顧承真，高鈺杰，邱子宿，呂 晶，李 婷，曾任森

(1.福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院， 福建 福州 350002； 2.福建農(nóng)林大學(xué)作物科學(xué)學(xué)院作物抗性與化學(xué)生態(tài)學(xué)研究所， 福建 福州 350002)

香蕉枯萎病Fusarium wilt of banana主要是由尖孢鐮刀菌古巴?；虵usariumoxysporumf.sp.cubenseFOC引起的維管束病害，嚴(yán)重制約香蕉產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，其具有分布廣、發(fā)病快的特點(diǎn)，每年給香蕉產(chǎn)業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，也稱為香蕉的癌癥[1]。目前，主要通過化學(xué)防控[2]、輪作其他作物[3]、農(nóng)藝措施防控[4]和生物防控措施等[5]來應(yīng)對(duì)香蕉枯萎病的發(fā)生和危害?；瘜W(xué)農(nóng)藥防治效果比較直接、高效，易造成環(huán)境污染、農(nóng)藥殘留、食品安全和病原菌抗藥性增加等問題[6]；輪作會(huì)降低香蕉的經(jīng)濟(jì)收入[7]；通過香蕉-水稻輪作聯(lián)合添加有機(jī)肥料的農(nóng)藝措施[4]起不到很好的防治效果；生物防控大多采用生物有機(jī)肥料和菌劑來抑制病原菌，雖然不會(huì)帶來環(huán)境問題，但其效果并不穩(wěn)定[8]。目前，香蕉枯萎病還沒有較好的防治方法。

植物是生物活性化合物的天然寶庫(kù)，植物源農(nóng)藥的有效成分是植物的次生代謝產(chǎn)物，如生物堿類、黃酮類、萜類和酚類等。植物源農(nóng)藥具有易降解、不會(huì)造成環(huán)境污染、靶標(biāo)有害生物不易產(chǎn)生抗藥性、對(duì)非靶標(biāo)生物安全、防治農(nóng)作物病害效果穩(wěn)定等特點(diǎn)[9]。五爪金龍IpomoeacairicaLinn.Sweet為旋花科Convolvulaceae番薯屬 Ipomoea多年生藤本植物，主要分布在熱帶地區(qū)，在我國(guó)主要分布在南部，是外來入侵物種之一[10]。五爪金龍?jiān)谏L(zhǎng)過程中能夠產(chǎn)生大量的次生代謝產(chǎn)物，比如黃酮[11]、木脂素[12]、香豆素[12]、脂肪酸[13]、揮發(fā)油[14-15]等。這些次生代謝產(chǎn)物不僅具有十分重要的研究和應(yīng)用價(jià)值，還是五爪金龍入侵的武器。五爪金龍葉片水提取液可以使薇甘菊Mikaniamicrantha的葉綠素含量降低，從而抑制光合作用，并且對(duì)種子的萌發(fā)及根的生長(zhǎng)具有明顯的抑制效應(yīng)[16]。五爪金龍乙醇提取物對(duì)柑橘潛葉蛾P(guān)hyllocnistiscitrella的產(chǎn)卵具有驅(qū)避作用[17]，對(duì)于福壽螺Pomaceacanaliculata具有致死作用[18]。此外，五爪金龍?zhí)崛∥镞€具有體外抗腫瘤活性[19]，其中含有的異綠原酸具有鎮(zhèn)痛作用[20]。五爪金龍對(duì)農(nóng)作物病害及農(nóng)作物病原菌生長(zhǎng)的影響目前尚無報(bào)道。本課題組近期研究發(fā)現(xiàn)，五爪金龍乙醇提取物能較好地抑制香蕉枯萎病病原菌的生長(zhǎng)，但具有抗菌活性的化學(xué)物質(zhì)尚不清楚。因此，本研究對(duì)五爪金龍乙醇提取物化學(xué)成分進(jìn)行研究，以期從中找到具有抑制香蕉枯萎病病原菌的物質(zhì)基礎(chǔ)，為植物源綠色農(nóng)藥的開發(fā)提供先導(dǎo)化合物，并為五爪金龍的應(yīng)用和香蕉枯萎病的生物防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

