劉益鋒, 邱嘉興, 張朋杰, 孫克強(qiáng), 張憲臣, 趙珍玉, 梁潤(rùn)梅

（中山海關(guān)技術(shù)中心, 廣東 中山 528400）

紙質(zhì)包裝由于其原料來(lái)源廣泛、制造成本低、性能優(yōu)良、環(huán)保等優(yōu)點(diǎn)在食品產(chǎn)業(yè)中得到越來(lái)越廣泛的應(yīng)用[1］。在生產(chǎn)加工和存儲(chǔ)過(guò)程中為了防止食品接觸用紙制品霉變, 常使用有機(jī)抗菌劑達(dá)到防腐、抑菌的效果, 以增加紙制包裝和食品的存儲(chǔ)和使用期限[2］。氯苯酚類藥物通常用于木材的防腐抗菌, 造紙制漿的漂白和氯化消毒過(guò)程中也會(huì)產(chǎn)生氯苯酚類藥物。由于氯苯酚類藥物具有致畸變和致癌性, 許多國(guó)家均對(duì)該類藥物的使用進(jìn)行了嚴(yán)格限制[3］。對(duì)羥基苯甲酸酯類具有廣泛的抑菌作用及穩(wěn)定性, 但如果超出規(guī)定的安全使用范圍, 則可能影響消費(fèi)者的身體健康[4］。因此, 建立食品接觸用紙制品中氯苯酚類和對(duì)羥基苯甲酸酯類等有機(jī)抗菌劑的檢測(cè)方法, 開(kāi)展食品接觸用紙制品中有機(jī)抗菌劑含量監(jiān)測(cè), 具有十分重要的意義。

目前, 已有檢測(cè)對(duì)羥基苯甲酸酯類和氯苯酚類物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)[5-7］, 主要測(cè)定方法有氣相色譜法（GC）[8-9］、氣相色譜-質(zhì)譜法（GC-MS）[10-11］、高效液相色譜法（HPLC）[12-13］和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（HPLC-MS/MS）[14-15］等?，F(xiàn)階段測(cè)定有機(jī)抗菌劑的前處理?xiàng)l件和儀器分析條件各有特色, 但同時(shí)測(cè)定上述23種有機(jī)抗菌劑少見(jiàn)報(bào)道。超高效液相色譜-靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜（UPLC-Orbitrap HRMS）擁有定量能力強(qiáng)、分辨率高等優(yōu)點(diǎn), 無(wú)需對(duì)多個(gè)目標(biāo)物的相關(guān)參數(shù)進(jìn)行逐一優(yōu)化, 通過(guò)采用母離子的精確分子量直接定量, 可以大大地縮短多個(gè)目標(biāo)物的測(cè)試時(shí)間, 近年來(lái)在食品和工業(yè)品中有毒有害化合物的快速檢測(cè)中得到了廣泛使用[16-19］。本研究建立了UPLC-Orbitrap HRMS法同時(shí)快速測(cè)定食品接觸用紙中23種有機(jī)抗菌劑, 該方法簡(jiǎn)單、便捷、實(shí)用性強(qiáng), 適用于食品接觸用紙樣品的快速篩查與檢測(cè)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

UltiMate 3000Q-Exactive高效液相色譜-靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜UPLC-Orbitrap HRMS, 配有HESIⅡ離子源（美國(guó)Thermo Fisher公司）；渦旋震蕩器（德國(guó)IKA公司）；電子天平（BS323S, 德國(guó)賽多利斯公司）；超純水系統(tǒng)（美國(guó)Millipore公司）；S300H超聲波水?。绹?guó)CREST公司）。

乙腈、甲醇、丙酮、乙酸乙酯（HPLC級(jí), 德國(guó)Merck公司）；乙酸銨、乙酸（色譜純, 上海安譜公司）。23種抗菌劑標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥95%, 上海安譜公司）。

1.2 溶液配制

每種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)逐一用甲醇配制成1 000 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液, 避光在4℃以下保存。準(zhǔn)確吸取每種儲(chǔ)備液混合后, 用甲醇配制成質(zhì)量濃度為10 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)中間液, 或其他質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)中間液。稱取0. 385 g固體乙酸銨, 用超純水溶解并定容至1 000 mL, 配制成5 mmol/L乙酸銨溶液, 搖勻備用。

