何思蓮，鐘玉蓮，李品衛(wèi)，曾呂生，龐國萍，陳淵*

1. 廣西農(nóng)產(chǎn)資源化學(xué)與生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，玉林師范學(xué)院化學(xué)與食品科學(xué)學(xué)院（玉林 537000）；2. 廣州華糖食品有限公司（廣州 510760）；3. 廣西貴港市甘化集團(tuán)有限公司（貴港 537100）

大果山楂屬于南山楂的一種，是廣西傳統(tǒng)果品之一，具有悠久的種植歷史。大果山楂具有較高的醫(yī)用價(jià)值，能增加冠狀動(dòng)脈血量、加強(qiáng)和調(diào)節(jié)心肌、降低血壓[1]，已被中華人民共和國國家衛(wèi)生健康委員會(huì)確定為藥食兩用的食品。甘蔗是高產(chǎn)廉價(jià)的糖料農(nóng)作物，含有豐富的維生素、礦物質(zhì)等元素和抗氧化活性成分[2]，是釀造果酒的良好原料。將二者混合發(fā)酵釀造得到復(fù)合果酒，使其營養(yǎng)成分和保健功能互補(bǔ)，口感更為全面。但完成發(fā)酵的復(fù)合果酒在貯藏時(shí)，酒體中的果膠質(zhì)、蛋白質(zhì)、色素、單寧等大分子成分易發(fā)生凝集沉淀，降低果酒品質(zhì)。通過單因素試驗(yàn)篩選高效的澄清劑，采用響應(yīng)面進(jìn)行復(fù)合澄清劑復(fù)配比例的優(yōu)化，進(jìn)一步確定最佳澄清工藝條件，為經(jīng)濟(jì)有效地澄清大果山楂-甘蔗復(fù)合果酒、提高酒體品質(zhì)和貯藏穩(wěn)定性提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料、試劑與儀器

大果山楂（購于玉林宏進(jìn)批發(fā)市場）；甘蔗汁（初壓汁，采自廣西某糖廠）。

葡萄酒活性干酵母BV818、無水檸檬酸、白砂糖、皂土、殼聚糖、PVPP、明膠、硅藻土等（均為食品級(jí)）。

DHG-9146A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；SHZ-82型水浴恒溫振蕩器（江蘇金怡儀器科技有限公司）；JJ500型電子天平（常熟市雙杰測試儀器廠）；JYZ-V902型九陽榨汁機(jī)（九陽股份有限公司）；TDZ5-WS型臺(tái)式低速離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司）；UV-1600型紫外-可見分光光度計(jì)（上海美譜達(dá)儀器有限公司）；HH-S4型數(shù)顯恒溫水浴鍋（江蘇金儀儀器科技有限公司）；ST3100型pH計(jì)（奧豪斯儀器常州有限公司）。

1.2 果酒制備工藝流程

發(fā)酵所得果酒，用不同澄清劑在25 ℃進(jìn)行澄清處理24 h后，于紫外分光光度計(jì)500 nm檢測其透光率。

1) 原料處理：挑選新鮮的大果山楂清洗干凈，除去果蒂和果梗，榨汁，過濾除渣后冷凍備用（固形物含量14.5 °B）；甘蔗初壓汁（糖度17.7%）經(jīng)4層紗布過濾3次，冷凍備用。

2) 混合：大果山楂汁與甘蔗汁按1∶2（V/V）比例進(jìn)行混合，混合液在室溫下靜置1 h后，在4 000 r/min的條件下離心10 min，收集上清液備用。

3) 調(diào)糖，殺菌：加蔗糖調(diào)上清液糖度至20%，加熱煮沸3 min，在75 ℃條件下水浴30 min后，置于冰水冷卻至室溫。

4) 發(fā)酵：酵母液（V酵母∶V2%蔗糖液=1∶10）于32 ℃水浴活化30 min，復(fù)合果酒接種0.6%（V/V）酵母液，在25 ℃電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱發(fā)酵72 h。

