王 宇，趙予晗，焦安惠，王玉琪，高青山

(1.延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，延吉 133000；2.東北寒區(qū)肉牛科技創(chuàng)新教育部工程研究中心，延吉 133000;3.吉林省延邊黃牛種質(zhì)資源保護工程研究中心，延吉 133000)

乙草胺(acetochlor)又稱禾耐斯，化學(xué)式C14H20ClNO2，屬于酰胺類除草劑[1]，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中可用于清除一年生禾本科和闊葉雜草，如常被用于黃豆、玉米、棉花、花生等農(nóng)作物的除草。因其毒性小而且除草效果非常好，因而被廣泛使用。但隨著乙草胺的大量使用，土壤、河流、地表水中均可檢測出乙草胺的殘留[2]。長江流域、黑龍江流域、松花江流域等均檢出了乙草胺[3]，中國31個省會城市和25個二級城市水源水及出廠水中也有不同濃度的乙草胺被檢出[4]。同時大量研究表明，乙草胺具有細胞遺傳毒性、生殖發(fā)育毒性、消化系統(tǒng)毒性等。如劉陽等[5]研究表明，經(jīng)乙草胺處理后花背蟾蜍的蝌蚪期肝臟內(nèi)超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽(GSH)的表達量均降低，表明乙草胺對肝臟細胞具有氧化損傷作用。Song等[6]研究表明，乙草胺可能通過生殖細胞氧化應(yīng)激，促使發(fā)生ERK-p53-Bcl-2級聯(lián)反應(yīng)，進而誘導(dǎo)小鼠精原細胞(GC-1)凋亡。Zhang等[7]研究表明,低劑量乙草胺可誘導(dǎo)斑馬魚卵巢卵黃原蛋白(Vtg)合成，促進卵巢發(fā)育，而高劑量乙草胺則降低卵巢抵抗氧化應(yīng)激能力，破壞卵巢發(fā)育。

雖然已有研究證實乙草胺會對動物機體造成急性毒性、生殖發(fā)育毒性等，但國內(nèi)外關(guān)于乙草胺對生殖系統(tǒng)的研究僅局限于雄性哺乳動物生殖系統(tǒng)，對雌性哺乳類動物卵母細胞成熟相關(guān)方面尚不清楚。本試驗通過在體外培養(yǎng)液中添加不同濃度乙草胺，以期探究其對小鼠卵母細胞體外成熟的影響，為判定乙草胺的毒性及對動物和人類健康的危害提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗動物 雌性昆明小鼠60只，5～6周齡，體重20～24 g，健康狀況良好，購自延邊大學(xué)實驗動物中心。試驗前將小鼠置于延邊大學(xué)實驗動物中心鼠房飼養(yǎng)1周，適應(yīng)環(huán)境。飼養(yǎng)在20～23 ℃環(huán)境中，光照條件為12 h光照、12 h黑暗，自由飲食。

1.1.2 主要試劑及儀器 透明質(zhì)酸酶(Hy)、牛血清白蛋白(BSA)、礦物油、卵母細胞體外清洗液(M2)、M16、KSOM培養(yǎng)液均購自南京愛貝生物科技有限公司；活性氧(ROS)、谷胱甘肽(GSH)檢測試劑盒均購自ThermoFisher公司；孕馬血清促性腺激素(PMSG)購自寧波第二激素廠；乙草胺標(biāo)準(zhǔn)溶液購自上海恒遠生物科技有限公司；JC-1、RNA提取試劑盒均購自Invirtrogen公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Qiagen公司；實時熒光定量PCR試劑盒購自KAPA公司。體視顯微鏡(SZ61)購自O(shè)lympus公司；熒光顯微鏡(Ti-S)購自NIKON公司；CO2細胞培養(yǎng)箱(Heracell 150i)購自ThermoFisher公司；恒溫板(TP-UNI)購自TOKAI HIT公司；PCR儀(9902)購自Veriti公司。

1.2 方法

1.2.1 卵母細胞采集與培養(yǎng) 將小鼠腹腔注射10 IU PMSG，48 h后使用脫臼處死法處死，分離卵巢并置于M2液中。隨后在體視顯微鏡下，用1 mL注射器針頭刺破卵泡收集卵丘-卵母細胞復(fù)合體(COCs)，用M2液清洗COCs 3遍后，將COCs分別轉(zhuǎn)移至含有0(對照組)、10、50、100、130、200 μmol/L乙草胺的M16液中體外成熟培養(yǎng)14 h。

1.2.2 第一極體排出率統(tǒng)計 將培養(yǎng)14 h后的COCs用0.1%透明質(zhì)酸酶去除卵丘，1% BSA-PBS清洗4次后，在體視顯微鏡下觀察，統(tǒng)計排出第一極體的卵母細胞數(shù)量。

