后期通過實驗進一步深入探究。

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