賈二娜,郭 博,周長玉*

(吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 1.消化內(nèi)科;2.胸外科，吉林 長春130033)

結(jié)腸癌是世界范圍內(nèi)發(fā)病率位居第三的惡性腫瘤，年發(fā)病率高達(dá)1400萬人，死亡率高達(dá)69.4萬人[1]。在我國，結(jié)腸癌是癌癥相關(guān)死亡疾病的第5大原因。約有75%的結(jié)腸癌診斷時已發(fā)展至臨床晚期，5年生存率僅有14%；而早期診斷可顯著降低死亡率，5年生存率可達(dá)到90%[2]。目前，對于結(jié)腸癌高風(fēng)險人群推薦的篩查方法主要有結(jié)腸鏡和糞便潛血實驗[3]。糞便潛血實驗對早期診斷和高危人群篩查的敏感性有限[4]。結(jié)腸鏡雖然具有較好的敏感性及特異性，但是具有有創(chuàng)性、費用昂貴，耗時且耐受性差[5]。血清CEA不僅敏感性低，且特異性差，多種良性疾病均可出現(xiàn)CEA增高[6]。外泌體是指來源于各種細(xì)胞分泌的直徑在40-100 nm之間的小囊泡，可作為載體，運載RNA(如miRNA)、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)及代謝產(chǎn)物，在細(xì)胞間及細(xì)胞與組織間進(jìn)行信息傳遞，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著尤為重要的作用[7]。多項研究報道，miR-23a在結(jié)腸癌組織及細(xì)胞中顯著高表達(dá)，促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移和增殖[8]。本研究基于GEO及TCGA數(shù)據(jù)庫篩查及驗證miR-23a在結(jié)腸癌患者血清外泌體中是否異常表達(dá)，是否有希望成為新型無創(chuàng)性的早期診斷及預(yù)后標(biāo)志物。

1 材料和方法

1.1 數(shù)據(jù)集的篩選

進(jìn)入NCBI-GEO數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)，用關(guān)鍵詞查詢和選擇結(jié)腸癌血清外泌體相關(guān)的miRNAs表達(dá)數(shù)據(jù)集，從中獲得GSE39833數(shù)據(jù)集，該數(shù)據(jù)集是基于GPL14767平臺，包含了結(jié)腸癌患者及健康對照者血清學(xué)外泌體miRNAs的表達(dá)水平及部分臨床資料(年齡，性別及病理學(xué)分期)。應(yīng)用R(4.1.0版本)軟件在線下載TCGA數(shù)據(jù)庫(https://portal.gdc.cancer.gov/)中結(jié)腸癌miRNAs的表達(dá)數(shù)據(jù)集及結(jié)腸癌患者的臨床資料(年齡、性別、TNM分期等)。

1.2 GEO數(shù)據(jù)處理

選擇GSE39833數(shù)據(jù)集中Ⅰ-Ⅱ期結(jié)腸癌患者40例和健康對照11例，應(yīng)用在線工具GEO2R分析兩組之間血清外泌體差異表達(dá)的miRNAs，并作火山圖。GEO2R是GEO自帶的在線工具，用于篩選GEO系列中的兩個或更多樣本組間的差異基因，默認(rèn)應(yīng)用Benjamini-Hochberg方法測定錯誤發(fā)現(xiàn)率。

1.3 TCGA數(shù)據(jù)集驗證差異表達(dá)的miRNAs

應(yīng)用TCGAbiolinks包下載TCGA數(shù)據(jù)庫中結(jié)腸癌組織的miRNAs表達(dá)數(shù)據(jù)集，包括444例結(jié)腸癌組織和8例鄰近的正常組織。應(yīng)用DEseq2包分析兩組之間差異表達(dá)的miRNAs，篩選出驗證的目標(biāo)miRNA。以目標(biāo)miRNA的中位值為分界線，將結(jié)腸癌患者分為高表達(dá)組和低表達(dá)組，剔除生存期小于30天的患者，然后采用Log-rank方法進(jìn)行Kaplan-Meier生存分析并繪制生存曲線。最后，通過逐步Cox回歸分析確定目標(biāo)miRNA是結(jié)腸癌預(yù)后的獨立危險因素。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

