申玉華，白玉東，范天寧，李守坤，梁耕源，陳煥，任秀鵬，郭芡芡，王浩安，林景衛(wèi)

（1.赤峰學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古 赤峰 024001；2.沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，沈陽(yáng) 110161）

轉(zhuǎn)錄因子作為分子開關(guān)與其靶基因上的順式作用元件在時(shí)間與空間上調(diào)控基因的表達(dá)[1]。NAC蛋白是植物中已知最大的特異轉(zhuǎn)錄因子家族之一，1992年首次在擬南芥中報(bào)道NAC蛋白編碼基因RD26[2]，隨著基因克隆技術(shù)的發(fā)展，已經(jīng)在植物中鑒定出110多個(gè)NAC同源蛋白[3]。NAC蛋白N端高度保守，大約由160多個(gè)氨基酸殘基組成，并且該家族所有蛋白質(zhì)都有一個(gè)保守的N-末端DNA結(jié)合域，稱為NAC結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域最先在無頂端分生組織（NAM）、擬南芥轉(zhuǎn)錄激活因子（ATAF1/2）和杯狀子葉蛋白（CUC2）中被鑒定[4]，其C端保守性較低，但已有不少例子證明，其C端有轉(zhuǎn)錄激活功能[5-7]。NAC超家族的成員不僅存在于被子植物中，同時(shí)也存在于松樹和苔蘚植物中。其參與植物發(fā)育和非生物或生物脅迫反應(yīng)有著緊密的關(guān)聯(lián)[8]。功能研究表明，NAC蛋白在植物的生長(zhǎng)發(fā)育中起重要作用，包括芽頂端分生組織的形成和維持、花的發(fā)育和形成、側(cè)根的發(fā)育、激素信號(hào)、種子萌發(fā)和衰老等[9-11]。不僅如此，NAC轉(zhuǎn)錄因子還具有調(diào)節(jié)免疫作用，NAC基因可以在植物受到創(chuàng)傷或在細(xì)菌感染期間上調(diào)來增強(qiáng)免疫能力，也可以抵抗病毒的感染[12-13]。NAC基因表達(dá)量的降低也會(huì)導(dǎo)致植物免疫能力的下降。水稻中OsNAC6基因的敲除會(huì)損害植物對(duì)富營(yíng)養(yǎng)化白粉病真菌的抗性[14]。絕大多數(shù)NAC基因?qū)Ψ巧锩{迫敏感，并起著重要的調(diào)節(jié)作用。在分析擬南芥和水稻中的幾種全基因組表達(dá)時(shí)，發(fā)現(xiàn)NAC基因至少由一種非生物脅迫誘導(dǎo)，如鹽度、干旱、寒冷或ABA等[15-16]。NAC控制的過程主要取決于它們的轉(zhuǎn)錄特性,NAC既可以作為激活劑，也可以作為抑制劑。此外，它們的同源/異源二聚化能力也會(huì)影響其與DNA結(jié)合和激活特性[17]。由于NAC調(diào)節(jié)植物的生長(zhǎng)發(fā)育和脅迫反應(yīng)，因此對(duì)它們的深入了解有助于指導(dǎo)未來的作物改良研究。

紫花苜蓿是豆科蝶形花亞科苜蓿屬，多年生優(yōu)質(zhì)牧草，富含蛋白質(zhì)、維生素和多種礦物質(zhì)元素，有著“牧草之王”的美譽(yù)[18]。申玉華等[19-20]利用RT-PCR和RACE技術(shù)在紫花苜蓿中克隆得到了2個(gè)新基因MsNAC2和MsNAC3，對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析和亞細(xì)胞定位試驗(yàn)，結(jié)果表明紫花苜蓿MsNAC2和MsNAC3屬于NAC家族轉(zhuǎn)錄因子。運(yùn)用real-time PCR方法研究在多種非生物逆境脅迫下的表達(dá)特性，表明MsNAC2和MsNAC3基因可能參與紫花苜蓿冷害、干旱、鹽和ABA等非生物脅迫的生理響應(yīng)。為進(jìn)一步了解MsNAC2和MsNAC3的生物學(xué)功能，本研究從紫花苜蓿cDNA中克隆MsNAC2和MsNAC3基因，將其構(gòu)建到pPIC9載體上，轉(zhuǎn)化野生畢赤酵母，并以轉(zhuǎn)pPIC9空載體酵母作為對(duì)照，在逆境脅迫條件下對(duì)轉(zhuǎn)基因株系進(jìn)行相關(guān)表型分析，為揭示Ms-NAC2和MsNAC3在紫花苜蓿逆境調(diào)控中的分子遺傳機(jī)制奠定基礎(chǔ)，同時(shí)為應(yīng)用苜蓿NAC轉(zhuǎn)錄因子基因開展紫花苜蓿抗逆基因機(jī)理研究，以及通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)改善紫花苜蓿抗逆能力和提高其品質(zhì)奠定基礎(chǔ)，為進(jìn)一步通過基因工程手段應(yīng)用于植物抗逆轉(zhuǎn)基因育種提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試材料紫花苜蓿(Medicago sativaL.)、野生畢赤酵母、畢赤酵母對(duì)照株系（CK:轉(zhuǎn)pPIC9載體）、pPIC9載體為實(shí)驗(yàn)室保存，大腸桿菌TOP10感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自天根生化科技有限公司。