1.2.3 卵母細胞體外受精與培養(yǎng) 將雄鼠使用頸椎脫臼法處死，采用無菌操作法摘取附睪尾采集精子，并放入裝有精子獲能液(TYH)的培養(yǎng)皿中，放于培養(yǎng)箱進行獲能。將體外培養(yǎng)14 h后的各組COCs取出，精子用體外受精液(HTF)清洗3次，放入已提前平衡的培養(yǎng)小滴(20 μL)，加入20 μL密度為106/mL已獲能的精子。6 h后將受精卵取出，加入少量0.1%透明質(zhì)酸酶進行吹打，用KSOM培養(yǎng)液清洗3次后用KSOM培養(yǎng)液進行培養(yǎng)，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)96 h，統(tǒng)計各組囊胚率。通過第一極體排出率及囊胚率，篩選出適宜濃度的乙草胺用于后續(xù)試驗。

1.2.4 囊胚細胞總數(shù)和細胞凋亡率測定 將培養(yǎng)96 h的囊胚用1% BSA-PBS清洗3次后放入3.7%多聚甲醛中室溫固定15 min，用1% BSA-PBS清洗4次后放入0.1% Triton X-100中37 ℃透膜15 min，用1% BSA-PBS清洗4次放入熒光素復(fù)合劑(Fluorescein-dUTP)避光孵育1 h，用1% BSA-PBS清洗3次放入Hoechst 33342染色劑37 ℃避光孵育35 min，用1% BSA-PBS清洗3次，放于載玻片，封片進行拍照，ImageJ 1.48軟件統(tǒng)計分析。

1.2.5 卵母細胞ROS、GSH、MMP水平的檢測 將在對照組及篩選出的適宜乙草胺濃度組培養(yǎng)液中培養(yǎng)14 h的COCs用0.1%透明質(zhì)酸酶去除卵丘，用1% BSA-PBS清洗3次，隨后分別放入DCFH-DA、CMF2HC、JC-1染色液中，37 ℃避光孵育25 min，用1% BSA-PBS清洗4次后，分別放在熒光顯微鏡下拍照并用ImageJ 1.48軟件進行熒光強度分析。

1.2.6 卵母細胞凋亡相關(guān)基因表達量的檢測 將在對照組及篩選出的適宜乙草胺濃度組培養(yǎng)液中培養(yǎng)14 h的COCs用0.1%透明質(zhì)酸酶去除卵丘，用1% BSA-PBS清洗3次，用RNA提取試劑盒提取各組卵母細胞的總RNA并反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。根據(jù)GenBank中半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-9(Caspase-9)、B細胞淋巴瘤-2(Bcl-2)、B細胞淋巴瘤-xl(Bcl-xl)基因的序列，用Primer Premier 3.0軟件設(shè)計實時熒光定量PCR引物，引物信息見表1。引物均由深圳華大基因股份有限公司合成。實時熒光定量PCR反應(yīng)體系20 μL：cDNA(80 ng/μL)2 μL，上、下游引物各0.5 μL，SYBR Green 10 μL，KSF ROX High 0.2 μL，KSF ROX LOW 0.2 μL，ddH2O 6.6 μL。PCR反應(yīng)程序：95 ℃ 20 s；95 ℃ 3 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 1 s，共40個循環(huán)。用2-ΔΔCt法計算各基因的相對表達量。

表1 引物信息Table 1 Primer information

1.2.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析 每個試驗至少重復(fù)3次。采用SPSS 19.0軟件進行單因素方差分析，用LSD法進行組間多重比較。P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié) 果

2.1 乙草胺對小鼠卵母細胞第一極體排出率的影響

與對照組相比，10、50 μmol/L乙草胺組卵母細胞第一極體排出率無顯著差異(P>0.05)；100、130、200 μmol/L乙草胺組卵母細胞第一極體排出率顯著降低(P<0.05)(圖1)。

2.2 乙草胺對小鼠早期胚胎發(fā)育能力的影響

由圖2可知，與對照組相比，10、50 μmol/L乙草胺組囊胚率無顯著差異(P>0.05)，100、130 μmol/L乙草胺組囊胚率顯著降低(P<0.05)，200 μmol/L乙草胺組體外受精胚胎未發(fā)育到囊胚期。由于100、130 μmol/L乙草胺不僅可以使卵母細胞第一極體排出率顯著降低，而且卵母細胞受精后可發(fā)育為囊胚，因此用于后續(xù)研究。