所有統(tǒng)計學(xué)計算均采用R軟件(4.1.0版本)。|log2FC|>1，P<0.05和調(diào)整后的P<0.05作為識別差異表達(dá)miRNAs的閾值。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 差異表達(dá)分析

GSE39833和TCGA數(shù)據(jù)集中結(jié)腸癌患者的一般資料詳見表1。在GSE39833數(shù)據(jù)集中，經(jīng)在線GEO2R工具共鑒定到163個差異表達(dá)的miRNAs，12個miRNAs表達(dá)下調(diào)，151個miRNAs表達(dá)上調(diào) (見圖1)。與健康對照組比較，miR-23a顯著高表達(dá)于結(jié)腸癌患者血清外泌體中(log2FC=2.384，P<0.05和adj.P<0.05)；在TCGA數(shù)據(jù)庫下載的結(jié)腸癌數(shù)據(jù)集中，共鑒定出368差異表達(dá)的miRNAs，158個miRNAs表達(dá)下調(diào)，210個miRNAs表達(dá)上調(diào)。結(jié)果驗證miR-23a顯著高表達(dá)于結(jié)腸癌組織中，log2FC=2.5949，P<0.05和adj.P<0.05。

表1 GSE39833和TCGA數(shù)據(jù)集結(jié)腸癌患者的一般資料

圖1 GSE39833數(shù)據(jù)集中差異表達(dá)miRNAs篩選火山圖

2.2 miR-23a高表達(dá)的預(yù)后評價

剔除TCGA數(shù)據(jù)集中生存時間小于30天的結(jié)腸癌患者，最終納入299例患者。根據(jù)miR-23a表達(dá)的中位值將上述299例結(jié)腸癌患者分為高表達(dá)組和低表達(dá)組，進(jìn)行l(wèi)og-rank生存分析。結(jié)果顯示，miR-23a高表達(dá)組患者總生存時間顯著短于低表達(dá)組(P=0.035，見圖2)。

圖2 TCGA數(shù)據(jù)集中結(jié)腸癌患者Kaplan-Meirer生存曲線

2.3 確定miR-23a是結(jié)腸癌預(yù)后的獨立危險因素

將TCGA數(shù)據(jù)集中結(jié)腸癌患者的臨床特征包括年齡、性別、TNM分析以及miR-23a表達(dá)情況進(jìn)行逐步Cox回歸分析，探索結(jié)腸癌預(yù)后的獨立危險因素。單因素Cox回歸分析結(jié)果表明年齡(HR=1.90，P=0.0388)、M分期(HR=0.49，P=0.0082)以及miR-23a(HR=2.05，P=0.0145)與結(jié)腸癌的預(yù)后相關(guān)；進(jìn)一步將年齡、M分期及miR-23a進(jìn)行多因素Cox回歸分析，結(jié)果顯示M分期(HR=0.53，P=0.0305)和miR-23a(HR=2.22，P=0.0481)與結(jié)腸癌患者預(yù)后顯著相關(guān)，miR-23a是結(jié)腸癌預(yù)后重要的獨立危險因素(見表2)。