5) 澄清：不同澄清劑對(duì)大果山楂甘蔗復(fù)合果酒進(jìn)行澄清處理24 h后，于紫外分光光度計(jì)檢測其透光率。

1.3 澄清劑復(fù)配比例優(yōu)化

以皂土、殼聚糖、PVPP這3種澄清劑為變量因素，以復(fù)合果酒透光率為響應(yīng)值，采用響應(yīng)面軟件Design Expert V8.0中的Box-Behnken設(shè)計(jì)進(jìn)行優(yōu)化，確定最優(yōu)復(fù)配比例，因素水平見表1。

表1 大果山楂-甘蔗復(fù)合果酒澄清試驗(yàn)的因素水平表單位：g/L

1.4 復(fù)合澄清劑澄清時(shí)間的確定

在最佳復(fù)合配方的基礎(chǔ)上，研究澄清時(shí)間為3，6，9，12，15和18 h時(shí)果酒的透光率，確定最優(yōu)澄清時(shí)間。

1.5 果酒抗氧化活性的測定

澄清前、后的果酒經(jīng)稀釋、過濾，測定DPPH（1, 1-二苯基-2-三硝基苯肼）自由基清除率和總還原能力[3]。

2 結(jié)果與討論

2.1 皂土、殼聚糖、硅藻土對(duì)復(fù)合果酒的澄清效果

皂土對(duì)復(fù)合果酒透光率的影響隨皂土添加量增加，透光率亦上升，可能的原因是復(fù)合果酒中含有大量呈正電性的膠體物質(zhì)，能與帶負(fù)電荷的皂土作用而澄清[4]，透光率隨著皂土的添加而上升。添加量增加到1.2 g/L，澄清后果酒透光率達(dá)到77.9%，與初始的透光率59.1%相比提高18.8%。添加量大于1.2 g/L，澄清后透光率變化幅度不大，這說明帶負(fù)電荷的皂土吸附果酒中大部分帶相反電荷的膠體物質(zhì)，形成難溶物沉淀之后，皂土添加量繼續(xù)增加，果酒的澄清度變化不大[5]。

皂土、殼聚糖、硅藻土對(duì)復(fù)合果酒的澄清效果如圖1所示。殼聚糖添加量范圍在0.2～0.6 g/L時(shí)，復(fù)合酒的透光率隨殼聚糖的增加而逐漸上升；在0.6 g/L處澄清效果最佳，復(fù)合果酒的透光率由初始的59.1%上升至76.9%；殼聚糖添加量超過0.6 g/L時(shí)，透光率反而下降?？赡苁且?yàn)楣浦羞€存在帶負(fù)電的膠體物質(zhì)如蛋白質(zhì)、果膠等，帶正電的殼聚糖中和帶負(fù)電的物質(zhì)形成沉淀，達(dá)到澄清效果；但殼聚糖添加過量時(shí)，殼聚糖吸水膨脹會(huì)形成黏性較大的膠狀物，懸浮于酒體中，致使酒體渾濁[6]。

圖1 皂土、殼聚糖、硅藻土對(duì)復(fù)合果酒透光率的影響

硅藻土添加量范圍在0.2～0.6 g/L時(shí)，復(fù)合酒的透光率隨硅藻土添加量的增加呈上升趨勢。硅藻土添加量0.6 g/L時(shí)，復(fù)合酒的透光率達(dá)73.5%，與原酒酒體的透光率（59.1%）相比，提升14.4%。硅藻土添加量范圍小于0.6 g/L時(shí)，果酒透光率逐漸上升，這與硅藻土具有強(qiáng)吸附性的多孔結(jié)構(gòu)有關(guān)。適量的硅藻土可吸附酒體中果膠、酵母、色素等渾濁物一同沉降，使果酒澄清。但硅藻土添加量高于0.6 g/L時(shí)，酒體澄清度隨著添加量的增加呈下降趨勢，可能是過量硅藻土成為渾濁物的來源[7]。

