譚亞紅， 高利娟， 宋文霞， 盧雪梅

(山東大學(xué)微生物技術(shù)國家重點實驗室， 青島266237)

蛋白質(zhì)糖基化是碳水化合物與氨基酸殘基共價結(jié)合的過程，是自然界中最豐富的翻譯后修飾[1]。蛋白質(zhì)糖基化主要包括聚糖共價連接到Asn殘基(有的物種連接到Arg殘基[2])的N-糖基化[3]，或者連接到Ser或Thr殘基的O-糖基化[4]。蛋白質(zhì)糖基化過程一般有兩種途徑：一種是依賴OST(oligosaccharyltransferase, OST)將組裝在脂質(zhì)載體上的寡糖(lipid-linked oligosaccharide, LLO)整體轉(zhuǎn)移到受體蛋白上；另一種是不依賴OST而是由N-或O-糖基轉(zhuǎn)移酶將單糖依次添加到受體蛋白上。

N-糖基化是一種常見的糖基化類型。在真核生物中，N-糖基化影響蛋白質(zhì)的折疊、穩(wěn)定性、分選和運輸?shù)萚5]，對蛋白質(zhì)發(fā)揮功能十分重要。在細菌中，N-糖基化主要與細菌的致病性、黏附性和環(huán)境適應(yīng)性等有關(guān)[6]。在古菌中，N-糖基化在菌毛[7]和S-層蛋白的組裝以及適應(yīng)環(huán)境變化方面起著重要作用[8]。隨著對N-糖基化的重要作用的認識，相關(guān)領(lǐng)域逐漸成為研究者們關(guān)注的熱點。雖然蛋白質(zhì)N-糖基化在真核生物中已廣泛研究，但原核生物比真核生物具有更多樣的糖基化途徑以及更復(fù)雜的聚糖結(jié)構(gòu)，對原核生物蛋白質(zhì)N-糖基化的了解仍然有限。現(xiàn)就原核生物蛋白質(zhì)N-糖基化的研究進展進行綜述。

1 細菌的N-糖基化

1.1 聚糖連接到Asn殘基的N-糖基化

1.1.1 依賴OST的N-糖基化

迄今為止，細菌中研究最多的是Campylobacterjejuni的N-糖基化系統(tǒng)。C.jejuni是革蘭氏陰性菌，屬于ε-變形菌綱，是人類腸胃炎的病原體。C.jejuni是第一個被發(fā)現(xiàn)存在N-糖基化系統(tǒng)的細菌，有80多種蛋白質(zhì)被N-糖基化[9]。C.jejuni的蛋白N-糖基化過程：細胞質(zhì)中的UDP-GlcNAc依次經(jīng)過脫水酶PglF、氨基轉(zhuǎn)移酶PglE、乙?；D(zhuǎn)移酶PglD催化生成UDP-2,4-diacetamido-Bacillosamine(也稱為UDP-diNAcBac)，再由糖基轉(zhuǎn)移酶PglC轉(zhuǎn)移到脂質(zhì)載體十一烯基焦磷酸(undecaprenyl pyrophosphate, Und-PP)，隨后糖基轉(zhuǎn)移酶PglA、PglJ、PglH以及PglI向其依次添加不同的單糖形成LLO[Und-PP-GlcGalNAc5Bac]，LLO通過翻轉(zhuǎn)酶PglK轉(zhuǎn)移到周質(zhì)空間后，由寡糖基轉(zhuǎn)移酶PglB將寡糖釋放到周質(zhì)中[10]或者轉(zhuǎn)移到受體蛋白序列Asp/Glu-X1-Asn-X2-Ser/Thr(X1和X2是除Pro以外的任意氨基酸殘基)的Asn殘基上[11][圖1(a)]。這些參與N-糖基化過程的酶由pgl基因簇編碼。在C.jejuni中，N-糖基化途徑的破壞會影響其致病性、硝酸還原酶活性、蛋白質(zhì)穩(wěn)定性、營養(yǎng)轉(zhuǎn)運、應(yīng)激反應(yīng)和抗菌素耐藥性[12-13]。