五爪金龍于2017年6月采自福建農(nóng)林大學(xué)校園內(nèi)。香蕉枯萎病病原菌Fusariumoxysporumf.sp.cubenseFOC菌株由福建農(nóng)林大學(xué)農(nóng)學(xué)院提供。馬鈴薯購(gòu)于福建農(nóng)林大學(xué)愛購(gòu)超市，葡萄糖和瓊脂購(gòu)于貝爾曼公司。

1.2 試驗(yàn)儀器

核磁共振波譜儀(Bruker)、高分辨質(zhì)譜(Agilent)、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(東京理化器械株式會(huì)社)、超凈工作臺(tái)(蘇凈安泰VS-840K-U)、人工氣候箱(杭州綠博儀器)、高壓滅菌鍋(上海左樂儀器有限公司)。HP20SS樹脂(日本三菱)、硅膠(200～300目，青島海浪硅膠干燥劑廠)、MCI-gel CHP20P(75～100 μm，Mitsubishi Chemical Co.,Ltd.)、Rp-18(40～60 μm，Merck)。薄層層析用預(yù)制硅膠GF-254(青島海浪硅膠干燥劑廠)。

1.3 提取與分離

稱取五爪金龍干重1.5 kg，粉碎，用乙醇浸提24 h，過濾得濾液，重復(fù)提取3次，合并濾液、濃縮，得五爪金龍乙醇提取物浸膏(325.27 g)。用甲醇溶解浸膏，然后用石油醚進(jìn)行萃取，分別得到石油醚萃取層和甲醇層兩部分。甲醇層經(jīng)硅膠拌樣后上硅膠柱(d=12 cm，樣品柱高1 m)，用石油醚∶丙酮按不同梯度洗脫(30∶1、20∶1、10∶1、8∶1、6∶1、4∶1、2∶1、1∶1)，每個(gè)梯度沖10 L，洗脫下來的餾分用薄層層析板監(jiān)控，將顯色一致的部分合起來，得到8個(gè)部分：Fr.1～Fr.8。

Fr.4經(jīng)HP20SS、C18柱層析和Sephadex LH-20柱層析，得到化合物1(16 mg)。Fr.5經(jīng)HP20SS、C18柱層析和Sephadex LH-20柱層析，得到化合物2(11 mg)和化合物3(10 mg)。

1.4 抗菌活性測(cè)定

化合物濃度配制：分別稱取各個(gè)化合物1 mg于10 mL容量瓶中，定容，得到濃度為100 μg·mL-1的樣品。取濃度為100 μg·mL-1的樣品2 mL和1 mL，分別定容至4 mL，獲得濃度梯度為50 μg·mL-1和25 μg·mL-1的樣品。得到濃度分別為100、50、25 μg·mL-1的溶液。

培養(yǎng)基配制(PDA)：稱取去皮的土豆300 g，切碎加水400 mL蒸煮30 min，用紗布過濾得澄清濾液，加入葡萄糖、瓊脂粉各30 g，攪拌至充分溶解，定容至1 500 mL，置于高壓滅菌鍋中滅菌30 min，待用。

抑菌試驗(yàn)：將滅菌后的培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿中，冷卻，待用。將配制好的濃度為100、50、25 μg·mL-1樣品用0.2 μm濾膜過濾，分別取過濾后的樣品200 μL均勻涂到培養(yǎng)基上，每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)重復(fù)作為處理組，以均勻涂布200 μL甲醇的培養(yǎng)基作為對(duì)照。用打孔器將香蕉枯萎病病原菌的菌餅打成直徑0.5 cm的圓餅，將病原菌分別接到涂有單體化合物和甲醇的培養(yǎng)基上，封口，置于28℃、濕度RH為60%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d，每日觀察1次，觀察病原菌生長(zhǎng)情況，并拍照、記錄數(shù)據(jù)。

抑制率(%)=(r1-r2)/r1×100

式中，r1為對(duì)照培養(yǎng)基菌絲半徑(cm)，r2為50 μg·mL-1濃度培養(yǎng)基菌絲半徑(cm)。

2 結(jié)果與分析

2.1 化合物結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1為淡黃色針晶。從碳譜13C-NMR和DEPT譜上可以看出，化合物含有10個(gè)碳，包括1個(gè)甲氧基、4個(gè)次甲基和5個(gè)季碳。在13C-NMR譜圖上，化學(xué)位移為δC∶161.8處的峰，表明化合物1中含1個(gè)酯羰基。1H-NMR譜圖顯示4個(gè)烯氫δH：6.22、6.83、7.01、7.84。上述信息表明化合物1為香豆素類化合物，與文獻(xiàn)[21]數(shù)據(jù)比較確定化合物1為東莨菪亭內(nèi)酯(圖1)。

