吳學(xué)明，陳燕娥，陳綿

(?？谑袐D幼保健院 婦科，海南 海口 570203)

不孕癥是一個全球性的問題。自1978年體外受精- 胚胎移植(in vitro fertilization embryo transfer，IVF- ET)出現(xiàn)以來，經(jīng)歷了多個發(fā)展階段后IVF- ET已成為解決成年人群不孕問題的主要措施[1- 2]。控制性促排卵(controlled ovarian hyperstimulation，COH)是臨床上獲取成熟卵母細(xì)胞較為成熟的方案之一，其臨床結(jié)局主要依賴于卵巢反應(yīng)[3]，卵巢低反應(yīng)(poor ovarian response，POR)可能導(dǎo)致卵母細(xì)胞回收量較少，臨床妊娠率降低[4]；同樣卵巢高反應(yīng)(hyper ovarian response，HOR)也是COH的一種病理狀況，可增加卵巢過度刺激綜合征(ovarian hyperstimulation syndrome，OHSS)的發(fā)病風(fēng)險[5]。但是由于缺乏可靠、直接的預(yù)測標(biāo)志物，臨床醫(yī)生很難對卵巢反應(yīng)作出準(zhǔn)確評估。性激素結(jié)合球蛋白(sex- hormone- binding globulin，SHBG)是一種主要在肝臟合成的糖基化同源二聚血漿轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白[6]。已知SHBG通過與循環(huán)雄激素和雌激素結(jié)合來調(diào)節(jié)它們的濃度，并進(jìn)一步通過激活胞膜上特異性高親和力受體對激素反應(yīng)組織中性激素的細(xì)胞攝取和細(xì)胞增殖產(chǎn)生直接影響[7]。但是，在促性腺激素釋放激素拮抗劑(gonadotropin- releasing hormone antagonist，GnRH- ant)促排卵方案中，血清SHBG濃度是否發(fā)生變化，以及它們是否與卵泡發(fā)育相關(guān)，尚不清楚。因此，本研究旨在探討卵巢反應(yīng)相關(guān)的危險因素，并確定COH期間血清SHBG水平是否與卵巢反應(yīng)相關(guān)。

1 對象與方法

1.1 研究對象和倫理

本研究獲得我院倫理委員會的批準(zhǔn)，所有參與者在入組前都簽署了知情同意書。受試者為2018年1月至2020年1月在我院生殖中心接受IVF- ET的378例女性，其中83例POR，204例正常反應(yīng)，91例HOR。不孕的原因包括輸卵管因素、子宮內(nèi)膜異位癥、多囊卵巢綜合征(polycystic ovarian syndrome, PCOS)、男性因素、不明原因不孕等。納入標(biāo)準(zhǔn)：年齡20～50歲；首次接受IVF；存在原發(fā)性或繼發(fā)性不孕；體重指數(shù)(body mass index，BMI)為16～33 kg·m-2。排除標(biāo)準(zhǔn)：診斷為卵巢早衰、甲狀腺功能異常或以前因手術(shù)造成的卵巢損傷者。所有參與者都接受了完整的不孕不育檢查，包括基礎(chǔ)盆腔超聲、卵巢和甲狀腺激素評估，以及艾滋病、乙肝和丙肝的血清學(xué)檢測。

1.2 COH方案

根據(jù)患者年齡、基礎(chǔ)竇卵泡數(shù)(antral follicle counting，AFC)和基礎(chǔ)內(nèi)分泌情況，選擇固定的GnRH- ant方案。從月經(jīng)周期第3天開始每日肌肉注射重組人促卵泡激素(recombinant follicle stimulating hormone，rFSH)(Gonal- F，瑞士Serono公司)，起始劑量為150～225 U·d-1，啟動促排卵，第8天開始B超監(jiān)測卵泡并監(jiān)測激素水平。在優(yōu)勢卵泡直徑>14 mm時開始每日肌肉注射GnRH- ant(醋酸加尼瑞克，荷蘭N.V.Organon公司)0. 25 mg·d-1至扳機(jī)日。當(dāng)最大卵泡平均直徑達(dá)到18 mm或3個卵泡平均直徑達(dá)到16 mm時，停止rFSH治療，轉(zhuǎn)而注射10 000 IU人絨毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin，HCG)(廣州Livzon公司)。34～36 h后，在陰道超聲引導(dǎo)下穿刺收集卵母細(xì)胞。根據(jù)卵泡發(fā)育和雌二醇(serum estradiol，E2)水平調(diào)整劑量。

