陳亮，劉雪松，馮萬(wàn)宇，張蕾，沈思思，蘭世捷，李丹，苗艷

（黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)分院，黑龍江 齊齊哈爾 161005）

0 引言

肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumonia）屬于腸桿菌科[1]，可以引起多種疾病，包括肺炎、膀胱炎、心內(nèi)膜炎及敗血癥等[2]。隨著抗生素的使用，細(xì)菌的耐藥性問(wèn)題逐漸暴露出來(lái)并且呈現(xiàn)出愈演愈烈的情況。第3代甚至第4代頭孢菌素等β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素被廣泛應(yīng)用在治療革蘭氏陰性菌的感染中。但是隨著這些藥物的使用，陰性桿菌的耐藥性問(wèn)題迅速增強(qiáng)。多種機(jī)制可引其革蘭氏陰性桿菌產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺類(lèi)藥物耐藥性，其中包括了編碼PBPs的基因突變、主動(dòng)外排泵作用、細(xì)胞膜通透性的改變及產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶[3]。其中產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶（Extended-spectrum β-Lactamase）是導(dǎo)致陰性腸桿菌產(chǎn)生耐藥性最為常見(jiàn)的機(jī)制之一[4]。超廣譜β-內(nèi)酰胺酶是由基因突變而產(chǎn)生的的一種酶，可水解β-內(nèi)酰胺環(huán)，讓藥物失去活性。根據(jù)編碼基因的不同，可將超廣譜β-內(nèi)酰胺酶分為T(mén)EM、CTX-M、SHV以及OXA等分型，其中TEM、CTX-M、SHV是常見(jiàn)的分型。CTX-M耐藥基因存在多種亞型。

2021年10月從黑龍江省齊齊哈爾市周邊肉牛場(chǎng)分離出一株致病性肺炎克雷伯菌，發(fā)現(xiàn)其對(duì)β-內(nèi)酰胺類(lèi)藥物產(chǎn)生了強(qiáng)烈的耐藥性，對(duì)其攜帶的耐藥基因進(jìn)行探究，為臨床治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

致病性肺炎克雷伯君分離于黑龍江省齊齊哈爾周邊肉牛場(chǎng)。

1.1.2 試劑與儀器

腦心浸出液培養(yǎng)基、MH瓊脂培養(yǎng)基，均購(gòu)自青島海博生物技術(shù)有限公司。Taq Master Mix以及DNA Marker，購(gòu)自大連Takara公司。Bio-Rad梯度PCR儀，購(gòu)自伯樂(lè)生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司。藥敏紙片購(gòu)自杭州濱河微生物試劑有限公司。

1.1.3 試驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)昆明雌鼠6只，6周齡，體重大致在30～36 g，購(gòu)自齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌純化

將臨床分離到的肺炎克雷伯菌劃線接種到BHI瓊脂培養(yǎng)基上，連續(xù)劃線3代，將細(xì)菌進(jìn)行純化。

1.2.2 細(xì)菌致病性試驗(yàn)

將純化后的細(xì)菌用BHI營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)到1.5×108CFU/mL后，試驗(yàn)組3只小鼠腹腔注射0.2 mL。對(duì)照組3只注射無(wú)菌生理鹽水。

1.2.3 藥敏試驗(yàn)

根據(jù)CLSI的指導(dǎo)進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。將細(xì)菌菌液培養(yǎng)到0.5麥?zhǔn)蠁挝?，將菌液均勻涂抹于MH瓊脂平板上，將藥敏紙片均勻放置在平板上，2個(gè)藥敏紙片間距不低于24 mm，一個(gè)平板上最多放置5個(gè)藥敏紙片。

1.2.4 耐藥基因檢測(cè)

用DNA提取試劑盒提取DNA模板，進(jìn)行耐藥基因PCR檢驗(yàn)?？傮w積為25 μL，其中模板2 μL，上下游引物各1 μL，Master Mix 12.5 μL，ddH2O 8.5 μL。

2 結(jié)果

2.1 致病性試驗(yàn)

將分離得到的細(xì)菌經(jīng)過(guò)純培養(yǎng)后，對(duì)小鼠進(jìn)行腹腔注射。試驗(yàn)小鼠在4 h內(nèi)全部死亡，經(jīng)過(guò)剖檢發(fā)現(xiàn)死亡小鼠的脾臟、肝臟有出血點(diǎn)。將死亡小鼠進(jìn)行心血涂片，鏡檢發(fā)現(xiàn)與克雷伯菌形態(tài)一致，該株細(xì)菌有致病性。