圖1 化合物1結(jié)構(gòu)圖

化合物1核磁數(shù)據(jù)為1H-NMR(CD3OD,400 MHz)δ：6.22 (1H,d,J=9.0 Hz,H-3),7.84(1H,d,J=9.0 Hz,H-4),6.83(1H,s,H-5),7.01(1H,s,H-8),3.83(3H, s, H-11)·13C-NMR(CD3OD,100 MHz)δ：161.8(C-2),113.4(C-3),143.5(C-4),110.2(C-5),145.9(C-6),145.3(C-7),102.7(C-8),111.8(C-9),149.6(C-10),56.1(C-11)。

化合物2為白色針晶，分子式為C7H6O5；化合物2核磁數(shù)據(jù)為1H-NMR(CD3OD,600 MHz)δ：6.88(2H,s,H-2/6),8.81(1H,s,HO-4),9.09(2H,s,HO-3/5),12.20(1H,s,-COOH).13C-NMR (CD3OD,150 MHz )δ：119.8(C-1),108.9(C-2),144.9(C-3),137.9(C-4),153.8(C-5),108.5(C-6),167.2(-COOH)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[22]報(bào)道數(shù)據(jù)一致，確定化合物2為沒食子酸。

化合物3為無色針狀晶體，與實(shí)驗(yàn)室分離得到β-谷甾醇對(duì)照品用相同溶劑系統(tǒng)進(jìn)行薄層鑒別，發(fā)現(xiàn)二者Rf值相同，確定化合物3為β-谷甾醇。

2.2 抑菌活性測(cè)試結(jié)果

抑菌活性測(cè)定5 d后觀察鐮刀菌生長(zhǎng)情況，發(fā)現(xiàn)東莨菪亭內(nèi)酯(化合物1)在50 μg·mL-1的濃度下可以明顯抑制香蕉枯萎病病原菌的生長(zhǎng)(圖2)，在100 μg·mL-1和25 μg·mL-1的濃度下對(duì)香蕉枯萎病病原菌的生長(zhǎng)沒有影響。沒食子酸(化合物2)和β-谷甾醇(化合物3)對(duì)香蕉枯萎病病原菌的生長(zhǎng)無明顯影響。

注：處理組為培養(yǎng)基表面涂抹200 μL單體化合物，對(duì)照組為培養(yǎng)基表面涂抹200 μL甲醇

3 結(jié)論與討論

本研究從入侵植物五爪金龍乙醇提取物中分離鑒定出3個(gè)單體化合物，其中東莨菪亭內(nèi)酯(化合物1)在50 μg·mL-1濃度下對(duì)香蕉枯萎病病原菌的生長(zhǎng)具有很好地抑制效果，有望開發(fā)成環(huán)境友好型的植物源生物農(nóng)藥，用于香蕉枯萎病的防治，并且為合成新型殺菌劑提供先導(dǎo)化合物。前期研究表明，東莨菪亭內(nèi)酯在五爪金龍莖中含量高達(dá)6 μg·g-1，對(duì)福壽螺具有很強(qiáng)的毒殺作用，其在50 μg·mL-1的濃度下對(duì)水稻和稗草幼苗的生長(zhǎng)具有促進(jìn)作用[23]。

傳統(tǒng)上認(rèn)為五爪金龍為入侵雜草，為有害植物。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)五爪金龍次生代謝產(chǎn)物具有抗作物病原菌的功能，研究結(jié)果可為五爪金龍的開發(fā)和應(yīng)用提供理論依據(jù)，并為香蕉枯萎病以及由尖孢鐮刀菌所引起的其他農(nóng)作物病害的防治提供了新的策略。香蕉枯萎病為土傳病害，五爪金龍根系分泌物中是否含有東莨菪亭內(nèi)酯以及其在根系分泌物中的含量、五爪金龍與香蕉間作是否能減輕香蕉枯萎病的發(fā)病率等問題仍有待于進(jìn)一步研究。