1.3 卵巢反應(yīng)診斷[8]

目前對于POR及HOR的診斷尚無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，本研究結(jié)合?？谑袐D幼保健院與國內(nèi)外共識，POR被定義為常規(guī)刺激獲得卵母細(xì)胞數(shù)量≤3個或者卵巢儲備功能異常，抗苗勒氏管激素(anti- Müllerian hormone，AMH)<0.5～1.1 μg·L-1或AFC<5～7個。HOR被定義為在hCG給藥日血清E2>11 010 pmol·L-1(3 000 pg·ml-1)或獲卵數(shù)>15個。

1.4 IVF- ET

將獲得的卵母細(xì)胞按常規(guī)方法進(jìn)行體外受精。18 h 后觀察生殖核和極體，以評價受精情況。取卵后第2、3天觀察胚胎分裂。具有正常形態(tài)的卵裂球及少于15%的胚胎碎片被認(rèn)為是有效胚胎。在胚胎移植后的4～5周內(nèi)，陰道超聲檢查發(fā)現(xiàn)孕囊或手術(shù)病理證實(shí)異位妊娠可診斷為臨床妊娠。當(dāng)HCG升高時未見胚囊，診斷為生化妊娠。取消周期被定義為因缺乏可移植的胚胎或OHSS取消新鮮胚胎移植。

1.5 血清激素水平檢測

所有參與者都接受了基礎(chǔ)卵巢儲備測試(次日評估性激素和AMH)。從治療開始每2～3天經(jīng)前臂靜脈穿刺采集靜脈血樣，采用羅氏化學(xué)發(fā)光免疫分析法(試劑盒購自瑞士羅氏公司)檢測COH期間收集的血清樣本中促卵泡激素(follicle stimulating hormone，F(xiàn)SH)、黃體生成素(luteinizing hormone，LH)、E2、孕酮(progesterone，P4)水平。血清SHBG濃度采用市售酶聯(lián)免疫吸附試劑盒(美國RD公司)測定。所有化驗(yàn)都是由同一位經(jīng)驗(yàn)豐富的技術(shù)人員按照標(biāo)準(zhǔn)方案進(jìn)行的，以盡量減少變異性的影響。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 卵巢反應(yīng)相關(guān)危險因素分析

與正常反應(yīng)組相比，年齡、IVF周期、子宮內(nèi)膜異位癥、PCOS和流產(chǎn)與POR顯著相關(guān)(P<0.05)；年齡、BMI、PCOS、月經(jīng)周期與HOR顯著相關(guān)(P<0.05)。見表1。

表1 卵巢POR和HOR的危險因素分析 例

(續(xù)表)

2.2 不同卵巢反應(yīng)者的臨床結(jié)局

在年齡<35歲的患者中，POR組與正常反應(yīng)組相比，MII卵母細(xì)胞數(shù)、有效胚胎數(shù)、臨床妊娠率均顯著下降(P<0.05)；而HOR組MII卵母細(xì)胞數(shù)、有效胚胎數(shù)、IVF取消周期率均高于正常反應(yīng)組，而且受精率和移植胚胎數(shù)較少(P<0.05)。在年齡≥35歲的患者中，POR組MII卵母細(xì)胞數(shù)、有效胚胎數(shù)、移植胚胎數(shù)及臨床妊娠率均明顯低于正常反應(yīng)組(P<0.05)；而HOR組與正常反應(yīng)組相比，MII卵母細(xì)胞數(shù)和有效胚胎數(shù)明顯增加，但移植胚胎數(shù)和臨床妊娠率降低(P<0.05)。見表2、3。

表2 根據(jù)年齡分層的不同卵巢反應(yīng)者的實(shí)驗(yàn)室結(jié)果

表3 根據(jù)年齡分層的不同卵巢反應(yīng)組的臨床結(jié)局

2.3 各組血清SHBG水平和AMH水平的比較

與正常反應(yīng)組相比，不同年齡段POR組血清SHBG基線值、AMH基線值和HCG注射當(dāng)天血清SHBG水平均顯著降低，相反HOR組則顯著升高(P<0.05，表4)。