(a)Campylobacter jejuni的N-糖基化途徑；(b)Haemophilus influenzae的N-糖基化途徑；(c)NleB/SseK介導(dǎo)的精氨酸N-GlcNAc糖基化途徑；(d)Shewanellaoneidensis的N-糖基化途徑。圖1 細菌的蛋白質(zhì)N-糖基化途徑Figure 1 Overview of the pathway of bacterial protein N-glycosylation

在其他的ε-變形菌中也發(fā)現(xiàn)了與C.jejuni同源的pgl基因簇，包括一些Campylobacter和3個Helicobacter物種(Helicobacterpullorum、Helicobactercanadensis、Helicobacterwinghamensis)[14]，與Campylobacter明顯不同的是Helicobacter的pgl基因分散在5個基因簇中，并且有2個pglB基因，研究還發(fā)現(xiàn)Helicobacter可能存在2種N-糖基化途徑：一種是與C.jejuni類似的依賴PglB1的N-糖基化途徑；另一種是依賴PglB2的糖基化方式[15]。這暗示了Helicobacter的N-糖基化系統(tǒng)可能比C.jejuni更為復(fù)雜。此外，在Desulfovibriodesulfuricans[16]、Nitratiruptortergarcus和Sulfurovumlithotrophicum[17]中也發(fā)現(xiàn)了PglB的同源蛋白，但這些PglBs識別的受體蛋白序列和聚糖結(jié)構(gòu)有所不同。尚未在革蘭氏陽性菌中發(fā)現(xiàn)類似的N-糖基化系統(tǒng)。

1.1.2 不依賴OST的N-糖基化

與ε-變形菌綱中發(fā)現(xiàn)的N-糖基化系統(tǒng)不同，β-和γ-變形菌綱中存在另一種N-糖基化系統(tǒng)。在病原菌Haemophilusinfluenzae的細胞質(zhì)中，糖基轉(zhuǎn)移酶HMW1C將UDP-Glc和UDP-Gal轉(zhuǎn)移至黏附素HMW1的Asn-X-Ser/Thr(X≠Pro)序列上使HMW1發(fā)生N-糖基化修飾[18][圖1(b)]。病原菌Actinobacilluspleuropneumoniae的N-糖基化途徑與H.influenzae相似，區(qū)別僅在于H.influenzae的HMW1C既可催化UDP-Glc或UDP-Gal與 HMW1的連接，又能在HMW1連接的Glc上連接另一個己糖，而A.pleuropneumoniae存在共轉(zhuǎn)錄的N-糖基轉(zhuǎn)移酶(N-linking glycosyltransferase,NGT)和輔助糖基轉(zhuǎn)移酶(accessory glycosyltransferase,AGT)，其中NGT 利用Glc對黏附蛋白進行糖基化，AGT則負責(zé)將己糖添加到糖蛋白連接的Glc上[19]。其他病原菌如Kingellakingae和Aggregatibacteraphrophilus也具有HMW1C同源蛋白，能將己糖轉(zhuǎn)移到黏附蛋白上[20]。這些病原菌中修飾蛋白的碳水化合物是己糖而不是N-乙?；牵⑶姨腔娜笔绊懖≡鷮λ拗骷毎酿じ?。

1.2 N-GlcNAc或Rha連接到Arg殘基的N-糖基化

1.2.1 N-GlcNAc糖基化

許多革蘭氏陰性病原菌通過Ⅲ型分泌系統(tǒng)將具有糖基轉(zhuǎn)移酶活性的效應(yīng)子注入宿主細胞的細胞質(zhì)中，包括存在Citrobacterrodentium和腸致病性Escherichiacoli中的NleB以及存在Salmonellaentericaserovar Typhimurium的SseK[2]。NleB/SseK在宿主細胞中將UDP-GlcNAc共價連接到宿主含有死亡結(jié)構(gòu)域銜接蛋白的保守Arg殘基上[圖1(c)]，蛋白被糖基化后不能形成死亡誘導(dǎo)信號復(fù)合物，使宿主細胞凋亡或壞死的信號傳導(dǎo)受阻[21]。此外，NleB/SseK催化的Arg糖基化還能促進病原菌在腸道上皮附著[22]。