數(shù)據(jù)肩標(biāo)不同字母表示差異顯著(P<0.05)；肩標(biāo)相同字母表示差異不顯著(P>0.05)。下同 Values with different letter superscripts mean significant difference (P<0.05)；While with the same letter superscripts mean no significant difference (P>0.05).The same as below圖1 各組小鼠卵母細胞第一極體排出率Fig.1 The first polar body excretion rates of mice in each group

2.3 乙草胺對小鼠卵母細胞ROS水平的影響

與對照組相比，100、130 μmol/L乙草胺組ROS水平顯著升高(P<0.05)，100與130 μmol/L乙草胺組間無顯著差異(P>0.05)(圖3)。

A～C，分別代表對照組、100和130 μmol/L乙草胺組ROS水平染色圖片(100×)；D，各組ROS水平 A-C,The ROS staining pictures of the control group,100 and 130 μmol/L acetochlor groups,respectively (100×);D,ROS levels in each group圖3 各組小鼠卵母細胞ROS水平Fig.3 ROS levels of mouse oocytes in each group

2.4 乙草胺對小鼠卵母細胞GSH水平的影響

與對照組相比，100、130 μmol/L乙草胺組GSH水平顯著降低(P<0.05)，100與130 μmol/L乙草胺組間無顯著差異(P>0.05)(圖4)。

A～C，分別代表對照組、100和130 μmol/L乙草胺組GSH水平染色圖片(100×)；D，各組GSH水平 A-C,Represent the GSH staining pictures of the control group,100 μmol/L and 130 μmol/L acetochlor groups,respectively (100×);D,GSH levels in each group圖4 各組小鼠卵母細胞GSH水平Fig.4 GSH levels of mouse oocytes in each group

2.5 乙草胺對小鼠卵母細胞MMP水平的影響

與對照組相比，100、130 μmol/L乙草胺組MMP水平顯著降低(P<0.05)，且130 μmol/L乙草胺組卵母細胞MMP水平顯著低于100 μmol/L乙草胺組(P<0.05)(圖5)。

A，對照組、100和130 μmol/L乙草胺組MMP水平染色圖片(200×)；B，各組MMP水平 A,The staining pictures of MMP levels in control group,100 and 130 μmol/L acetochlor groups (200×);B,MMP levels in each group圖5 各組小鼠卵母細胞MMP水平Fig.5 MMP levels of mouse oocytes in each group

2.6 乙草胺對小鼠卵母細胞凋亡相關(guān)基因表達的影響

與對照組相比，100、130 μmol/L乙草胺組卵母細胞Caspase-9基因相對表達量顯著高于對照組(P<0.05)；100、130 μmol/L乙草胺組卵母細胞Bcl-2、Bcl-xl基因相對表達量顯著低于對照組(P<0.05)(圖6)。

2.7 乙草胺對小鼠早期胚胎發(fā)育質(zhì)量的影響

與對照組相比，100、130 μmol/L乙草胺組囊胚細胞總數(shù)顯著降低(P<0.05)，且130 μmol/L 乙草胺組囊胚細胞總數(shù)顯著低于100 μmol/L乙草胺組(P<0.05)；100、130 μmol/L乙草胺組囊胚內(nèi)細胞凋亡率顯著升高(P<0.05)，且130 μmol/L 乙草胺組囊胚內(nèi)細胞凋亡率顯著高于100 μmol/L乙草胺組(P<0.05)(圖7)。

圖6 各組小鼠卵母細胞凋亡相關(guān)基因的相對表達量Fig.6 Relative expression of apoptosis-related genes in mouse oocytes in each group

①A，對照組、100和130 μmol/L乙草胺組囊胚Hoechst 33342和Tunnel染色(400×)；B，各組囊胚內(nèi)細胞團細胞數(shù)；C，各組細胞凋亡率。②箭頭代表凋亡細胞 ①A,Blastocyst Hoechst 33342 and Tunnel staining were performed in control group and 100 and 130 μmol/L acetochlor groups (400×);B,The number of cells in the blastocyst inner cell mass in each group;C,The apoptosis rate in each group.②Arrows represent apoptotic cells圖7 各組小鼠囊胚細胞總數(shù)及細胞凋亡率Fig.7 The total number of blastocyst cells and the apoptosis rate of mouse blastocysts in each group