表4 根據(jù)年齡分層的不同卵巢反應(yīng)者血清SHBG水平和AMH水平差異

2.4 多因素分析影響卵巢反應(yīng)的危險因素

經(jīng)多因素非條件Logistic回歸分析，逐步剔除不顯著的變量，將上述存在統(tǒng)計學(xué)差異的變量(P<0.05)納入回歸方程，結(jié)果顯示年齡≥35歲、子宮內(nèi)膜異位癥、HCG注射當(dāng)天血清SHBG水平與POR的發(fā)生有關(guān)(P<0.05)。PCOS、體重過輕、月經(jīng)周期不規(guī)律、≥35歲、HCG注射當(dāng)天血清SHBG水平與HOR相關(guān)(P<0.05)。見表5。

表5 多因素非條件Logistic回歸分析結(jié)果

2.5 COH期間血清SHBG水平變化

在COH期間，血清SHBG水平總體下降(P<0.001)；血清E2濃度和優(yōu)勢卵泡(直徑>10 mm)數(shù)量顯著增加，而血清LH水平下降(P<0.001)；不同卵巢反應(yīng)組的變化趨勢無顯著差異(P>0.05)。見圖1。

圖1 COH期間血清中卵泡發(fā)育相關(guān)激素的濃度和優(yōu)勢卵泡數(shù)量的變化

2.6 血清SHBG水平與卵巢反應(yīng)的相關(guān)性

HCG注射當(dāng)天血清SHBG水平與卵母細(xì)胞數(shù)、有效胚胎數(shù)以及血清E2水平、D3時血清LH水平呈正相關(guān)(P<0.05)；但是δSHBG(HCG注射當(dāng)天血清SHBG水平減去SHBG基礎(chǔ)值)與COH期間卵巢反應(yīng)變量無關(guān)(P>0.05)。血清SHBG基線值與有效胚胎數(shù)、HCG當(dāng)日血清E2水平呈正相關(guān)(P<0.05)。見圖2。

圖2 SHBG與臨床卵巢反應(yīng)的相關(guān)性分析

2.7 ROC曲線分析

ROC曲線分析顯示，HCG注射當(dāng)天血清SHBG水平預(yù)測POR或HOR的AUC分別為0.718(95%CI0.636～0.801)和0.489(95%CI0.391～0.604)，經(jīng)Z檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖3。

圖3 HCG注射當(dāng)天血清SHBG預(yù)測POR(A)和HOR(B)的ROC曲線

3 討 論

目前IVF- ET技術(shù)已在世界范圍內(nèi)廣泛應(yīng)用，以解決尋求醫(yī)療援助夫婦的不孕問題。IVF- ET的成功依賴于通過COH過程獲得足夠的成熟卵泡。因此準(zhǔn)確預(yù)測卵巢反應(yīng)對于獲得理想的IVF- ET結(jié)局或防止輔助生殖過程中的卵巢功能障礙有重要意義。在本研究中，作者發(fā)現(xiàn)血清SHBG水平與COH期間卵巢反應(yīng)存在顯著的相關(guān)性，對POR有良好的預(yù)測價值。

SHBG是從肝臟分泌到血液中的，可與各種性激素相結(jié)合。此前的一項(xiàng)研究[9]發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)SH受體/SHBG/芳香化酶細(xì)胞色素 p450(CyP19)基因型與接受IVF的女性卵巢對標(biāo)準(zhǔn)Gn刺激的反應(yīng)有關(guān)。在本研究中，我們觀察到血清SHBG水平與卵母細(xì)胞數(shù)量和有效胚胎數(shù)量呈正相關(guān)，這兩者都代表卵巢對 COH的反應(yīng)，提示SHBG可能參與卵泡的發(fā)育和卵巢對COH的反應(yīng)。我們觀察到血清SHBG濃度在整個COH周期中呈下降趨勢，呈現(xiàn)出與LH相同的動態(tài)變化曲線，并與血清E2濃度和優(yōu)勢卵泡數(shù)量的變化趨勢相反。此外，HOR者血清SHBG水平明顯高于正常反應(yīng)者，同樣的POR者血清SHBG水平低于正常反應(yīng)者，提示SHBG可能是卵巢反應(yīng)的有效預(yù)測指標(biāo)。

