范玉潔，司華哲，王曉旭，楊乾龍，張新宇，鐘偉，王凱英

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所，特種經(jīng)濟(jì)動(dòng)物分子生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林長(zhǎng)春 130112）

幼齡反芻動(dòng)物斷奶后因固體飼料的攝入其消化方式開始由非反芻向反芻轉(zhuǎn)變，瘤胃發(fā)酵功能和微生物區(qū)系不斷完善，瘤胃內(nèi)環(huán)境逐漸趨于穩(wěn)定［1］。大量研究表明［2-5］，通過調(diào)整幼齡反芻動(dòng)物飼糧結(jié)構(gòu)，可調(diào)控瘤胃發(fā)育、完善瘤胃微生物群落和微生態(tài)系統(tǒng)，促進(jìn)反芻動(dòng)物健康生長(zhǎng)。離乳期是梅花鹿生長(zhǎng)發(fā)育的關(guān)鍵時(shí)期，仔鹿身體各器官功能及各系統(tǒng)構(gòu)建均不完善，可塑性極強(qiáng)。因此，調(diào)整仔鹿飼糧結(jié)構(gòu)，會(huì)對(duì)梅花鹿的生長(zhǎng)發(fā)育以及后續(xù)鹿茸生產(chǎn)產(chǎn)生直接影響。精氨酸（arginine，Arg）作為幼齡哺乳動(dòng)物的條件性必需氨基酸，是機(jī)體合成蛋白質(zhì)最重要的氮源，精氨酸對(duì)各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的代謝起著重要的協(xié)同平衡作用，進(jìn)而調(diào)控動(dòng)物的生長(zhǎng)發(fā)育［6-7］。目前精氨酸在營(yíng)養(yǎng)方面的研究主要集中于單胃動(dòng)物，在反芻動(dòng)物尤其是幼齡反芻動(dòng)物上的研究則相對(duì)較少。本研究以離乳期梅花鹿為試驗(yàn)對(duì)象，在其飼糧中添加不同水平的精氨酸，調(diào)整基礎(chǔ)飼糧結(jié)構(gòu)，探究精氨酸水平對(duì)離乳期梅花鹿瘤胃發(fā)酵參數(shù)和微生物菌群結(jié)構(gòu)的影響，為精氨酸在仔鹿飼糧中的合理利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

選取3月齡健康離乳雄性梅花鹿仔鹿12只，隨機(jī)分為3組，每組4只，各組之間體重差異不顯著（P＞0.05）。仔鹿飼喂蛋白質(zhì)水平為12.28%的低蛋白質(zhì)飼糧，精氨酸水平分別為0.80%（A組）、1.08%（B組）、1.26%（C組）。按照各組飼糧精粗比相同，賴氨酸和蛋氨酸含量一致的原則，試驗(yàn)飼糧以玉米（Zea mays）、豆粕、酒糟蛋白、玉米胚芽、苜蓿（Medicago sativa）草粉、糖蜜、食鹽、預(yù)混料等為原料，按不同比例配制成顆?；旌先占Z（total mixed rations，TMR）。試驗(yàn)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平見表1，試驗(yàn)飼糧氨基酸含量見表2。試驗(yàn)于2019年8月27日至10月10日在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所茸鹿試驗(yàn)基地進(jìn)行。每天06：30和14：30分2次定量飼喂，自由飲水。試驗(yàn)期為50 d，其中預(yù)試期為15 d，正試期為35 d。

表1 試驗(yàn)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平（風(fēng)干基礎(chǔ)）Table 1 Composition and nutrient levels of experiment diets（air-dry basis）

表2 試驗(yàn)飼糧氨基酸含量（風(fēng)干基礎(chǔ)）Table 2 Amino acid contents of experiment diets（air-dry basis，%）

1.2 樣品采集

試驗(yàn)第50天，晨飼前麻醉仔鹿，使用瘤胃管通過口腔抽取瘤胃液20 mL，分裝在凍存管中，立即投入液氮，帶回實(shí)驗(yàn)室將瘤胃液保存于-80℃，一部分用于測(cè)定瘤胃發(fā)酵參數(shù)，另一部分用于提取DNA，測(cè)定瘤胃細(xì)菌的多樣性。