1.2.2 Rha糖基化

在核糖體將mRNA序列翻譯成多肽鏈的過程中，多聚Pro序列會導(dǎo)致翻譯停滯，細菌中存在翻譯延伸因子P(elongation factor P, EF-P)，EF-P可以與核糖體結(jié)合來刺激肽鍵的形成從而使翻譯繼續(xù)進行[23]。Shewanellaoneidensis存在一種獨特修飾策略激活EF-P：糖基轉(zhuǎn)移酶EarP將dTDP-β-L-Rha轉(zhuǎn)移到EF-P的Arg32以激活EF-P的功能[圖1(d)][24]。在Pseudomonasaeruginosa[25]和Neisseriameningitidis[26]中也存在這種修飾。研究表明EF-P和EarP的缺失會影響病原菌毒力因子的翻譯從而導(dǎo)致病原菌毒性降低。此外，研究還發(fā)現(xiàn)EF-P的三維結(jié)構(gòu)主要由凸面組成，而EarP具有底物結(jié)合口袋，更易與抗菌藥物結(jié)合[27]。因此，將EarP作為治療靶點進行研究不失為一個對抗病原菌感染的新思路。

1.3 Cytophaga hutchinsonii中的N-糖基化

此前，細菌N-糖基化系統(tǒng)僅在變形菌門中發(fā)現(xiàn)，最近在研究中發(fā)現(xiàn)擬桿菌門中的C.hutchinsonii也具有N-糖基化系統(tǒng)[28]。研究發(fā)現(xiàn)參與C.hutchinsonii蛋白質(zhì)N-糖基化的糖基轉(zhuǎn)移酶chu_3842是C.jejuni的pglA的同源基因，并且C.hutchinsonii的N-糖基化也發(fā)生在周質(zhì)空間。C.hutchinsonii的N-糖蛋白對能切割N-糖鏈的N-糖苷酶敏感，而C.jejuni的N-糖蛋白連接的寡糖鏈含有獨特的diNAcBac故不能被N-糖苷酶切割。研究表明C.hutchinsonii的N-糖基化受體序列是Asn-X-Ser/Thr(X≠Pro)，這也與C.jejuni不同。此外，還發(fā)現(xiàn)C.hutchinsonii的N-糖基化對蛋白的運輸和定位有重要影響，這與真核生物類似，但之前的研究顯示真核生物N-糖基化的這些功能并不適用于細菌，因此，這項研究豐富了對細菌中N-糖基化的生物學(xué)作用的了解。

2 古菌的N-糖基化

古菌最為人所知的是其在極端環(huán)境中的生存能力。在極端環(huán)境中，古菌不僅能保持細胞表面完整，還能執(zhí)行各種正常的生理功能。古菌的細胞表面有高度多樣化的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，然而，對古菌中細胞表面結(jié)構(gòu)的認識僅限于S-層和菌毛：S-層糖蛋白可形成一種有孔的晶格狀單分子層包被在細胞外，以維持細胞形態(tài)；菌毛可以介導(dǎo)古菌的表面附著和運動能力，并在生物膜形成、DNA交換和細胞間通信中發(fā)揮作用[29]。古菌的細胞表面蛋白主要被N-聚糖修飾，而在細菌中O-糖基化是細胞表面蛋白糖基化的主要形式。