3 討 論

輔助生殖技術(shù)在當(dāng)今社會迅速發(fā)展，卵母細胞排出第一極體作為判斷卵母細胞是否成熟的重要標(biāo)準(zhǔn)[8]，是后期胚胎形成的關(guān)鍵前提[9-10]。本試驗首先研究了不同濃度乙草胺對小鼠卵母細胞成熟的情況，結(jié)果表明，100、130、200 μmol/L乙草胺組卵母細胞第一極體排出率顯著低于對照組，說明乙草胺可能阻滯了卵母細胞成熟的進程。進一步將卵母細胞進行體外受精，發(fā)現(xiàn)100、130 μmol/L乙草胺組囊胚率顯著低于對照組，200 μmol/L乙草胺組未發(fā)育到囊胚期，這可能是由于乙草胺對卵母細胞的毒性作用導(dǎo)致的。將囊胚進行dUTP和Hoechst 33342染色，結(jié)果顯示，100、130 μmol/L乙草胺組囊胚細胞總數(shù)比對照組顯著降低，100、130 μmol/L乙草胺組囊胚內(nèi)細胞凋亡率比對照組顯著升高，說明乙草胺對小鼠卵母細胞的成熟具有毒性作用，并且這種毒性作用將持續(xù)影響卵母細胞受精后的發(fā)育潛力。楊曉梅等[11]研究表明，不同濃度乙草胺對中華大蟾蜍不同時期的早期胚胎均具有明顯致死作用，與本試驗結(jié)果相符。因此，在體外培養(yǎng)過程中添加100 μmol/L乙草胺即可降低卵母細胞成熟和后期胚胎發(fā)育潛能。

氧化應(yīng)激是影響卵母細胞成熟的主要因素之一，絕大多數(shù)農(nóng)藥的殘留會導(dǎo)致動物機體產(chǎn)生氧化應(yīng)激[12-14]。ROS的形成是生命機體基礎(chǔ)代謝所產(chǎn)生的正?，F(xiàn)象，但是過量ROS會破壞機體氧化還原平衡，線粒體功能損傷和細胞凋亡[15]。本試驗結(jié)果表明，100、130 μmol/L乙草胺組卵母細胞ROS水平顯著高于對照組，說明乙草胺可以誘導(dǎo)小鼠卵母細胞發(fā)生氧化應(yīng)激。GSH在細胞氧化還原平衡維持中發(fā)揮重要作用，參與清除機體內(nèi)過量ROS，具有天然的抗氧化功能[16]。本試驗結(jié)果表明，100、130 μmol/L乙草胺組GSH水平顯著低于對照組，說明乙草胺破壞了小鼠卵母細胞的氧化平衡狀態(tài)。蔣青桃等[17]研究表明，乙草胺對小鼠氧化應(yīng)激促進精原細胞的死亡；李龍雪等[18]研究表明，乙草胺通過引起大鼠肝臟細胞的氧化應(yīng)激，促進肝臟損傷。這些研究結(jié)果與本試驗研究結(jié)果相符，說明乙草胺可以改變細胞氧化-還原穩(wěn)態(tài)的作用，也揭示了乙草胺導(dǎo)致卵母細胞發(fā)育阻滯的內(nèi)在原因。當(dāng)細胞產(chǎn)生氧化應(yīng)激時，細胞中的線粒體功能會受到損傷。線粒體是完成細胞內(nèi)能量轉(zhuǎn)換的重要場所，參與細胞內(nèi)氧化-還原平衡及信號傳導(dǎo)[19-20]。MMP水平的高低會影響細胞的生存能力[21]。Torner等[22]研究表明，在卵母細胞體外成熟過程中存在著活躍線粒體分布變化，并且線粒體在胞質(zhì)中的分布狀態(tài)與卵母細胞質(zhì)量直接相關(guān)。本試驗結(jié)果表明，100、130 μmol/L乙草胺組卵母細胞MMP水平顯著降低，表明100 μmol/L乙草胺即可引起的線粒體膜電位障礙，從而干擾卵母細胞成熟。

細胞凋亡是基因控制下的細胞程序性死亡，用于選擇清除衰老或變異的細胞[23]。據(jù)報道，接觸乙草胺會促使小鼠睪丸細胞產(chǎn)生凋亡[24]。本研究結(jié)果顯示，100、130 μmol/L乙草胺組小鼠卵母細胞促凋亡基因Caspase-9的轉(zhuǎn)錄水平顯著升高，抗凋亡基因Bcl-xl及Bcl-2轉(zhuǎn)錄水平顯著降低。這表明100 μmol/L乙草胺即可通過影響凋亡相關(guān)因子mRNA的轉(zhuǎn)錄水平降低卵母細胞的質(zhì)量。

4 結(jié) 論

在卵母細胞體外成熟過程中添加100 μmol/L乙草胺即可降低卵母細胞第一極體排出率，產(chǎn)生高水平的ROS、造成線粒體功能損傷及細胞凋亡，推測這是乙草胺暴露導(dǎo)致卵母細胞發(fā)育阻滯的潛在機制，結(jié)果可為研究體內(nèi)乙草胺對卵母細胞質(zhì)量的影響提供參考。