據(jù)報道，循環(huán)血中促炎細(xì)胞因子如腫瘤壞死因子-α(TNF- α)可能會抑制SHBG的產(chǎn)生[10]。此外，脂聯(lián)素通過腺苷5′- 磷酸激活蛋白激酶(AMPK)途徑在HepG2 細(xì)胞中可上調(diào)SHBG表達(dá)，因此血清SHBG濃度可能受代謝狀態(tài)的調(diào)節(jié)，如肥胖或胰島素抵抗[11]。最近，一些研究報道了SHBG在調(diào)節(jié)卵巢顆粒細(xì)胞功能中的另一個層面的作用，特別是SHBG可以通過調(diào)節(jié)促性腺激素受體的表達(dá)來影響其作用[12]。同時，也證實(shí)了SHBG參與PCOS，這也間接支持了SHBG在調(diào)節(jié)卵泡發(fā)生中的功能[13]。PCOS是一種慢性炎癥性疾病，伴隨胰島素抵抗和血脂異常，與血清TNF- α和脂聯(lián)素水平均升高有關(guān)。所以PCOS患者復(fù)雜的代謝、炎癥和激素狀況可能會改變TNF- α的調(diào)節(jié)，破壞TNF- α在卵巢周期中對卵巢反應(yīng)的預(yù)測作用。而PCOS是HOR的獨(dú)立高危因素之一，因此經(jīng)ROC曲線分析，HCG當(dāng)日血清SHBG水平對于POR預(yù)測的AUC高于HOR。

女性原始卵泡池在出生時就已經(jīng)成型，構(gòu)成初級卵巢儲備。然而大多數(shù)卵泡在兒童期閉鎖和退化，且隨著年齡的增長，女性的卵巢儲備逐漸減少[14]。在本研究中，卵巢反應(yīng)與女性年齡呈負(fù)相關(guān)，其中卵巢反應(yīng)也隨著年齡的增長而變差。卵巢反應(yīng)和卵巢儲備均與年齡呈負(fù)相關(guān)，這支持了卵巢儲備能夠部分預(yù)測卵巢反應(yīng)的觀點(diǎn)。

PCOS是育齡婦女常見的婦科內(nèi)分泌疾病，全球發(fā)病率為5%～10%[15]。PCOS患者卵泡發(fā)育異常，主要表現(xiàn)為生長早期卵泡數(shù)量過多。PCOS患者發(fā)育停滯的小卵泡較多，F(xiàn)SH閾值較低，這意味著這些患者需要較低水平的FSH刺激來促進(jìn)卵泡再生和發(fā)育[16]。我們的研究表明，PCOS是HOR的高危因素，提示PCOS患者對促性腺激素高度敏感。此外，我們還發(fā)現(xiàn)了月經(jīng)周期不規(guī)則與POR呈負(fù)相關(guān)，而與HOR呈正相關(guān)。根據(jù)Rotterdam標(biāo)準(zhǔn)，月經(jīng)周期不規(guī)則是診斷PCOS的依據(jù)之一[17]。子宮內(nèi)膜異位癥是另一種嚴(yán)重危害婦女生殖健康的婦科疾病。有報道稱子宮內(nèi)膜異位癥對卵巢儲備和反應(yīng)有負(fù)面影響[18]。同樣，我們的研究也提示子宮內(nèi)膜異位癥患者更有可能表現(xiàn)出POR。

綜上所述，在GnRH- ant治療期間，血清SHBG水平與卵巢反應(yīng)呈正相關(guān)，且可作為POR的有效預(yù)測指標(biāo)之一，但是對于預(yù)測HOR效能有限。本研究結(jié)果對卵巢反應(yīng)相關(guān)的危險因素提供了新的認(rèn)識，并強(qiáng)調(diào)了SHBG在COH過程中指示卵巢反應(yīng)的潛在作用。但我們目前的研究是基于單一臨床中心的臨床信息。為了進(jìn)一步證實(shí)我們的結(jié)果，還需要進(jìn)行大規(guī)模的多中心臨床評估。