1.1.2 試劑盒和藥品質(zhì)粒小提試劑盒、膠回收試劑盒、pGM-T試劑盒、Frozen-EZ Yeast TransformationⅡKit-TM試劑盒為北京天根生化科技有限公司產(chǎn)品。氨芐青霉素、X-Gal、IPTG、限制性內(nèi)切酶和T4連接酶購(gòu)自大連Takara公司。

1.1.3 培養(yǎng)基LB培養(yǎng)基：蛋白胨10g·L-1，酵母粉5g·L-1，NaCl 10g·L-1（NaOH調(diào)節(jié)pH值至7.0）固體培養(yǎng)基添加瓊脂粉15g·L-1，121℃，滅菌25min。YPD培養(yǎng)基：胰蛋白胨20g·L-1，酵母粉10g·L-1，葡萄糖20g·L-1（固體培養(yǎng)基加瓊脂粉15g·L-1）110℃滅菌30min。BMMY培養(yǎng)基:YNB13.4g·L-1，胰蛋白胨20g·L-1，生物素4×10-5g·L-1，磷酸鈉緩沖液20mL·L-1，甲醇1%（使用磷酸調(diào)pH=5.0）過濾滅菌30min。MD培養(yǎng)基:YNB13.4g·L-1，生物素4×10-5g·L-1，葡萄糖20g·L-1（pH溶于自然，固體培養(yǎng)基加瓊脂粉15g·L-1），過濾滅菌30min。

1.1.4 PCR引物根據(jù)已知基因序列，通過primier5.0設(shè)計(jì)并合成MsNAC2和MsNAC3基因的全長(zhǎng)引物，分別命名為A2-R、A2-F、A3-R和A3-F，在其C端引入6×His標(biāo)簽編碼序列，并添加酶切位點(diǎn)（表1）。

1.2 方法

1.2.1 目的片段的基因克隆提取野生紫花苜?；蚪MDNA，用A2和A3上下游引物擴(kuò)增MsNAC2和MsNAC3基因。反應(yīng)程序：94℃3min；94℃30s；60℃30s；72℃30s(30個(gè)循環(huán))；72℃10min。PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，分別回收1020bp(MsNAC2）和1014 bp(MsNAC3)的片段，與克隆載體pGM-T連接，送上海生工測(cè)序。

1.2.2 pPIC9-His-MsNAC2、pPIC9-His-MsNAC3的載體構(gòu)建MsNAC2和MsNAC3基因分別與T載體連接，測(cè)序。載體pGM-T-MsNAC2和pGM-T-MsNAC3和pPIC9分別用EcoRI和NotI進(jìn)行酶切，膠回收，連接轉(zhuǎn)化，測(cè)序。

1.2.3 重組載體轉(zhuǎn)化酵母和PCR檢測(cè)重組表達(dá)載體pPIC9-His-MsNAC2、pPIC9-His-MsNAC3用SacⅠ線性化，回收。用Frozen-EZ Yeast TransformationⅡKitTM試劑盒進(jìn)行酵母轉(zhuǎn)化，菌液涂布MD固體培養(yǎng)基30℃黑暗培養(yǎng)2d進(jìn)行篩選，挑取MD培養(yǎng)基上的單菌落進(jìn)行PCR檢測(cè)。

