關(guān) 麗，趙惠茹，高 璐，唐瀟瀟，李偉澤*，趙 寧，馮 鋒

(1.西安醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，陜西 西安 710021；2.中國(guó)藥科大學(xué)中藥學(xué)院，江蘇 南京 211198)

腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移高度依賴于血管新生，通過(guò)血管新生獲得生長(zhǎng)所需要的營(yíng)養(yǎng)，并通過(guò)新生血管轉(zhuǎn)移到其它組織和器官。因此，開(kāi)發(fā)血管新生抑制劑成為抗腫瘤研究的主要途徑[1-4]。

近年來(lái)，斑馬魚(yú)體內(nèi)化學(xué)篩選已成為研究血管新生抑制劑和鑒定先導(dǎo)化合物的理想方法[5-9]。斑馬魚(yú)在受精后24 h(24 hpf)左右開(kāi)始發(fā)育形成血管組織，轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)因?yàn)榛蚋脑煸谂咛ズ陀紫x(chóng)發(fā)育過(guò)程中表現(xiàn)出增強(qiáng)的綠色熒光蛋白(EGFP)的血管系統(tǒng)特異性表達(dá)，其內(nèi)皮細(xì)胞可穩(wěn)定表達(dá)綠色熒光蛋白，因此，通過(guò)追蹤綠色熒光蛋白的表達(dá)，可以判斷血管組織的分布和完整性。與野生型斑馬魚(yú)相比，轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)可以提供更高的血管系統(tǒng)分辨率，且處理過(guò)程簡(jiǎn)單、快速，便于觀察，從而可以快速分析活胚胎對(duì)藥物[10]的反應(yīng)。因此，轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)可直接作為血管新生抑制劑的篩選模型。

前期研究發(fā)現(xiàn)，4-羥基-3,5,2′-三甲氧基聯(lián)芐(Aw)有明顯的抗腫瘤作用。基于此，作者以4-羥基-3,5-二甲氧基苯甲醛為原料，以Wittig反應(yīng)為關(guān)鍵步驟，通過(guò)7步反應(yīng)高效合成目標(biāo)化合物Aw；采用轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)模型研究目標(biāo)化合物Aw的抑制血管新生活性。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料、試劑與儀器

硅膠GF254薄層板，青島海洋化工廠；轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)Tg(fli-1:EGFP)，南京大學(xué)模型動(dòng)物研究中心。

柱色譜硅膠，上海譜振生物科技有限公司；DMSO，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；其它試劑均購(gòu)于阿拉丁。

AVANCE-300MHz型核磁共振波譜儀，Bruker；1100 Series型ESI-MS質(zhì)譜儀，美國(guó)Agilent；二氧化碳培養(yǎng)箱，Thermo；TR6000型全自動(dòng)酶標(biāo)儀，深圳雷杜。

1.2 合成方法

以4-羥基-3,5-二甲氧基苯甲醛(Ⅰ)為原料，與乙酸酐反應(yīng)得到乙?；Ｗo(hù)產(chǎn)物Ⅱ，再經(jīng)NaBH4還原醛基暴露出醇羥基得到化合物Ⅲ，化合物Ⅲ的羥基與二氯亞砜反應(yīng)得到鹵代產(chǎn)物Ⅳ，然后與三苯基膦反應(yīng)得到關(guān)鍵中間體膦葉立德Ⅴ[11-12]，化合物Ⅴ與2-甲氧基苯甲醛縮合得到3,5,2′-三甲氧基二苯乙烯衍生物Ⅵ，最后化合物Ⅵ通過(guò)氫化反應(yīng)和脫乙?；磻?yīng)得到目標(biāo)化合物Aw。合成路線如圖1所示。

圖1 目標(biāo)化合物Aw的合成路線Fig.1 Synthetic route of target compound Aw

1.2.1 4-甲酰基-2,6-二甲氧基苯基乙酸酯(Ⅱ)的合成

取4-羥基-3,5-二甲氧基苯甲醛(3.0 g,16.5 mmol)置于茄型瓶中， 加入催化劑量的4-二甲氨基吡啶(DMAP)，用二氯甲烷(DCM,10 mL)溶解，緩慢滴加乙酸酐(1.60 mL,18.2 mmol)，常溫?cái)嚢? h；點(diǎn)板監(jiān)測(cè)反應(yīng)結(jié)束，溶液用蒸餾水萃取3次(3×10 mL)；有機(jī)層用無(wú)水硫酸鈉干燥，濃縮，得白色晶體化合物Ⅱ3.66 g，產(chǎn)率99.5%。