迄今為止，對古菌N-糖基化途徑的了解仍然有限，僅對少數(shù)物種進行了描述。類似于真核生物和細菌，古菌的N-聚糖由糖基轉(zhuǎn)移酶在多萜醇磷酸載體上裝配，再翻轉(zhuǎn)至細胞膜外側(cè)由寡糖基轉(zhuǎn)移酶AglB轉(zhuǎn)至蛋白的Asn-X-Ser/Thr(X≠Pro)序列的Asn殘基上[30]。然而，古菌中N-聚糖的結(jié)構(gòu)和組成是高度多樣化的，表明古菌N-糖基化過程的多樣性[31]，這是真核生物或細菌所不具有的。Haloferaxvolcanii[32]有兩種不同的N-糖基化途徑，并且可以用不同的聚糖同時修飾相同的糖蛋白，同一蛋白也可結(jié)合一種聚糖類型的不完全聚糖前體，這些蛋白廣泛多樣的糖基化修飾可能與古菌在極端的pH、溫度或鹽度以及其他惡劣的環(huán)境中生長有關(guān)。然而，關(guān)于這些交替的N-糖基化途徑的調(diào)控尚待確定。

3 OST的結(jié)構(gòu)

N-糖基化途徑中最保守的成分是OST。真核生物的OST復(fù)合物含有多個亞基，其催化亞基為Stt3[33]，與細菌和古菌中的PglB和AglB同源。盡管所有OSTs的序列保守性非常低，但在結(jié)構(gòu)和寡糖轉(zhuǎn)移機制上很相似。Stt3/AglB/PglB蛋白的晶體結(jié)構(gòu)揭示了它們的主要序列包括N端的13個跨膜(transmembrane,TM)域和C端的可溶性球狀結(jié)構(gòu)域，還有一些保守的短氨基酸基序，包括N端TM域的EL1(external loop, EL)和EL2上的兩個DXD基序以及EL5上的SVSE/TIXE 基序，C端球狀結(jié)構(gòu)域的WWD和DK/MI 基序[34](表1)。研究表明OSTs的寡糖轉(zhuǎn)移機制是OSTs的WWD基序中Asp殘基的羧基特異性結(jié)合受體序列Ser/Thr殘基的羥基，TM域中的DXD基序與二價金屬離子形成催化結(jié)構(gòu)并激活受體序列Asn殘基的側(cè)鏈氮原子，活化的酰胺氮攻擊LLO糖上的異頭碳從而使聚糖連接到蛋白上[35]。PglB[36]和AglB[37]中無序的EL5結(jié)合聚糖底物后會變得有序，研究者提出PglB中無序的EL5可促進聚糖底物轉(zhuǎn)移至催化位點，而酵母的聚糖底物比細菌的要大得多，不能通過無序的EL5進入催化位點[33]。

研究表明，C.jejuni的PglB也是一種糖蛋白，它能通過WWDYG基序催化自身DYNQS序列的糖基化[38]，但PglB的活性不受其糖基化位點的影響，未糖基化的PglB仍然能夠轉(zhuǎn)移聚糖。Campylobacter屬的PglB都具有WWDYG和糖基化基序，而大多數(shù)真核生物的STT3和古菌中的AglB僅含有WWD基序，其他細菌的PglB同源物也基本不存在WWD和糖基化基序。

4 N-聚糖的受體序列

細菌中Campylobacter屬的N-糖基化受體序列一般為Asp/Glu-X1-Asn-X2-Ser/Thr(X1,X2≠Pro)，而其他細菌和古菌的N-糖基化受體序列都是Asn-X-Ser/Thr(X≠Pro)[39]。研究表明Pro能破壞蛋白的二級結(jié)構(gòu)并導(dǎo)致多肽鏈扭結(jié)，故受體序列的X位不存在Pro殘基[40]。由此可以看出，Asn-X-Ser / Thr序列(X≠Pro)是蛋白質(zhì)N-糖基化通用的受體序列。