2.2 明膠、PVPP對(duì)復(fù)合果酒的澄清效果

明膠、PVPP對(duì)復(fù)合果酒的澄清效果如圖2所示。明膠作澄清劑時(shí)，明膠中的蛋白質(zhì)會(huì)與單寧發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，形成黏稠狀物質(zhì)，進(jìn)而吸附果酒中的果膠、單寧等膠體物，使其形成難溶物而被去除，從而使果酒澄清[8]。明膠添加量0.02 g/L時(shí)，澄清得到的復(fù)合酒透光率（71.1%）與原酒酒體的透光率（59.1%）相比，提高12%，明膠添加量超過0.02 g/L時(shí)，復(fù)合果酒的透光率變化程度較小，這可能是由于山楂中含較多的單寧，甘蔗汁和山楂汁混合發(fā)酵過程單寧物質(zhì)與酒體的蛋白質(zhì)作用沉淀除去，存留在酒體中單寧物質(zhì)大幅減少，明膠加入后，澄清作用不明顯。

圖2 明膠、PVPP對(duì)復(fù)合果酒透光率的影響

PVPP主要吸附引起果酒不穩(wěn)定的單寧和多酚類物質(zhì)，加入適量PVPP后，PVPP可吸附單寧絮凝沉淀，進(jìn)而抑制果酒中蛋白質(zhì)與單寧的結(jié)合，從而提高發(fā)酵酒的澄清度[9]。PVPP添加量在0.02～0.06 g/L時(shí)，復(fù)合果酒的透光率隨PVPP添加量增加而快速上升。添加量大于0.06 g/L，透光率上升幅度不大，PVPP添加量0.1 g/L時(shí)，酒體透光率最高達(dá)75.0%。PVPP添加量高于0.1 g/L時(shí)，復(fù)合果酒的透光率下降。楊繼偉[10]使用PVPP澄清甘蔗果酒，結(jié)果發(fā)現(xiàn)添加適量PVPP，可去除果酒中含有的多酚類物質(zhì)，提高果酒透光率，而PVPP添加過量時(shí)，部分的PVPP懸浮于果酒中導(dǎo)致澄清度降低。

2.3 復(fù)合澄清劑配方優(yōu)化試驗(yàn)

單因素試驗(yàn)結(jié)果表明，5種澄清劑對(duì)大果山楂-甘蔗復(fù)合果酒均有一定澄清效果。選取單因素試驗(yàn)澄清效果較好的皂土、殼聚糖、PVPP這3種澄清劑進(jìn)行復(fù)配，以復(fù)合果酒透光率為指標(biāo)進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化復(fù)配配方。17組試驗(yàn)結(jié)果見表2。對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析及回歸系數(shù)顯著性檢驗(yàn)，結(jié)果見表3。統(tǒng)計(jì)模型P＜0.000 1，表明回歸模型極顯著。R2=0.992 8，Radj2=0.983 5，R2pre=0.913 7，表明試驗(yàn)誤差小，模型與數(shù)據(jù)的擬合度高，模型擬合建立的二次多項(xiàng)式回歸方程為透光率=71.8+14.6A+16.8B+68.3C-5.7AB-23.3AC-25.0BC-4.5A2-12.2B2-250.0C2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表3 透光率回歸模型的顯著性和方差分析

該模型可以預(yù)測和分析復(fù)合澄清劑對(duì)復(fù)合果酒澄清效果的影響。在各因素中，一次項(xiàng)A、B對(duì)復(fù)合果酒澄清的效果極顯著（P≤0.01），澄清效果的大小順序?yàn)樵硗粒ˋ）＞殼聚糖（B）＞PVPP（C），這結(jié)果與單因素試驗(yàn)的結(jié)果相同。二次項(xiàng)A2、B2和交互項(xiàng)AB對(duì)復(fù)合果酒澄清的效果極顯著（P＜0.01），而交互項(xiàng)BC對(duì)復(fù)合果酒澄清的效果不顯著（P＞0.1）。這表明各試驗(yàn)因素對(duì)復(fù)合果酒澄清效果存在一定的交互作用。