表2 Cox回歸分析TCGA數(shù)據(jù)集中結(jié)腸癌的獨立危險因素

3 討論

外泌體是細(xì)胞外囊泡的一種，普遍存在于各種體液中，如血液、唾液、尿液、乳汁等。外泌體來源于細(xì)胞膜內(nèi)陷內(nèi)吞，可攜帶核酸、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)及代謝物被釋放到細(xì)胞外[9]。當(dāng)外泌體在細(xì)胞外循環(huán)時，這些外泌體可被臨近或遠(yuǎn)處的細(xì)胞吸收，在細(xì)胞間傳遞信息或者調(diào)節(jié)細(xì)胞功能[9-10]。大量研究已經(jīng)證實外泌體具有來源組織或細(xì)胞的特性，在生理及病理過程中發(fā)揮著舉足輕重的作用。尤其來源于特定免疫細(xì)胞的外泌體，如樹突狀細(xì)胞和B細(xì)胞，可介導(dǎo)對病原體和腫瘤的免疫調(diào)節(jié)[11-12]。腫瘤細(xì)胞來源的外泌體，通過腫瘤基因和腫瘤相關(guān)miRNA在腫瘤細(xì)胞之間以及腫瘤細(xì)胞和腫瘤基質(zhì)之間的轉(zhuǎn)移，在腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移以及治療應(yīng)答中發(fā)揮著重要的作用[13-14]。基于外泌體的上述特征，外泌體可作為有潛力的診斷標(biāo)志物用于腫瘤的診斷和預(yù)后評估。

外泌體核酸包括mRNA，miRNA，lcnRNA等多種核酸分子。MiRNA是小分子非編碼RNA，通過與靶mRNA的3’非編碼區(qū)或開放閱讀框結(jié)合，介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄后基因沉默，在各種生理及病理過程中被廣泛研究。外泌體miRNA具有負(fù)調(diào)控作用，通過調(diào)節(jié)靶基因表達(dá)水平影響腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。例如，來自乳腺癌細(xì)胞的外泌體miR-105降低內(nèi)皮細(xì)胞ZO-1基因表達(dá)，促進(jìn)乳腺癌肺轉(zhuǎn)移和腦轉(zhuǎn)移[15]。Goldie等人曾報道，在各種小RNA分子中，miRNA在外泌體中含量最高。正如一些研究所述，miRNA不是隨機(jī)進(jìn)入外泌體中的。在不同的病理狀態(tài)下，外泌體中miRNA種類及表達(dá)水平存在一定的差異。膠質(zhì)瘤患者外泌體中miR-21的表達(dá)水平顯著低于健康對照組。與健康對照組比較，非小細(xì)胞肺癌患者血漿外泌體中Let-7f和miR-20b表達(dá)水平明顯較低。外泌體miRNA已經(jīng)頻繁作為腫瘤診斷的標(biāo)志物被報道。外泌體miR-27a和miR-130a可作為結(jié)腸癌診斷和預(yù)后的標(biāo)志物，在獨立驗證試驗中，miR27a的診斷AUC值為0.82，miR-130a的AUC值為0.79[16]。

miR-23a的編碼基因位于19號染色體的p13.13位，通過抑制抑癌基因的表達(dá)從而促進(jìn)癌細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移和浸潤。多項研究顯示，在結(jié)腸癌細(xì)胞及組織中，miR-23a表達(dá)水平均顯著升高[8,17-18]。過度表達(dá)的miR-23a與晚期結(jié)腸癌以及結(jié)腸癌淋巴轉(zhuǎn)移浸潤相關(guān)。MiR-23a可綁定在PDK4 mRNA的3’非編碼區(qū)，抑制mRNA和 PDK4蛋白的表達(dá)，進(jìn)而抑制PDH基因活性影響結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖[19]。另有研究顯示miR-23a通過調(diào)節(jié) MARK1基因的表達(dá)促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移[8]。因此，miR-23a可作為有希望的結(jié)腸癌診斷和預(yù)后標(biāo)志物指導(dǎo)臨床。

本研究通過分析GSE39833數(shù)據(jù)集表明，與健康對照組比較，結(jié)腸癌患者血清外泌體中miR-23a顯著高表達(dá)，并通過TCGA數(shù)據(jù)集驗證，得到相同的結(jié)果。進(jìn)一步應(yīng)用生存分析和逐步Cox回歸分析，證實miR-23a與結(jié)腸癌患者預(yù)后顯著相關(guān)，是結(jié)腸癌預(yù)后的獨立危險因素。然而，本研究結(jié)果均基于在線數(shù)據(jù)庫分析所得，結(jié)果與既往研究結(jié)果一致，具有一定的指導(dǎo)作用，但結(jié)論尚需要大樣本前瞻性臨床研究進(jìn)一步證實。