1.3 色譜-質(zhì)譜條件

色譜柱：Waters Atlantis T3柱（2. 1 mm×150 mm, 3μm）；流動(dòng)相：甲醇（A）-5 mmol/L乙酸銨（含0. 4%乙酸）溶液（B）, 梯度洗脫條件：0～15 min, 30%～80%A；15～20 min, 80%A；20～20. 1 min, 80%～30%A；20. 1～25 min, 30%A。流速0. 3 mL/min；柱溫40℃；進(jìn)樣量10μL。

電離模式為電噴霧負(fù)離子（ESI-）；毛細(xì)管電壓為-3. 2 kV；離子傳輸溫度為320℃；鞘氣壓力為40 unit。掃描模式為Full MS/dd-MS2：采集范圍為50～500 Da；一級(jí)分辨率為70 000, 二級(jí)分辨率為17 500, 其他質(zhì)譜信息見(jiàn)表1。

表1 23種有機(jī)抗菌劑的串聯(lián)質(zhì)譜參數(shù)Table 1 MS/MS parameters of 23 organic antibacterial agents

1.4 樣品前處理

將檢測(cè)樣品制成5 mm×5 mm以下碎片, 混合均勻。稱取0. 5 g（精確至1 mg）試樣放入樣品瓶中, 加入10 mL甲醇提取液后混勻, 常溫下超聲提取20 min, 取出后經(jīng)4 500 r/min離心5 min, 轉(zhuǎn)移至氮吹儀中吹干。加入1 mL甲醇渦旋溶解, 過(guò)0. 22μm濾膜, 待上機(jī)測(cè)定。

2 結(jié)果與討論

2.1 流動(dòng)相的優(yōu)化

本文測(cè)定的23種有機(jī)抗菌劑包含19種氯苯酚類化合物和4種對(duì)羥基苯甲酸酯類化合物, 其中19種氯酚類化合物中含有4組同分異構(gòu)體, 即3個(gè)一氯苯酚、6個(gè)二氯苯酚、6個(gè)三氯苯酚和3個(gè)四氯苯酚。由于同分異構(gòu)體間的物理化學(xué)性質(zhì)相似, 色譜行為差異較小, 因此完全分離同分異構(gòu)體的難度較大。

結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道[3, 15］, 分別在常規(guī)的負(fù)離子模式下對(duì)幾種水相和有機(jī)相的分離效果進(jìn)行測(cè)試, 其中有機(jī)相采用甲醇和乙腈, 水相采用5 mmol/L乙酸銨和添加不同含量乙酸的5 mmol/L乙酸銨。結(jié)果發(fā)現(xiàn), 有機(jī)相采用甲醇時(shí)分離效果和響應(yīng)強(qiáng)度明顯高于乙腈。水相采用5 mmol/L乙酸銨加入酸后的分離效果和響應(yīng)強(qiáng)度明顯增強(qiáng), 但考慮到酸過(guò)多會(huì)對(duì)色譜柱和管路造成損害, 因此采用甲醇-5 mmol/L乙酸銨（含0. 4%乙酸）作為本方法的流動(dòng)相。

2.2 色譜柱的選擇

分別考察了Atlantis T3（2. 1 mm×150 mm, 3μm）、Atlantis dc18（2. 1 mm×150 mm, 5μm）、uctra AQ c18（2. 1 mm×150 mm, 3μm）色譜柱對(duì)23種有機(jī)抗菌劑的分離效果。結(jié)果表明, Atlantis T3（2. 1 mm×150 mm, 3μm）在優(yōu)化色譜條件下能使23種有機(jī)抗菌劑的色譜峰響應(yīng)值高且具有較高的分離度, 可最大程度將氯苯酚同分異構(gòu)體分離。其他2種色譜柱均存在響應(yīng)值低, 分離效果較差等不足。因此, 本方法最終采用Atlantis T3（2. 1 mm×150 mm, 3μm）對(duì)23種有機(jī)抗菌劑進(jìn)行分離（見(jiàn)圖1）?？捎^察到, 2, 3, 4, 6-四氯苯酚和2, 3, 5, 6-四氯苯酚峰完全重疊, 3-氯苯酚和4-氯苯酚、2, 4-二氯苯酚、3, 4-二氯苯酚和2, 5-二氯苯酚等同分異構(gòu)體峰部分重疊。