1.3 指標(biāo)測(cè)定及方法

1.3.1瘤胃發(fā)酵參數(shù)的測(cè)定 瘤胃液pH值采用PHS-3C型pH計(jì)（江蘇）進(jìn)行測(cè)定；揮發(fā)性脂肪酸（volatile fatty acid，VFA）濃度的測(cè)定參考Li等［8］的方法，采用安捷倫6890氣相色譜儀（美國(guó)）進(jìn)行測(cè)定，主要測(cè)定瘤胃液中乙酸（acetic acid，ACE）、丙酸（propionic acid，PRO）、丁酸（butyric acid，BUTY）、異丁酸（isobutyric acid，ISOB）、異戊酸（isovaleric acid，ISOV）和戊酸（valeric acid，VAL）濃度，并計(jì)算乙酸/丙酸（乙丙比）和總揮發(fā)性脂肪酸（total volatile fatty acid，TVFA）濃度；氨態(tài)氮（NH3-N）濃度的測(cè)定參考馮宗慈等［9］改進(jìn)的比色法。

1.3.2瘤胃細(xì)菌多樣性分析 將采集到的瘤胃液送至天津諾禾致源生物信息科技有限公司進(jìn)行16S rDNA測(cè)序。方法如下：采用CTAB或SDS方法對(duì)樣本的基因組DNA進(jìn)行提取，之后利用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的純度和濃度，取適量的樣本DNA于離心管中，使用無菌水稀釋樣本至1 ng·μL-1。以稀釋后的基因組DNA為模板，根據(jù)測(cè)序區(qū)域的選擇，使用帶Barcode的特異引物，對(duì)應(yīng)區(qū)域?yàn)?6S V4區(qū)引物（515F和806R），選擇New England Biolabs公司的Phusion? High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer和高效高保真酶進(jìn)行PCR，確保擴(kuò)增效率和準(zhǔn)確性。PCR產(chǎn)物使用2%濃度的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)并進(jìn)行PCR產(chǎn)物等濃度混樣，充分混勻后使用1×TAE的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行純化，選擇并回收主帶大小在400～450 bp的序列作為目標(biāo)條帶，使用膠回收試劑盒（qiagen公司）進(jìn)行回 收。使 用TruSeq? DNA PCR-Free Sample Preparation Kit建庫(kù)試劑盒進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建，構(gòu)建好的文庫(kù)經(jīng)過Qubit和Q-PCR定量，文庫(kù)合格后，使用NovaSeq 6000進(jìn)行上機(jī)測(cè)序。

測(cè)序得到的原始數(shù)據(jù)（raw data）進(jìn)行拼接、過濾，得到有效數(shù)據(jù)（clean data）。利用Uparse軟件（Uparse v7.0.1001，http：//www.drive5.com/uparse/）對(duì)所有樣本的全部有效數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類，默認(rèn)以97%的一致性（identity）將 序 列 聚 類 成 為OTUs（operational taxonomic units分類單元），篩選出OTUs的代表序列，進(jìn)行物種注釋分析（設(shè)定閾值為0.8～1.0）。對(duì)OTUs進(jìn)行Alpha和Beta多樣性指數(shù)組間差異分析，使 用Qiime軟 件（Version 1.9.1）計(jì) 算ACE，Chao1，Shannon，Simpson，Goods-coverage指 數(shù)；計(jì) 算Weighted Unifrac距離、構(gòu)建非加權(quán)組平均聚類分析（unweighted pair-group method with arithmetic means，UPGMA）樣本聚類樹。使用R軟件（Version 2.15.3）繪制主坐標(biāo)分析圖（principal co-ordinates analysis，PCoA），通過Amova分析來檢驗(yàn)不同組間差異顯著性。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

運(yùn)用Excel 2019進(jìn)行試驗(yàn)數(shù)據(jù)初步整理后，采用SAS 9.4軟件的ANOVA進(jìn)行單因素方差分析，采用Duncan氏法進(jìn)行多重比較分析組間差異顯著性，P＜0.05為差異顯著，P＜0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 精氨酸水平對(duì)梅花鹿仔鹿瘤胃發(fā)酵參數(shù)的影響

由表3可知，瘤胃pH隨著精氨酸水平的升高而逐漸降低，B組瘤胃液pH與A、C組之間無顯著差異（P＞0.05），A組顯著高于C組（P＜0.05）；C組氨態(tài)氮含量極顯著低于B組（P＜0.01），顯著低于A組（P＜0.05），A、B組之間無顯著差異（P＞0.05）；精氨酸水平對(duì)總揮發(fā)性脂肪酸、乙酸、異丁酸、丁酸、戊酸含量和乙丙比產(chǎn)生了極顯著或顯著影響（P＜0.01或P＜0.05），對(duì)丙酸、異戊酸無顯著影響（P＞0.05）。其中，A組乙酸、丁酸含量極顯著高于B、C組（P＜0.01），總揮發(fā)性脂肪酸含量顯著高于B、C組（P＜0.05），B、C組之間無顯著差異（P＞0.05）；B組異丁酸含量極顯著低于A組（P＜0.01），顯著低于C組（P＜0.05），A、C組之間無顯著差異（P＞0.05）；A、B組戊酸含量顯著高于C組（P＜0.05）；B組的乙丙比極顯著低于A、C組（P＜0.01），而A組顯著高于C組（P＜0.05）。

