王 鵬，魯明會，邵梓涵，彭 洋，李正芹，普麗玲，李淑英

(玉溪師范學(xué)院化學(xué)生物與環(huán)境學(xué)院， 云南 玉溪 653100)

小麥?zhǔn)俏覈匾募Z食作物之一，其生長受較多因素影響。干旱是小麥生長過程中最常見的逆境因素，影響小麥產(chǎn)量與品質(zhì)，小麥在脅迫條件下的抗旱機(jī)理非常復(fù)雜。接種不同微生物對植物抗逆性提高有明顯效果，趙慧云等[1]通過斷水模擬干旱脅迫，研究根圍促生菌菌劑(枯草芽孢桿菌AR菌株、枯草芽孢桿SM菌株、枯草芽孢桿XY菌株和菌株合劑)處理對小麥幼幼苗抗旱性的生理機(jī)制。結(jié)果表明：在干旱脅迫條件下，經(jīng)不同根圍促生菌處理的小麥幼苗根冠比、葉片相對含水量、葉綠素含量、脯氨酸含量和根系活力均顯著高于對照 (CK1和CK2)，相對電導(dǎo)率和丙二醛含量顯著低于對照，說明在干旱脅迫下，接種不同根圍促生菌可增強(qiáng)小麥幼苗耐旱性，不同根圍促生菌誘導(dǎo)小麥幼苗抗旱能力有差異。植物內(nèi)生菌的應(yīng)用在植物抗逆性方面也有較多研究和成果[2-4]，植物內(nèi)生菌(Endophytes)包括內(nèi)生真菌、內(nèi)生細(xì)菌和放線菌，是一類新型微生物資源，在農(nóng)業(yè)和醫(yī)藥業(yè)上有潛在應(yīng)用價(jià)值，活性內(nèi)生菌次生代謝產(chǎn)物具有豐富的化學(xué)結(jié)構(gòu)多樣性和廣泛的生物活性，能夠促進(jìn)植物生長，提高植物對生物脅迫和非生物脅迫抗性等[5]。劉軍生等[6]從杠柳和草木樨分離，篩選出具有較高鎘抗性的內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行16S rDNA序列分析，對其Cd2+去除率、吲哚乙酸(IAA)活性、鐵載體活性和1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸(ACC)脫氨酶活性等生物學(xué)特性進(jìn)行研究，利用盆栽試驗(yàn)驗(yàn)證了杠柳和草木樨的內(nèi)生細(xì)菌能提高小麥幼苗耐鎘脅迫的能力。王軍衛(wèi)等[7]通過在外源脫水應(yīng)答轉(zhuǎn)錄因子DREB基因在轉(zhuǎn)基因小麥中的誘導(dǎo)型表達(dá)與抗干旱生理效果研究中，通過測定轉(zhuǎn)基因組與非轉(zhuǎn)基因組葉片脯氨酸含量可知，有16個(gè)轉(zhuǎn)基因株系的脯氨酸含量與非轉(zhuǎn)基因?qū)φ障啾?，脯氨酸含量增加相?dāng)顯著，其中10個(gè)株系的脯氨酸含量在1 100 μg·g-1以上，比對照提高了2倍多，利用逆境誘導(dǎo)型啟動子(rd29B)可以增強(qiáng)外源DREB基因的表達(dá)，能顯著改良小麥的抗旱性。通過生物方法來改變植物生理生化指標(biāo)，從而提高小麥抗旱性已成為一個(gè)研究的熱點(diǎn)。

本研究以小麥幼苗作為試驗(yàn)材料，水培條件下采用PEG-6000模擬干旱[8]脅迫培養(yǎng)，水培過程中接種從無花果漿汁中篩選到的1株活性內(nèi)生細(xì)菌Bacillusstrain(BF3252)。在接種無花果漿汁中的活性內(nèi)生細(xì)菌的條件下，通過測定小麥幼苗葉片中的丙二醛(MDA)、脯氨酸(Pro)、可溶性蛋白質(zhì)(SP)和可溶性糖(SS)等生理生化指標(biāo)變化，探究活性內(nèi)生細(xì)菌BF3252對模擬干旱(PEG-6000)脅迫條件下對小麥生長的緩解作用。本研究旨在研究無花果活性內(nèi)生細(xì)菌對模擬干旱條件下小麥抗逆性的影響以及脅迫條件下抗逆性的研究機(jī)制，為內(nèi)生細(xì)菌與植物抗逆性的關(guān)系提供了新的理論依據(jù)以及相關(guān)研究內(nèi)容。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