5 OST的聚糖底物特異性

在大多數(shù)真核生物中，聚糖結(jié)構(gòu)為Glc3Man9GlcNAc2[41]。細菌和古菌利用的聚糖類型因物種而異。細菌的PglB可以轉(zhuǎn)移多種聚糖底物，但是C.jejuni的糖底物需滿足以下條件：還原末端第一個糖的C2位有乙酰化修飾，并且還原末端前兩個糖基的連接方式不能是β1-4連接[42]。古菌中的聚糖種類非常復(fù)雜。Archaeoglobusfulgidus的N-聚糖僅由己糖殘基組成[43]，此外，屬于古菌泉古菌門的Pyrobaculumcalidifontis的N-聚糖是高甘露糖型寡糖[44]，這與真核生物的N-聚糖結(jié)構(gòu)相似。至于聚糖載體，真核生物使用十二烷醇焦磷酸(dolichol pyrophosphate,Dol-PP)，細菌使用Und-PP，而古菌的廣古菌門使用十二烷醇磷酸(dolichol phosphate,Dol-P)，泉古菌門使用Dol-PP。泉古菌門與真核生物在聚糖結(jié)構(gòu)和聚糖載體的相似性表明它們的N-糖基化系統(tǒng)之間可能存在密切的進化關(guān)系，這與最近的系統(tǒng)發(fā)育分析一致[45]。

6 原核生物N-糖基化系統(tǒng)在糖基化工程的應(yīng)用

C.jejuni的N-糖基化途徑成功轉(zhuǎn)移到E.coli為開發(fā)糖基化工程系統(tǒng)奠定了基礎(chǔ)[46]。該系統(tǒng)的關(guān)鍵特征：C.jejuni的寡糖基轉(zhuǎn)移酶PglB能夠?qū)⒉煌瑏碓吹木厶寝D(zhuǎn)移至含有特定N-糖基化位點的蛋白上，同時E.coli沒有糖基化途徑，故可作為合成糖蛋白的良好平臺。在這個突破性的發(fā)現(xiàn)之后，C.jejuni的N-糖基化途徑在糖基化工程中得到廣泛應(yīng)用[47]。目前已利用PglB合成了針對Shigellaspecies[48]、Staphylococcusaureus[49]和腸致病性E.coli[50]的糖蛋白疫苗，同時也探索了針對其他細菌的糖蛋白疫苗，例如Burkholderiapseudomallei[51]、E.coliO157[52]，F(xiàn)rancisellatularensis[53]和Streptococcuspneumoniae[54](表2)。此外，通過糖基化工程合成的糖蛋白也成功應(yīng)用于布魯氏菌病[55]和溶血性尿毒癥綜合征的診斷[56]。有兩個條件限制C.jejuniPglB將聚糖轉(zhuǎn)移到受體蛋白的能力：與其他菌中糖基化序列Asn-X-Ser/Thr(X≠Pro)相比，PglB需要一個延長的序列Asp/Glu-X1-Asn-X2-Ser/Thr(X1, X2≠Pro)；只有還原端第一個糖的C2位有乙?；揎椀木厶遣拍鼙籔glB識別[57]。為了克服這些局限性，研究者們除了改造聚糖和受體蛋白結(jié)構(gòu)外，還對其他糖基轉(zhuǎn)移酶進行了研究，并發(fā)現(xiàn)A.pleuropneumoniae的NGT也能轉(zhuǎn)移到大腸桿菌中對異源蛋白進行糖基化[58]。此外，研究表明，利用NGT合成的長鏈聚唾液酸對治療性蛋白質(zhì)DARPin (designed ankyrin repeat protein, DARPin)進行修飾可以改善藥代動力學(xué)并降低免疫原性[59]，并且NGT能將人類免疫球蛋白的Fc域糖基化[60]，進一步證明其在糖基化工程中的潛在用途。

與C.jejuni的PglB相比，古菌的AglB對聚糖特異性的要求更低，AglB能將多種聚糖結(jié)合到受體蛋白的Asn-X-Ser/Thr(X≠Pro)序列。Haloferaxvolcanii具有比較清楚的N-糖基化途徑，能利用各種糖基轉(zhuǎn)移酶使N-聚糖的組分發(fā)生廣泛的變化[61]，但能否在細菌或真核生物中構(gòu)建古菌的N-糖基化途徑來生產(chǎn)糖蛋白還有待進一步研究。