表3 不同精氨酸水平對(duì)離乳期梅花鹿瘤胃發(fā)酵參數(shù)的影響Table 3 Effects of arginine levels on rumen fermentation parameters of weaning sika deer

2.2 精氨酸水平對(duì)細(xì)菌豐富度和多樣性的影響

基于Illumina NovaSeq測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行16S rDNA測(cè)序，共獲得418397個(gè)有效序列，默認(rèn)以97%的一致性將有效序列進(jìn)行聚類，如圖1顯示，共產(chǎn)生2098個(gè)OTU，其中1021個(gè)是3組共有，占總OTU數(shù)量的48.67%，A組特有的OTU數(shù)量為245個(gè)，B組特有的OTU數(shù)量為207個(gè)，C組特有 的OTU數(shù)量為202個(gè)。

基于OTU聚類分析結(jié)果，進(jìn)行Alpha多樣性分析。由表4可知，3組ACE和Chao1指數(shù)變化趨勢(shì)一致，Simpson指數(shù)和Shannon指數(shù)變化趨勢(shì)相反。其中，B組ACE指數(shù)顯著高于C組（P＜0.05），而A組的ACE指數(shù)與B、C組之間均無顯著差異（P＞0.05）；B組的Chao1指數(shù)顯著高于A、C組（P＜0.05），A、C組之間無顯著差異（P＞0.05）。B組Simpson指數(shù)極顯著高于A、C組（P＜0.01），Shannon指數(shù)極顯著低于A、C組（P＜0.01），而A、C組之間無顯著差異（P＞0.05）。3組 的 覆 蓋 率（Goods_coverage）均 為99%（P＞0.05）。

表4 精氨酸水平對(duì)離乳期梅花鹿瘤胃微生物α多樣性的影響Table 4 Effects of different arginine levels on rumen microbial alpha diversity of weaning sika deer

Beta多樣性分析是對(duì)不同樣本的微生物群落構(gòu)成進(jìn)行比較分析，基于Weighted Unifrac距離進(jìn)行非加權(quán)組平均聚類分析（UPGMA）（圖2）和主坐標(biāo)分析（PCoA）（圖3），并通過Amova分析（表5）檢驗(yàn)各組間細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異顯著性，結(jié)果顯示，B、C組仔鹿瘤胃內(nèi)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)較為相似（P＞0.05），而二者與A組群落結(jié)構(gòu)差異顯著（P＜0.05）。

表5 Amova組間差異分析Table 5 Analysis by Amova group differences analysis

2.3 精氨酸水平對(duì)瘤胃細(xì)菌組成的影響

如圖4所示，根據(jù)物種注釋結(jié)果，本研究選取了各組仔鹿瘤胃液細(xì)菌在門（phylum）水平上豐度排名前10的物種，生成物種相對(duì)豐度柱形累加圖，以便直觀的了解各組仔鹿瘤胃細(xì)菌在門分類水平上相對(duì)豐度較高的細(xì)菌種類及其比例；由表6可知，3組的優(yōu)勢(shì)菌門均為擬桿菌門（Bacteroidetes）、厚壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria）。其中，B組擬桿菌門（Bacteroidetes）相對(duì)豐度極顯著低于A組（P＜0.01），且略低于C組（P＞0.05）；而B組厚壁菌門（Firmicutes）相對(duì)豐度顯著高于A組（P＜0.05）；B組變形菌門（Proteobacteria）相對(duì)豐度極顯著高于A組（P＜0.01），顯著高于C組（P＜0.05）；B組廣古菌門（Euryarchaeota）相對(duì)豐度極顯著低于A組（P＜0.01）；B組放線菌門（Actinobacteria）相對(duì)豐度極 顯 著 高 于A、C組（P＜0.01）；A組 螺 旋 菌 門（Spirochaetes）、纖維桿菌門（Fibrobacteres）相對(duì)豐度極顯著高于B、C組，其中纖維桿菌門（Fibrobacteres）相對(duì)豐度在B、C組之間也有顯著差異（P＜0.05）；C組軟壁菌門（Tenericutes）相對(duì)豐度極顯著高于A組（P＜0.01），顯 著 高 于B組（P＜0.05）；互 養(yǎng) 菌 門（Synergistetes）相對(duì)豐度在3組之間無顯著差異（P＞0.05）。