1.2.2 4-羥甲基-2,6-二甲氧基苯基乙酸酯(Ⅲ)的合成

取化合物Ⅱ(3.0 g,13.3 mmol)置于茄型瓶中，用10 mL乙醇溶解，冰鹽浴下緩慢加入硼氫化鈉(0.53 g,14.0 mmol)，室溫?cái)嚢? h后加入5%HCl調(diào)節(jié)pH值至7；減壓濃縮，殘?jiān)枚燃淄檩腿?次(3×10 mL)；有機(jī)層用無(wú)水硫酸鈉干燥，濃縮，得白色固體化合物Ⅲ 2.92 g，產(chǎn)率96.5%。

1.2.3 4-氯甲基-2,6-二甲氧基苯基乙酸酯(Ⅳ)的合成

取化合物Ⅲ(2.9 g,12.9 mmol)置于茄型瓶中，用二氯甲烷(10 mL)溶解，冰鹽浴下先加入三乙胺(3.7 mL,25.8 mmol)，再緩慢滴加二氯亞砜(1.8 mL,25.8 mmol)，室溫?cái)嚢? h；溶液用蒸餾水萃取3次(3×10 mL)；有機(jī)層用無(wú)水硫酸鈉干燥，濃縮，得亮黃色固體化合物Ⅳ 2.76 g，產(chǎn)率88.1%。

1.2.4 (4-乙酰氧基-3,5-二甲氧基苯基)三苯基甲基氯化膦(Ⅴ)的合成

取化合物Ⅳ(2.5 g,10.2 mmol)和三苯基膦(2.68 g,10.2 mmol)置于100 mL茄型瓶中，用少量甲苯(5 mL)溶解，加熱回流6 h，析出大量白色粉末；冷卻至室溫，減壓抽濾，得白色粉末化合物Ⅴ 4.73 g，產(chǎn)率91.3%。

1.2.5 4-羥基-3,5,2′-三甲氧基聯(lián)芐(Aw)的合成

取化合物Ⅴ(500 mg,0.99 mmol)和2-甲氧基苯甲醛(134.6 mg,0.99 mmol)在氬氣保護(hù)下溶解于無(wú)水四氫呋喃(3 mL)中，冰鹽浴下緩慢加入氫化鈉(28.4 mg,1.18 mmol)，室溫反應(yīng)過(guò)夜后濃縮；然后將反式和順式二苯乙烯的混合物在甲醇中重結(jié)晶，用15 mL乙酸乙酯溶解，加入30 mg 10%Pd/C，通氫氣下攪拌反應(yīng)，反應(yīng)畢過(guò)濾去除Pd/C，用少量甲醇洗滌；最后反應(yīng)混合物在乙醇溶液中加入甲醇鈉以去除乙?；?，用硅膠柱層析(石油醚-乙酸乙酯為洗脫液，體積比10∶1)純化，得黃色固體目標(biāo)化合物Aw，產(chǎn)率42%。

1.3 抑制血管新生活性研究

采用在體轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)目標(biāo)化合物Aw對(duì)轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)體型及體節(jié)間血管的影響。在72 hpf，取轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)正常發(fā)育胚胎，用0.5 mg·mL-1蛋白酶對(duì)胚胎進(jìn)行脫卵膜處理適當(dāng)時(shí)間，快速洗去蛋白酶，并用吸管反復(fù)輕柔地吹打胚胎，以幫助卵膜脫除。用移液槍移取卵液于24孔板中，每孔1 mL，每孔胚胎數(shù)為15～20條，設(shè)置陰性對(duì)照組(0.1%DMSO處理)、藥物低劑量組(1 μmol·L-1)、藥物中劑量組(5 μmol·L-1)和藥物高劑量組(10 μmol·L-1)，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。加藥結(jié)束后，將24孔板置于28.5 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一定時(shí)間，觀察轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)翹尾情況，以評(píng)價(jià)目標(biāo)化合物Aw的抑制血管新生活性。