圖1 4種含對(duì)羥基苯甲酸酯類化合物（A）及19種含氯苯酚化合物（B）標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的色譜圖Fig. 1 Chromatograms of 4 parabens（A）and 19 chlorinated phenols（B）standard solutions the number denoted was the same as that in Table 1

2.3 提取溶劑的選擇

有機(jī)抗菌劑均可溶于多種有機(jī)溶劑。本研究選用甲醇、乙腈、丙酮、乙酸乙酯等溶劑對(duì)實(shí)際樣品進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn), 結(jié)果顯示, 9類分析物（其同分異構(gòu)體歸為1類）的回收率分別為71. 6%～109%、78. 0%～108%、63. 0%～106%、72. 0%～110%（見(jiàn)圖2）。數(shù)據(jù)表明以甲醇和乙腈為提取劑時(shí)9類分析物的加標(biāo)回收率較高。考慮到流動(dòng)相為甲醇, 本方法采用甲醇作為最終提取溶劑。

圖2 提取溶劑對(duì)抗菌劑提取效果的影響Fig. 2 Effect of solvents on the extraction of antibacterial agent

2.4 線性范圍與定量下限

由于所測(cè)定的23種有機(jī)抗菌劑中包含多種同分異構(gòu)體, 液相色譜完全分離的難度大, 結(jié)合文獻(xiàn), 本方法確定用同組同分異構(gòu)體的含量總和進(jìn)行定量分析[15］。以有3種同分異構(gòu)體的二氯苯酚為例, 精確分子量均為126. 995 6（m/z）, 對(duì)3種二氯苯酚的色譜峰面積進(jìn)行加和后計(jì)算二氯苯酚的總含量。

由于高分辨質(zhì)譜的基線噪音很低, 不能采用傳統(tǒng)信噪比方法計(jì)算檢出限, 而是采用10倍空白實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)偏差除以線性方程的斜率確定定量下限（LOQ）。用甲醇將混合標(biāo)準(zhǔn)中間液稀釋成一系列質(zhì)量濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)工作液, 按“1. 3”條件依次進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明, 9組化合物的色譜峰面積與其質(zhì)量濃度的線性相關(guān)性良好, 相關(guān)系數(shù)均大于0. 997（見(jiàn)表2）。

2.5 回收率與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差

空白基質(zhì)樣品采用不含待測(cè)物質(zhì)的食品接觸用紙, 通過(guò)添加不同濃度混合標(biāo)準(zhǔn)工作液進(jìn)行回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）實(shí)驗(yàn)。選取0. 05、0. 5、2μg/kg對(duì)羥基苯甲酸酯類和0. 05、0. 5、2 mg/kg氯苯酚類3個(gè)不同加標(biāo)濃度（見(jiàn)表3）, 每個(gè)加標(biāo)水平平行測(cè)試6次, 測(cè)得9種組分的加標(biāo)回收率為81. 7%～119%, RSD為2. 0%～8. 8%（見(jiàn)表3）。方法的回收率和RSD在合理范圍內(nèi), 實(shí)際可行。

表3 方法的回收率與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差Table 3 Recovery and RSD of the method

2.6 實(shí)際樣品的測(cè)定

收集市場(chǎng)上不同品牌、不同用途的食品接觸用紙制品15批次, 利用本方法進(jìn)行測(cè)試。結(jié)果顯示, 所有樣品均未檢出氯苯酚類有機(jī)抗菌劑, 1批次樣品檢出對(duì)羥基苯甲酸甲酯, 含量為0. 13μg/kg。表明對(duì)羥基苯甲酸甲酯在市場(chǎng)上的食品接觸用紙制品中有檢出, 市場(chǎng)監(jiān)管部門需要加強(qiáng)對(duì)食品接觸用紙制品中有機(jī)抗菌劑使用的監(jiān)管力度。

3 結(jié) 論

本文采用甲醇為提取溶劑, 超聲提取, 建立了超高效液相色譜-靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜同時(shí)快速測(cè)定食品接觸用紙中23種有機(jī)抗菌劑的方法。結(jié)果顯示, 該方法簡(jiǎn)單、便捷, 可用于食品接觸用紙中多種有機(jī)抗菌劑的篩查和確證。