表6 各組仔鹿瘤胃液細(xì)菌門水平群落組成Table 6 Rumen bacteria composition on phylum level in three groups of weaning sika deer（%）

如圖5所示，根據(jù)物種注釋結(jié)果，選取了在屬（genus）水平上相對(duì)豐度排名前20的物種，生成物種相對(duì)豐度柱形累加圖，也能直觀的了解各組仔鹿瘤胃細(xì)菌在屬分類水平上相對(duì)豐度較高的細(xì)菌種類及其比例；由表7可知，未分類普雷沃氏菌科（unidentified_Prevotellaceae）為3組共有的優(yōu)勢(shì)菌，且相對(duì)豐度在3組之間無顯著差異（P＞0.05）。另外，A組的優(yōu)勢(shì)菌還包括甲烷短桿菌屬（Methanobrevibacter）和未分類疣微菌科（unidentified_Ruminococcaceae），B組的優(yōu)勢(shì)菌屬還包括琥珀酸弧菌屬（Succinivibrio）和戴阿利斯特桿菌屬（Dialister），C組的優(yōu)勢(shì)菌屬還包括琥珀酸弧菌屬（Succinivibrio）和解琥珀酸菌屬（Succiniclasticum）。A組甲烷短桿菌屬（Methanobrevibacter）、奎因氏菌屬（Quinella）、纖維桿菌屬（Fibrobacter）相對(duì)豐度極顯著高于B、C組（P＜0.01）；A組未分類螺旋體科（unidentified_Spirochaetaceae）相對(duì)豐度極顯著高于B組（P＜0.01），顯著高于C組（P＜0.05）；A組Agathobacter、互營(yíng)球菌屬（Syntrophococcus）相對(duì)豐度極顯著低于B組（P＜0.01），顯著低于C組（P＜0.05）；B組琥珀酸弧菌屬（Succinivibrio）相對(duì)豐度極顯著高于A組（P＜0.01），顯著高于C組（P＜0.05）；B組戴阿利斯特桿菌屬（Dialister）相對(duì)豐度顯著高于A組（P＜0.05）；C組解琥珀酸菌屬（Succiniclasticum）、未分類毛螺 菌 科（unidentified_Lachnospiraceae）、聚乙酸菌屬（Acetitomaculum）相對(duì)豐度極顯著高于A、B組（P＜0.01）；C組未分類理研菌科（unidentified_Rikenellaceae）相對(duì)豐度顯著高于A、B組（P＜0.05）；未分類韋榮氏球菌科（unidentified_Veillonellaceae）、歐陸森氏菌屬（Olsenella）、未分類疣微菌科（unidentified_Ruminococcaceae）、雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）、Kandleria、未分類擬桿菌目（unidentified_Bacteroidales）、厭氧弧菌屬（Anaerovibrio）相對(duì)豐度在3組之間無顯著差異（P＞0.05）。

表7 各組仔鹿瘤胃液細(xì)菌屬水平群落組成Table 7 Rumen bacteria composition on genus level in three groups of weaning sika deer（%）