2 結(jié)果與討論

2.1 中間體與目標(biāo)化合物的表征

化合物Ⅱ：m.p.118～119 ℃;1HNMR(300 MHz,CDCl3),δ:9.93(1H,s,―CHO),7.17(2H,s,H-3,H-5),3.92(6H,s,2×―OCH3),2.38(3H,s,―COCH3);13CNMR(75 MHz,CDCl3),δ:191.1,168.1,152.8,134.3,115.0,106.0,56.3,20.4;ESI-MS,m/z:225.1 [M+H]+。

化合物Ⅲ：m.p.98～99 ℃;1HNMR(300 MHz,CDCl3),δ:6.66(2H,s,H-3,H-5),4.69(2H,s,Ar-CH2―),3.84(6H,s,2×―OCH3),2.36(3H,s,―COCH3);13CNMR(75 MHz,CDCl3),δ:168.8,152.1,139.6,115.3,103.1,65.2,56.1,20.5;ESI-MS,m/z:227.1 [M+H]+。

化合物Ⅳ：m.p.75～76 ℃;1HNMR(300 MHz,CDCl3),δ:6.85(2H,s,H-3,H-5),4.73(2H,s,Ar-CH2―),3.76(6H,s,2×―OCH3),2.24(3H,s,―COCH3);13CNMR(75 MHz,CDCl3),δ:168.3,152.0,139.4,115.0,103.2,60.7,56.1,20.4;ESI-MS,m/z:245.6 [M+H]+。

化合物Ⅴ：1HNMR(300 MHz,DMSO-d6),δ:7.92(3H,m,Ar-H),7.76(6H,dt,J=3.6 Hz、8.1 Hz,Ar-H),7.69(6H,m,Ar-H),6.30(2H,d,J=2.4 Hz,H-3,H-5),5.09(2H,J=15.0 Hz,Ar-CH2-),3.37(6H,s,2×-OCH3),2.21(3H,s,-OCH3);13CNMR(75 MHz,DMSO-d6),δ:168.4,152.0, 151.9,135.5,134.8,134.6,130.6,130.4,126.9,126.7,118.8,117.6,108.5,108.4,56.2,29.4,28.8,20.6;ESI-MS,m/z:507.9 [M+H]+。

目標(biāo)化合物Aw：1HNMR(300 MHz,CDCl3),δ:7.24(1H,m,H-3′),7.09(1H,m,H-4′),6.89(2H,m,H-5′,H-6′),6.40(2H,s,H-3,H-5),5.40(1H,brs,Ar-OH),3.86(9H,s,3×-OCH3),2.90～2.85(4H,m,-CH2CH2-);13CNMR(75 MHz,CDCl3),δ:161.1,160.6,149.7,148.3,137.1,133.4,129.8,123.6,120.9,114.0,105.5,56.7,55.9,40.9,36.7;ESI-MS,m/z:311.1 [M+Na]+。

2.2 目標(biāo)化合物Aw的抑制血管新生活性

以72 hpf轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)為篩選模型，考察目標(biāo)化合物Aw對(duì)斑馬魚(yú)血管新生的影響，結(jié)果如圖2所示。

圖2 目標(biāo)化合物Aw對(duì)斑馬魚(yú)血管新生的影響Fig.2 Effect of target compound Aw on angiogenesis in zebrafish

從圖2可以看到，與陰性對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)均發(fā)生了翹尾，且隨著目標(biāo)化合物Aw劑量的增加，翹尾越來(lái)越嚴(yán)重；目標(biāo)化合物Aw抑制轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)體節(jié)間血管的生成呈濃度依賴性。表明，目標(biāo)化合物Aw具有抑制血管新生活性。

3 結(jié)論

以4-羥基-3,5-二甲氧基苯甲醛為原料，以Wittig反應(yīng)為關(guān)鍵步驟，通過(guò)7步反應(yīng)合成了4-羥基-3,5,2′-三甲氧基聯(lián)芐，通過(guò)1HNMR、13CNMR 、ESI-MS確證了其結(jié)構(gòu)；在體轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，4-羥基-3,5,2′-三甲氧基聯(lián)芐具有抑制血管新生活性，可以使斑馬魚(yú)發(fā)生翹尾，同時(shí)抑制體節(jié)間血管的生成。推測(cè)4-羥基-3,5,2′-三甲氧基聯(lián)芐可以通過(guò)抑制血管新生來(lái)發(fā)揮抗腫瘤作用。