2.2 藥敏試驗(yàn)

藥敏試驗(yàn)看出該株致病性肺炎克雷伯菌對(duì)β-內(nèi)酰胺類(lèi)藥物皆產(chǎn)生了耐藥性，對(duì)氟喹諾酮類(lèi)處于敏感狀態(tài)。

2.3 耐藥基因

耐藥基因結(jié)果如圖1所示，通過(guò)PCR發(fā)現(xiàn)該株菌株含有CTX-M-2基因，為攜帶CTX-M-2耐藥基因的產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶細(xì)菌。

圖1 耐藥基因PCR鑒定結(jié)果

3 討論

克雷伯菌屬為革蘭氏陰性桿菌，其主要包含肺炎克雷伯菌、臭鼻克雷伯菌、鼻硬結(jié)克雷伯菌等。其中肺炎克雷伯菌的致病性較強(qiáng)，在多種動(dòng)物中都曾分離出肺炎克雷伯菌。從陜西某規(guī)?；i場(chǎng)中分理處一株具有致病性的肺炎克雷伯菌，并對(duì)其進(jìn)行了藥敏試驗(yàn)以及耐藥基因的檢測(cè)。從內(nèi)蒙古通遼某羊場(chǎng)病死羊中分離出了一株致病性肺炎克雷伯菌，并對(duì)其攜帶的毒力基因進(jìn)行了探究。從遼寧某小白鵝廠中分離出一株肺炎克雷伯菌，并對(duì)其致病性進(jìn)行了探究。肺炎克雷伯菌分布廣，并且致病動(dòng)物種類(lèi)多，對(duì)動(dòng)物健康安全及公共衛(wèi)生安全都造成了不小的威脅。隨著抗生素的逐漸使用，細(xì)菌耐藥性問(wèn)題逐漸嚴(yán)重。其中肺炎克雷伯菌對(duì)β-內(nèi)酰胺類(lèi)藥物的耐藥性問(wèn)題被許多研究人員關(guān)注。付霞麗對(duì)一株致病性豬源肺炎克雷伯菌的耐藥基因攜帶情況進(jìn)行了檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)其攜帶SHV耐藥基因，為產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶的肺炎克雷伯菌。蘇小艷對(duì)2株大熊貓?jiān)捶窝卓死撞哪退幓蜻M(jìn)行了檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)其中一株細(xì)菌攜帶SHV+TEM+CTX-M-1耐藥基因，另一株攜帶SHV+CTX-M-1耐藥基因。從廣東肇慶某豬場(chǎng)中分離出一株豬源肺炎克雷伯菌，經(jīng)過(guò)耐藥基因檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)其攜帶SHV耐藥基因。面對(duì)著肺炎克雷伯菌如此嚴(yán)重的耐藥性問(wèn)題，研究人員提出了許多對(duì)應(yīng)的解決方法。其中中藥作為我國(guó)的瑰寶，其在聯(lián)合抗生素治療肺炎克雷伯菌以及逆轉(zhuǎn)耐藥性上起到了重要作用。金銀花的有效成分綠原酸聯(lián)合左氧氟沙星可有效對(duì)產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶肺炎克雷伯菌的生物膜起到抑制作用，從而達(dá)到優(yōu)良的抗菌效果。黃連素可有效抑制肺炎克雷伯菌的生長(zhǎng)，并且可消除其耐藥質(zhì)粒，從而逆轉(zhuǎn)其耐藥性。清金化痰湯與頭孢哌酮或舒巴坦聯(lián)合應(yīng)用對(duì)產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶肺炎克雷伯菌在體外環(huán)境下具有明顯的協(xié)同抑制作用。通過(guò)以上的報(bào)道可以看出，中藥單獨(dú)使用或者聯(lián)合抗生素使用，對(duì)產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶的肺炎克雷伯菌具有良好的抗菌效果，并且能在一定程度上消除細(xì)菌的耐藥質(zhì)粒，扭轉(zhuǎn)其耐藥性。

4 結(jié)束語(yǔ)

從黑龍江省齊齊哈爾市周邊肉牛場(chǎng)分離出一株對(duì)β-內(nèi)酰胺類(lèi)藥物耐藥的肺炎克雷伯菌，通過(guò)耐藥基因檢測(cè)，了解其攜帶的耐藥基因及耐藥機(jī)制。通過(guò)藥敏及耐藥基因檢測(cè)試驗(yàn)，可有效為該肉牛場(chǎng)因該株耐藥菌株產(chǎn)生的疾病防治提供依據(jù)。