根據(jù)響應(yīng)面模型，預(yù)測的復(fù)合澄清劑最佳質(zhì)量濃度為皂土1.20 g/L、殼聚糖0.34 g/L、PVPP 0.06 g/L，澄清后果汁透光率為85.7%。采用所得出的最佳復(fù)合配比進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，平行測3組，試驗(yàn)測得的透光率為85.4%±0.8%，與模型預(yù)測基本一致，較初始的透光率提高26.3%，說明復(fù)合澄清劑效果優(yōu)于單一澄清劑。

2.4 復(fù)合澄清劑澄清時(shí)間的確定

采用最優(yōu)配方的復(fù)合澄清劑對(duì)大果山楂-甘蔗復(fù)合果酒進(jìn)行澄清，澄清時(shí)間對(duì)果酒透光率的影響結(jié)果如圖3所示。澄清時(shí)間3～12 h時(shí)，復(fù)合果酒酒體的澄清度隨時(shí)間遞增，澄清時(shí)間大于12 h，酒體澄清度開始下降，可能是因?yàn)殪o置時(shí)間長，果酒中微生物的新陳代謝作用，也會(huì)破壞果酒中膠體平衡，從而造成酒體混濁失光[11]。澄清時(shí)間9 h時(shí)，所得到的酒體透光率為89.7%±0.8%，澄清時(shí)間12 h時(shí)，所得到的酒體透光率為90.6%±0.8%，較初始的透光率（59.1%）提高30.5%。考慮到實(shí)際生產(chǎn)和微生物的作用，選擇澄清時(shí)間9～12 h為宜。結(jié)果表明，復(fù)合澄清劑的最佳澄清時(shí)間比單一澄清劑的最佳澄清時(shí)間24 h有大幅縮短。

圖3 澄清時(shí)間對(duì)復(fù)合果酒透光率的影響

2.5 澄清前后果酒抗氧化能力

大果山楂-甘蔗復(fù)合果酒在澄清前和澄清后的DPPH自由基清除能力和還原能力結(jié)果分別如圖4和圖5所示。結(jié)果表明，大果山楂-甘蔗復(fù)合果酒具有較好的抗氧化能力。澄清后果酒的DPPH自由基清除率略有提高，可能的原因是復(fù)合澄清劑中的皂土和殼聚糖都帶有一定的電荷數(shù)，使用復(fù)合澄清劑澄清果酒后，可使酒體的電子供體增加，DPPH自由基清除率升高。澄清后果酒的總還原能力略有下降，可能的原因是復(fù)合澄清劑中的PVPP吸附具有抗氧化作用的多酚和黃酮類物質(zhì)[12]。

圖4 澄清前后的DPPH自由基清除率

圖5 澄清前后的總還原能力

3 結(jié)論

通過5種澄清劑皂土、殼聚糖、PVPP、硅藻土、明膠對(duì)大果山楂-甘蔗復(fù)合果酒進(jìn)行澄清試驗(yàn)，結(jié)果表明它們均有一定澄清作用，其中皂土、殼聚糖、PVPP的澄清效果較好。

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以澄清率為指標(biāo)，通過響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)對(duì)復(fù)合澄清劑配方進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明：皂土、殼聚糖、PVPP復(fù)合澄清劑要比單一澄清劑的澄清效果好，當(dāng)復(fù)合澄清劑最佳質(zhì)量濃度為皂土1.20 g/L、殼聚糖0.34 g/L、PVPP 0.06 g/L時(shí)，24 h澄清處理后大果山楂-甘蔗復(fù)合果酒透光率可達(dá)85.4%± 0.8%。復(fù)配澄清劑最佳澄清時(shí)間為9～12 h，所得到的酒體透光率最高可達(dá)90.6%±0.8%，較單一澄清劑最佳的澄清時(shí)間大大縮短。選用復(fù)合澄清劑澄清對(duì)果酒的抗氧化活性影響不大，澄清后果酒的DPPH自由基清除率略有提高，澄清后果酒的總還原能力略有下降。