小麥種子：濟(jì)麥22號。內(nèi)生細(xì)菌：BacillusstrainBF3252，無花果漿汁內(nèi)分離得到，可產(chǎn)生活性成分為芽孢桿菌，芽孢形成時(shí)間為26 h。菌株：金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)，湖北保藏中心購買；大腸桿菌Escherichiacoli及變形桿菌P.vulgaris，本校微生物實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化鈉10 g，蒸餾水1 000 mL，121℃滅菌30 min后35℃恒溫?zé)o菌檢查24 h后備用。

發(fā)酵培養(yǎng)基：黃豆粉10 g，甘露醇10 g，水1 000 mL，pH 7.0～7.5。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.1小麥種子培養(yǎng) 取干凈的白瓷盤洗凈放置晾干備用，選取籽粒飽滿、完整有胚、無霉變的小麥種子，用8%次氯酸鈉溶液消毒30 min，然后浸泡12 h后播種，待小麥幼苗至10 cm左右(3～4 d)，用不同濃度PEG-6000模擬干旱脅迫培養(yǎng)及接種OD值≈1的BF3252懸菌液： CK(加蒸餾水)、加入BF3252菌懸液、加入20%PEG-6000、20%PEG-6000+BF3252菌懸液、加入30%PEG-6000、30%PEG-6000+BF3252菌懸液，加入量均為300 mL，1個(gè)對照和5個(gè)試驗(yàn)組。試驗(yàn)采用20%PEG-6000與30%PEG-6000進(jìn)行模擬干旱培養(yǎng)比較適宜[9]。從脅迫培養(yǎng)7 d開始測定SS、SP、Pro和MDA含量，每隔7 d測定1次，共測定3次，小麥幼苗培養(yǎng)周期為25 d左右。

1.3.2菌懸液的制備 在無菌操作臺用接種環(huán)將內(nèi)生菌接種到LB培養(yǎng)基中，置于120 r·min-130℃振蕩培養(yǎng)1～2 d后測內(nèi)生菌OD值，OD值≈1時(shí)可用于培養(yǎng)小麥。

1.3.3無花果活性內(nèi)生細(xì)菌BF3252活性成分測定 采用牛津杯瓊脂擴(kuò)散法檢測內(nèi)生細(xì)菌的抑菌效果：將BF3252接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中(接種量為3%)，37℃ 120 r·min-1搖床培養(yǎng)48 h。取活化好的3株指示菌(金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、變形桿菌)制成相應(yīng)菌懸液，作為指示菌來測定無花果內(nèi)生細(xì)菌的抑菌效果。每株分別取 0.5 mL，采用傾注法與培養(yǎng)基混合凝固后倒置37℃培養(yǎng)24 h，將有菌平板分成3個(gè)區(qū)域，分別用口徑與牛津杯大小相似的打孔器在培養(yǎng)基3個(gè)區(qū)域打3個(gè)孔，將孔中的培養(yǎng)基棄去，加上牛津杯。取發(fā)酵培養(yǎng)基中上層液體置于無菌離心管中，在4 000 r·min-1下離心30 min，用微量移液器吸取上清液200 uL置于牛津杯內(nèi)，每株3個(gè)平行，37℃培養(yǎng)48 h后測量抑菌圈大小。