1.2.4 重組酵母NAC蛋白檢測(cè)SDS-PAGE檢測(cè)：吸取PCR陽(yáng)性菌株菌液加入YPD液體30℃培養(yǎng)至OD=1.0，將培養(yǎng)完的菌液離心，重溶于BMMY液體培養(yǎng)基30℃黑暗培養(yǎng)4d，每24h進(jìn)行一次1%甲醇補(bǔ)加并繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)。離心取發(fā)酵液上清，水浴鍋?zhàn)冃?min，進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，G250考馬斯亮藍(lán)染色。West Bolt檢測(cè)：將樣品進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗和二抗孵育、ECL顯色、PVDF膜直接顯色。

1.2.5 重組酵母溫度脅迫酵母細(xì)胞在30°C的YPD培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)中期。離心收集細(xì)胞沉淀，并用無菌生理鹽水清洗。將細(xì)胞懸液濃度調(diào)整為OD600=1.0。制備細(xì)胞懸液的10-1，10-2，10-3系列稀釋液用于斑點(diǎn)試驗(yàn)。于37℃和16℃在固體YPD板上觀察等量的細(xì)胞生長(zhǎng)狀況拍照記錄。

1.2.6 重組酵母鹽脅迫酵母細(xì)胞在30℃的YPD培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)中期。離心收集細(xì)胞沉淀，用無菌生理鹽水清洗。將細(xì)胞懸液濃度調(diào)整為OD600=1.0。制備細(xì)胞懸液的10-1，10-2，10-3系列稀釋液用于斑點(diǎn)試驗(yàn)。在100mmol·L-1和200mmol·L-1NaCl濃度的固體YPD板上觀察等量的細(xì)胞生長(zhǎng)狀況，2d后拍照記錄。

2 結(jié)果與分析

2.1 MsNAC2和MsNAC3克隆

由圖1可知，在引物上C端引入6×His標(biāo)簽克隆MsNAC2和MsNAC3基因，在1020bp和1014bp處目的條帶單一，膠回收與克隆載體pGM-T連接，測(cè)序結(jié)果正確，表明MsNAC2和MsNAC3基因被成功克隆。

2.2 pPIC9-His-MsNAC2和pPIC9-His-MsNAC3重組表達(dá)載體構(gòu)建

用EcoRI和NotI進(jìn)行分別對(duì)克隆載體pGM-T-MsNAC2、pGM-T-MsNAC3和pPIC9進(jìn)行雙酶切，回收，連接，轉(zhuǎn)化。對(duì)菌落進(jìn)行菌落PCR鑒定，提質(zhì)粒，進(jìn)行雙酶切檢測(cè)。由圖2可知，酶切結(jié)果和已知克隆片段大小一致，成功構(gòu)建酵母重組表達(dá)載體pPIC9-His-MsNAC2和pPIC9-His-MsNAC3（圖3）。

圖1 MsNAC2和MsNAC3基因PCR結(jié)果Figure 1 MsNAC2和MsNAC3 gene PCR result

圖2 pPIC9-His-MsNAC2、pPIC9-His-MsNAC3酶切結(jié)果Figure 2 pPIC9-His-MsNAC2,pPIC9-His-MsNAC3 digestion

2.3 重組酵母轉(zhuǎn)化PCR鑒定

分別將重組載體pPIC9-His-MsNAC2和pPIC9-His-MsNAC3用SacⅠ進(jìn)行單酶切，酶切回收產(chǎn)物用酵母轉(zhuǎn)化試劑盒轉(zhuǎn)入野生畢赤酵母當(dāng)中，對(duì)長(zhǎng)出的單菌落進(jìn)行PCR鑒定，在1000bp處存在明顯DNA條帶，表明線性化載體成功轉(zhuǎn)入畢赤酵母當(dāng)中，確定了陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行下一步試驗(yàn)（圖4）。

2.4 重組酵母NAC蛋白鑒定

對(duì)重組酵母轉(zhuǎn)化子的發(fā)酵液上清進(jìn)行SDS-PAGE和Western Bolt檢測(cè)，圖5中1號(hào)泳道為野生畢赤酵母，2號(hào)和3號(hào)泳道為MsNAC2重組酵母，4號(hào)和5號(hào)泳道為MsNAC3重組酵母。在2號(hào)、3號(hào)、4號(hào)和5號(hào)泳道中可見明顯單一蛋白條帶。其為Western bolt結(jié)果與SDS-PAGE結(jié)果對(duì)應(yīng)，表明重組蛋白rMsNAC2和rMsNAC3得以表達(dá)，重組酵母正確，并分別將MsNAC2和MsNAC3的重組轉(zhuǎn)化子命名為A2和A3。