與傳統(tǒng)的化學(xué)合成的糖蛋白疫苗相比，細菌糖基化工程開發(fā)的糖蛋白疫苗具有成本低、療效突出和安全性好的優(yōu)勢。利用細菌糖基化工程生產(chǎn)糖蛋白疫苗具有廣闊的發(fā)展前景。近年來，研究者們?yōu)樘岣咛堑鞍滓呙绲纳a(chǎn)效率做了大量的研究：通過過表達E.coli的糖生物合成基因[62]，將其他糖基轉(zhuǎn)移酶轉(zhuǎn)入E.coliK-12[47]來提高糖基化效率；通過PglB插入染色體中表達[63]，將常規(guī)IPTG誘導(dǎo)方法改為優(yōu)化的自動誘導(dǎo)方法[64]，控制糖蛋白的易位和折疊[65]，調(diào)節(jié)中心碳代謝途徑增加細胞內(nèi)聚糖前體庫[66]、對PglB[67]和NGT[68]結(jié)構(gòu)進行工程改造以及改變工程菌株的生長速率[69]來提高糖蛋白的產(chǎn)量；通過RecET直接克隆寡糖合成基因簇并結(jié)合PGCT(protein glycan coupling technology, PGCT)技術(shù)來加快糖蛋白的生產(chǎn)速率[70]；通過開發(fā)無細胞糖蛋白合成平臺，在體外進行N-糖基化反應(yīng)[71]來克服體內(nèi)生產(chǎn)糖蛋白的困難。這些技術(shù)手段的運用為大規(guī)模生產(chǎn)N-糖蛋白及糖蛋白疫苗提供了保障。

7 結(jié)論與展望

迄今為止，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了原核生物的多種N-糖基化途徑，并揭示了N-糖基化在原核生物的生命活動中發(fā)揮著重要作用。多種病原菌的蛋白N-糖基化修飾在病原菌的黏附及侵襲、蛋白組裝和保護性免疫等過程中發(fā)揮重要作用。因此，對病原菌N-糖基化修飾的作用機制進行深入研究，既有助于更好地闡明病原菌與宿主的相互作用，也有利于探索新的方式來預(yù)防及治療由相關(guān)病原菌引發(fā)的疾病，比如當(dāng)前發(fā)展迅速的糖蛋白疫苗就是一個很好的例子。對古菌N-糖基化的研究，一方面可以揭示N-糖基化在微生物響應(yīng)環(huán)境變化中的作用；另一方面古菌復(fù)雜的N-糖基化系統(tǒng)可以為糖基化工程系統(tǒng)提供多種糖合成酶類，從而有利于研發(fā)出更多在醫(yī)藥方面有重要意義的重組糖蛋白。可以預(yù)見，原核生物N-糖基化系統(tǒng)在糖基化工程中的應(yīng)用將在疫苗生產(chǎn)、疾病診斷和治療等方面發(fā)揮重要作用。此外，之前的研究只在細菌的變形菌門中發(fā)現(xiàn)有N-糖基化的存在，最近擬桿菌門Cytophagahutchinsonii中N-糖基化的發(fā)現(xiàn)擴大了細菌N-糖基化的研究范圍，并且C.hutchinsonii的N-糖基化對蛋白定位和分泌的作用也豐富了對細菌N-糖基化功能的認識，這也說明對原核生物N-糖基化的了解還只是冰山一角，相信隨著生物技術(shù)的進步，對原核生物N-糖基化系統(tǒng)的認識也會更全面。

隨著原核生物基因組學(xué)、糖組學(xué)和蛋白組學(xué)研究的發(fā)展，對原核生物蛋白N-糖基化的研究不斷增多，但這其中還存在許多未解之謎等待著去解析。因此，未來的研究應(yīng)集中在以下方面：原核生物N-糖基化蛋白的結(jié)構(gòu)與功能，病原菌N-糖基化與其致病機制的關(guān)系，重要的糖基轉(zhuǎn)移酶的特性，構(gòu)建高效簡便的糖蛋白表達平臺以生產(chǎn)糖蛋白藥物，重組糖蛋白在臨床方面的應(yīng)用，糖蛋白藥物的商業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)等，這些都是研究者需要去解決的問題。