1.3.2小麥葉片生理特征測定 可溶性糖(SS)含量采用3，5-二硝基水楊酸法測定[10]，波長520 nm；標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=1.614 7x+0.015 5，R2=0.994 5?？扇苄缘鞍踪|(zhì)(SP)含量采用考馬斯亮藍(lán)法[11]測定，波長595 nm；標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.214x-0.000 3，R2=0.995 2。脯氨酸(Pro)含量采用磺基水楊酸法[12]提取及測定小麥葉片脯氨酸，波長520 nm；標(biāo)準(zhǔn)曲線為：y=0.081 4x-0.010 7，R2=0.994 4。丙二醛(MDA)含量采用雙組分分光光度法測定，具體過程及計(jì)算參照文獻(xiàn)[12]進(jìn)行，略做調(diào)整。

2 結(jié)果與分析

2.1 內(nèi)生細(xì)菌BF3252代謝產(chǎn)物對3株指示菌的抑菌效果

從表1可知，內(nèi)生細(xì)菌BF3252產(chǎn)生的活性成分對3株指示菌生長均有一定的抑制作用，其中對金黃色葡萄球菌抑菌效果較好，對大腸桿菌和變形桿菌生長也有抑制作用，說明BF3252的代謝產(chǎn)物中可以產(chǎn)生抗菌活性成分。

表1 BF3252對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌及變形桿菌的抑菌活性

2.2 接種BF3252對PEG-6000脅迫培養(yǎng)小麥幼苗可溶性糖(SS)含量的影響

可溶性糖是植物體內(nèi)抵御干旱環(huán)境的一種重要滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)。從圖1可知，小麥幼苗葉片可溶性糖含量在加入PEG-6000和BF3252后呈現(xiàn)增加趨勢，培養(yǎng)至21 d時(shí)加入PEG-6000小麥幼苗中SS含量增加明顯，小麥幼苗中SS分別增加了248.36%(20%PEG-6000)、275.65%(30%PEG-6000)，說明PEG-6000模擬干旱脅迫對小麥的生長有較大影響；接入BF3252對小麥幼苗SS含量也有一定影響，脅迫培養(yǎng)至7、14、21 d時(shí)小麥幼苗中SS含量均高于CK，外源BF3252加入對小麥生長有影響。在加入PEG-6000同時(shí)接入BF3252菌懸液后小麥幼苗的SS含量提高，說明BF3252對小麥幼苗滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)可溶性糖具有調(diào)節(jié)作用，也說明BF3252對小麥幼苗生長具有緩解作用，修復(fù)作用在7 d時(shí)分別為31.78%(20%PEG-6000)和13.03%(30%PEG-6000)，14 d時(shí)分別為11.73%(20%PEG-6000)和5.42%(30%PEG-6000)，21 d時(shí)分別為4.45%(20%PEG-6000)和4.16%(30%PEG-6000)，表明BF3252對小麥幼苗的修復(fù)作用隨培養(yǎng)時(shí)間延長逐漸減弱，同時(shí)受PEG-6000脅迫濃度的影響，在PEG-6000濃度較低時(shí)(20%PEG-6000)BF3252的修復(fù)作用相對較強(qiáng)。

圖1 PEG-6000脅迫培養(yǎng)小麥葉片可溶性糖含量變化

2.3 接種BF3252對PEG-6000脅迫培養(yǎng)小麥幼苗可溶性蛋白質(zhì)(SP)含量的影響

蛋白質(zhì)是生命的物質(zhì)基礎(chǔ)，植物在逆境條件下通過可溶性蛋白合成的增加，直接參與其適應(yīng)逆境的過程。從圖4可知，CK組和接種了BF3252后小麥幼苗葉片中SP含量隨培養(yǎng)時(shí)間的延長呈現(xiàn)增加趨勢；PEG-6000脅迫培養(yǎng)及PEG-6000脅迫培養(yǎng)過程中接種BF3252小麥幼苗葉片中的SP含量均低于CK和接種BF3252試驗(yàn)組，可能與模擬脅迫培養(yǎng)所用PEG-6000濃度有關(guān)，本研究發(fā)現(xiàn)接種BF3252試驗(yàn)組SP含量略高于PEG-6000脅迫試驗(yàn)組，說明BF3252對小麥幼苗的生長具有調(diào)節(jié)作用，BF3252對提高小麥幼苗的抗性有一定作用，20%PEG-6000脅迫條件下修復(fù)效果為1.47%(7 d)、1.00%(14 d)、1.06%(21 d)；30%PEG-6000脅迫條件下修復(fù)效果為0.97%(7 d)、0.65%(14 d)、1.49%(21 d)。