圖3 表達(dá)載體pPIC9-His-MsNAC2和pPIC9-His-MsNAC3示意圖Figure 3 pPIC9-His-MsNAC2 and pPIC9-His-MsNAC3 vector

圖4 pPIC9-His-MsNAC2和pPIC9-His-MsNAC3畢赤酵母轉(zhuǎn)化子菌落PCR鑒定圖Figure 4 PCR of pPIC9-His-MsNAC2 and pPIC9-His-Ms-NAC3 P.pastoris transformants colonies

圖5 rMsNAC2、rMsNAC3的SDS-PAGE和Western Bolt檢測(cè)結(jié)果Figure 5 SDS-PAGE detection results of rMsNAC2 and rMsNAC3

2.5 重組酵母抗逆性驗(yàn)證

由圖6可知，A2、A3和CK在非脅迫條件下（30℃，YPD）表現(xiàn)出相似的生長(zhǎng)力，生命力和成活率無明顯差異，表明轉(zhuǎn)入MsNAC2和MsNAC3對(duì)酵母的正常生長(zhǎng)發(fā)育未產(chǎn)生較大的影響。在16℃處理5d時(shí)，CK幾乎不生長(zhǎng)，A2和A3仍可以生長(zhǎng)，并且A2表現(xiàn)出更好的耐受性；在37℃處理2d時(shí)，酵母稀釋10倍的情況下，明顯可以看出A2和A3依然保持著較高的成活率，而CK的成活率明顯低于A2和A3。在溫度脅迫下，轉(zhuǎn)基因酵母成活率明顯高于野生型，且A2＞A3＞CK。在100mmol·L-1NaCl處理2d，酵母稀釋1000倍的情況下，A2和A3的生長(zhǎng)情況略好于CK；將NaCl濃度提高到200mmol·L-1時(shí)處理2d，酵母稀釋10倍的情況下，CK無生長(zhǎng)跡象，而A2和A3依然可以生長(zhǎng)，并且A2成活率最高。試驗(yàn)表明，酵母中轉(zhuǎn)入MsNAC2和MsNAC3有助于提高其對(duì)溫度、鹽脅迫的耐受性，且酵母A2在成活率和生命力上表現(xiàn)得最為優(yōu)異。

圖6 CK、A2、A3酵母在不同處理下斑點(diǎn)圖Figure 6 Spots of CK,A2 and A3 yeast under different treatments

3 討論與結(jié)論

非生物脅迫對(duì)植物生長(zhǎng)和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)有著不利的影響。NAC蛋白作為植物中最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一，在調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)發(fā)育過程和非生物脅迫反應(yīng)中起著重要作用。大量研究表明，許多響應(yīng)脅迫的NAC轉(zhuǎn)錄因子已被用于基因工程來提高作物的抗逆性。

近年來，利用酵母表達(dá)系統(tǒng)對(duì)抗逆基因的功能進(jìn)行分析已經(jīng)成為常規(guī)手段。GAO等[21]將ThVHAc1基因轉(zhuǎn)入酵母,對(duì)其進(jìn)行抗鹽、干旱、活性氧、重金屬、低溫、高溫等脅迫的功能分析。楊桂燕等[22]從檉柳中克隆獲得ThGSTZ1基因，將其構(gòu)建到表達(dá)載體pYES2上，轉(zhuǎn)化酵母并獲得了過表達(dá)酵母株系(pYES2-ThGSTZ1)，對(duì)過表達(dá)ThGSTZ1基因酵母進(jìn)行不同的脅迫處理，從而研究該基因在酵母中的抗逆功能。這種例子還有很多，如粟莉圓等[23]將轉(zhuǎn)JrDSTau1基因酵母進(jìn)行鹽、鎘、溫度的脅迫處理，相較于對(duì)照組，轉(zhuǎn)基因酵母展現(xiàn)出更強(qiáng)的生命力和更高的成活性。眾多的試驗(yàn)也證明了酵母表達(dá)系統(tǒng)是研究抗逆基因功能的良好材料。本研究也利用了酵母表達(dá)系統(tǒng)，先在紫花苜蓿cDNA中克隆MsNAC2和MsNAC3基因，構(gòu)建pPIC9-His-MsNAC2和pPIC9-His-MsNAC3真核穿梭載體，轉(zhuǎn)入畢赤酵母，最后通過PCR、SDS-PAGE、West bolt的分子手段鑒定得到MsNAC2和MsNAC3轉(zhuǎn)基因株系A(chǔ)2、A3。在試驗(yàn)設(shè)計(jì)中，為保證轉(zhuǎn)基因菌株篩選正確，規(guī)避PCR檢測(cè)的假陽(yáng)性，在基因的C端引入組氨酸標(biāo)簽用來蛋白表達(dá)檢測(cè)。劉昀等[24]在探究外源PM2蛋白及缺失多肽的表達(dá)可提高酵母的耐鹽能力時(shí),分別用了帶組氨酸標(biāo)簽和不帶組氨酸標(biāo)簽的轉(zhuǎn)基因菌株進(jìn)行了試驗(yàn)，兩種方法耐鹽的保護(hù)作用大小均為:PM2C＞PM2B＞PM2A≈PM2，表明組氨酸標(biāo)簽的存在并未影響LEA3融合蛋白的耐鹽能力[24]。說明引入組氨酸標(biāo)簽不僅不會(huì)影響基因在酵母中的功能，并且有利于轉(zhuǎn)基因酵母的篩選和鑒定。