圖2 PEG-6000脅迫培養(yǎng)小麥葉片可溶性蛋白質(zhì)含量變化

2.4 接種BF3252對PEG-6000脅迫培養(yǎng)小麥幼苗脯氨酸(Pro)含量的影響

脯氨酸(Pro)是可以與水分子相結(jié)合的一種滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)。在干旱脅迫下，植物中脯氨酸含量的增加可以減少水分的流失降低細(xì)胞的滲透勢，從而提高植物的抗旱性[13]。圖3顯示，接入BF3252和加入PEG-6000模擬干旱脅迫培養(yǎng)條件下，小麥幼苗葉片中的Pro含量均高于CK，其中接種BF3252對小麥抗性有一定提高，小麥幼苗培養(yǎng)至14 d時(shí)Pro含量最多，高于CK112.93；在20%PEG-6000和30%PEG-6000脅迫培養(yǎng)條件下及脅迫過程中接種BF3252后培養(yǎng)，小麥幼苗葉片Pro含量明顯增加，脅迫培養(yǎng)7 d和14 d時(shí)4個(gè)試驗(yàn)組Pro含量差異不明顯，脅迫培養(yǎng)至21 d時(shí)接種BF3252后小麥幼苗葉片Pro含量高于PEG-6000脅迫培養(yǎng)組，說明BF3252對PEG-6000脅迫培養(yǎng)有緩解作用，20%PEG-6000+BF3252、30%PEG-6000+BF3252修復(fù)效果分別為10.72%和17.84%。

圖3 PEG-6000脅迫培養(yǎng)小麥葉片Pro含量變化

2.5 接種BF3252對PEG-6000脅迫培養(yǎng)小麥幼苗丙二醛(MDA)含量的影響

植物器官在逆境(例如干旱等)下受到傷害，通常發(fā)生膜脂的過氧化作用，產(chǎn)生二烯共軛化合物、脂類過氧化合物、丙二醛和乙烯等，其中丙二醛(Malondialdehyde，MDA)是膜脂過氧化最重要的產(chǎn)物之一。常用丙二醛(MDA)含量評價(jià)植物膜脂過氧化反應(yīng)程度[14]，在干旱脅迫下，植物丙二醛含量增幅越小，抗旱性越強(qiáng)，反之抗旱性越弱[15]。圖4顯示，在PEG-6000模擬干旱脅迫培養(yǎng)條件下小麥葉片MDA含量顯著增加，20%PEG-6000脅迫條件下對小麥葉片MDA含量相對較高，接入BF3252后小麥葉片種的MDA含量有明顯降低，說明20%PEG-6000脅迫條件下接入BF3252(無花果活性內(nèi)生細(xì)菌)及直接接入BF3252對小麥生長有明顯的緩解作用，20%PEG-6000+BF3252修復(fù)效果表現(xiàn)為：229.73%(7 d)、201.59%(14 d)、106.90%(21 d)，修復(fù)效果隨培養(yǎng)時(shí)間延長而有所減弱；直接接入BF3252修復(fù)效果表現(xiàn)為：51.35%(7 d)、22.22%(14 d)、31.03%(21 d)。PEG-6000濃度達(dá)到30%時(shí)，小麥葉片MDA含量有增加且隨著培養(yǎng)時(shí)間延長呈現(xiàn)逐漸降低趨勢，接入BF3252后小麥葉片MDA含量高于30%PEG-6000直接脅迫條件下小麥葉片MD，說明高濃度PEG-6000(30%)影響了BF3252的生長，對小麥生長沒有緩解作用。