NAC轉(zhuǎn)錄因子一旦被激活，可以與基因啟動(dòng)子中的NAC識(shí)別序列（NACR）結(jié)合，通過調(diào)節(jié)下游非生物脅迫耐受性的靶基因轉(zhuǎn)錄從而提高植物的耐受性。本研究以轉(zhuǎn)pPIC9空載體酵母作為對(duì)照，比較MsNAC2和Ms-NAC3轉(zhuǎn)基因菌株A2、A3與CK的抗逆能力差異。試驗(yàn)結(jié)果表明，在鹽脅迫處理下A2、A3和CK具有明顯差異，酵母的成活率呈現(xiàn)出A＞A3＞CK的趨勢(shì)。在香蕉中用組成型啟動(dòng)子過表達(dá)MusaNAC68基因，其許多應(yīng)激反應(yīng)基因的表達(dá)量有所提高，包括DREB、CBF和LEA基因等，并提高了香蕉的耐鹽性[25]。根據(jù)XU等[26]的研究表明，馬鈴薯StNAC2基因可以響應(yīng)多種非生物脅迫和SA、AB的應(yīng)用誘導(dǎo)，其過度表達(dá)還賦予轉(zhuǎn)基因馬鈴薯植株耐旱和耐鹽性。類似的，菊花DgNAC1基因在轉(zhuǎn)基因煙草中的過度表達(dá)明顯增強(qiáng)了煙草對(duì)鹽的耐受性[27]。鷹嘴豆CANAC3基因和番茄SlNAC3的異源表達(dá)分別提高了轉(zhuǎn)基因楊樹和番茄的耐旱性和耐鹽性[28-29]。在番茄中沉默SlNAC11基因降低了番茄耐鹽性和耐旱性，并影響了一些生理指標(biāo)[30]。大多數(shù)NAC基因具有耐鹽和耐旱性，但在一些例子中也顯示了其具有耐溫度脅迫的能力。擬南芥中過度表達(dá)小麥TaNAC2L轉(zhuǎn)錄因子，可以激活下游AtHsfA3、AtDREB2A、LEA等熱相關(guān)基因的表達(dá)來增強(qiáng)植株耐熱性；在擬南芥植株中過度表達(dá)Gm-NAC20和GmNAC11基因分別增強(qiáng)了植株冷和鹽的耐受性，可能與這些基因參與DREB/CBF途徑和其他脅迫相關(guān)基因的交互作用導(dǎo)致的[31]。本研究中也對(duì)MsNAC2和MsNAC3基因響應(yīng)溫度脅迫進(jìn)行了試驗(yàn)，溫度脅迫處理下A2、A3和CK也同樣有顯著差異，在37℃和16℃條件下酵母的成活率呈現(xiàn)出A2＞A3＞CK的趨勢(shì)。本研究表明，紫花苜蓿MsNAC2和MsNAC3可以提高酵母的抗逆性，MsNAC2基因的抗逆功能優(yōu)于MsNAC3，推測(cè)可能與有轉(zhuǎn)錄激活功能又高度變異的C端有關(guān)。MsNAC2和MsNAC3基因能積極地響應(yīng)非生物脅迫應(yīng)答，Ms-NAC2和MsNAC3基因可作為植物逆境適應(yīng)機(jī)制研究的重要候選基因。