圖4 PEG6000脅迫培養(yǎng)小麥葉片丙二醛含量的變化

3 討論與結(jié)論

3.1 無花果活性內(nèi)生細(xì)菌BF3252對PEG-6000脅迫培養(yǎng)小麥生長有一定的緩解作用

李衛(wèi)芬等[16]發(fā)現(xiàn)在模擬干旱條件下的芥菜體內(nèi)的可溶性糖含量是隨PEG-6000滲透脅迫時(shí)間的延長而呈明顯增加趨勢，龔娜等[17]研究結(jié)果認(rèn)為外源內(nèi)生菌提取物AAC-2可使干旱脅迫下玉米幼苗SS含量增加11.29%。研究[18]表明，隨著干旱脅迫的加劇，鈴鐺刺幼苗體內(nèi)可溶性蛋白質(zhì)含量均呈現(xiàn)增加趨勢。有研究[19]表明，在干旱脅迫下，玉米幼苗內(nèi)脯氨酸積累，隨著脅迫時(shí)間的延長，玉米幼苗脯氨酸含量迅速升高。在鹽脅迫條件下，接種內(nèi)生細(xì)菌后，可以提高小麥體內(nèi)脯氨酸含量，清除細(xì)胞內(nèi)活性氧，維持細(xì)胞形態(tài)，提高小麥抵抗鹽脅迫能力，有利于提高小麥存活率，促進(jìn)了小麥生長[20]，本試驗(yàn)研究結(jié)果也呈現(xiàn)出相同變化趨勢。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同濃度PEG-6000(20%、30%)脅迫培養(yǎng)小麥后導(dǎo)致小麥葉片的SS、Pro、MDA含量增加，說明小麥在干旱逆境條件下，體內(nèi)會積累各種有機(jī)物質(zhì)和無機(jī)物質(zhì)來保持體內(nèi)的水分，以適應(yīng)干旱環(huán)境，再接入BF3252后小麥葉片中的SS、Pro、SP的含量有不同程度增加，MDA含量有所降低，無花果活性內(nèi)生細(xì)菌對 PEG-6000模擬干旱脅迫小麥的生長有修復(fù)作用，對低濃度PEG-6000(20%)脅迫培養(yǎng)后的小麥修復(fù)效果更明顯：修復(fù)7 d時(shí)SS達(dá)到最高，分別為31.78%(20%PEG-6000)和13.03%(30%PEG-6000)，SP修復(fù)效果為1.47%(20%PEG-6000)和0.97%(30%PEG-6000)，而21 d小麥葉片中的Pro最高，分別為10.72%(20%PEG-6000)和17.84%(30%PEG-6000)；當(dāng)PEG-6000濃度為20%時(shí)，接入BF3252小麥葉片的MDA降低明顯，修復(fù)作用分別達(dá)到229.73%(7 d)、201.59%(14 d)、106.90%(21 d)。本研究結(jié)果表明當(dāng)PEG-6000濃度為30%時(shí)影響了BF3252的生長，SP和MDA含量變化不明顯，MDA含量增加。

3.2 無花果活性內(nèi)生細(xì)菌BF3252可促進(jìn)小麥生長

本研究結(jié)果表明，小麥在生長過程中接入BF3252，小麥葉片中的SS、SP、Pro含量增加，而小麥葉片中MDA含量降低，內(nèi)生細(xì)菌與植物協(xié)調(diào)作用可改善植物生長環(huán)境，可促使植物生長及種群建立。內(nèi)生細(xì)菌和植物相互作用，也可協(xié)助植物建立植物的內(nèi)生態(tài)恢復(fù)系統(tǒng)，從而促進(jìn)植物根部發(fā)育、增加植物營養(yǎng)吸收或改善營養(yǎng)元素利用等手段增強(qiáng)植物利用土壤養(yǎng)分能力[21]，并且能夠提高小麥的環(huán)境脅迫耐性，從而減輕極端天氣對小麥生長產(chǎn)生的危害，促進(jìn)小麥幼苗的生長。本試驗(yàn)結(jié)果表明BF3252對干旱脅迫培養(yǎng)下的小麥幼苗生長有一定的緩解作用。