3 討論

3.1 精氨酸水平對(duì)梅花鹿仔鹿瘤胃發(fā)酵參數(shù)的影響

瘤胃pH、氨態(tài)氮（NH3-N）濃度和揮發(fā)性脂肪酸（volatile fatty acid，VFA）比例等參數(shù)是研究瘤胃發(fā)酵狀況的重要指標(biāo)，能夠反映飼料在瘤胃內(nèi)的發(fā)酵程度和模式。瘤胃pH會(huì)受到飼糧結(jié)構(gòu)、采食速度、唾液分泌量以及瘤胃內(nèi)VFA含量的影響，VFA含量以及其在瘤胃中的吸收狀況也會(huì)因瘤胃pH的波動(dòng)而受到影響［10-11］。一般情況下，VFA含量增加，瘤胃pH會(huì)降低［12-13］。本研究中，隨著精氨酸水平的提高，瘤胃pH、乙酸、丁酸以及TVFA含量的變化趨勢(shì)為逐漸降低。3組試驗(yàn)飼糧結(jié)構(gòu)保持一致，精粗比相同，推測(cè)可能與瘤胃微生物種類及數(shù)量有關(guān)，此外，國(guó)內(nèi)外已有文獻(xiàn)報(bào)道［14-16］，瘤胃中VFA含量增加會(huì)解離出更多的H+，致使pH降低，瘤胃內(nèi)低pH更有利于VFA在瘤胃上皮被吸收（瘤胃pH在正常范圍時(shí)）。因此，瘤胃pH低，可促進(jìn)VFA的吸收進(jìn)而導(dǎo)致其在瘤胃中含量降低，本研究結(jié)果與上述研究結(jié)論一致。由此可間接推測(cè)，飼糧精粗比一致的情況下，精氨酸水平為1.08%和1.26%的飼糧增強(qiáng)了仔鹿瘤胃上皮對(duì)VFA的吸收能力，進(jìn)而提高仔鹿對(duì)飼料的消化率［17-18］。此外，本研究發(fā)現(xiàn)，3組之間丙酸含量無顯著差異，但精氨酸水平為1.08%時(shí)仔鹿瘤胃中丙酸含量略高于其他組，而乙丙比極顯著或顯著低于其他組；表明精氨酸水平為1.08%時(shí)，仔鹿瘤胃發(fā)酵模式以丙酸型發(fā)酵為主，精氨酸水平為0.80%組的仔鹿則以乙酸型發(fā)酵為主，精氨酸水平為1.26%時(shí)介于兩者之間。Ryle等［19］研究表明，瘤胃中發(fā)酵產(chǎn)生的乙酸、丙酸和丁酸分別為機(jī)體提供的能量為總能量（2805 kJ·mol-1）的62%，109%和78%，因此瘤胃進(jìn)行丙酸型發(fā)酵時(shí)能為機(jī)體提供更多的能量。Shabat等［20］、李宗軍［21］和董春曉等［22］的研究也證實(shí)，當(dāng)瘤胃發(fā)酵模式由乙酸型發(fā)酵向產(chǎn)生更多丙酸的模式轉(zhuǎn)變時(shí)，可以有效提高機(jī)體能量代謝和飼料轉(zhuǎn)化效率，促使幼齡反芻動(dòng)物在早期獲得更大的體重。由此可知，仔鹿飼糧中精氨酸水平為1.08%時(shí)，可以改變仔鹿瘤胃發(fā)酵模式，提高瘤胃供能效率，促進(jìn)仔鹿生長(zhǎng)發(fā)育。瘤胃NH3-N主要由飼糧中的氨基酸、蛋白質(zhì)和非蛋白氮化合物降解產(chǎn)生，是瘤胃微生物合成菌體蛋白的主要氮源［23-24］。精氨酸是機(jī)體合成蛋白質(zhì)和DNA的重要氮源［25-26］。因此，精氨酸水平可能會(huì)影響瘤胃NH3-N濃度，進(jìn)而影響瘤胃中蛋白降解與菌體蛋白合成間的動(dòng)態(tài)平衡。瘤胃NH3-N濃度正常范圍是5.0～30.0 mg·dL-1［27］。呂小康［28］的研究結(jié)果表明，因山羊羔羊的瘤胃NH3-N濃度降低，導(dǎo)致其微生物蛋白的合成受到抑制。本研究中，隨著飼糧精氨酸水平的提高，瘤胃NH3-N濃度呈先上升后下降的趨勢(shì)，精氨酸水平為1.26%時(shí)仔鹿瘤胃氨態(tài)氮濃度顯著或極顯著低于其他兩組，且濃度略低于正常范圍，說明在特定飼糧組成下，精氨酸水平過高，會(huì)使仔鹿瘤胃NH3-N濃度降低，從而造成蛋白降解與菌體蛋白合成之間失衡，而合理提高精氨酸水平能夠有效促進(jìn)瘤胃對(duì)飼料的消化吸收，進(jìn)而提高仔鹿瘤胃微生物活性，促進(jìn)仔鹿生長(zhǎng)。

3.2 精氨酸水平對(duì)細(xì)菌豐富度和多樣性的影響

新生斷奶仔鹿在特定飼糧結(jié)構(gòu)的影響下，最終構(gòu)成特定的瘤胃微生物群落，同時(shí)造成仔鹿的采食偏好，影響各細(xì)菌群落的生長(zhǎng)效率及數(shù)量［29-31］。通過比較Chao1，ACE指數(shù)，可以反映一個(gè)群落或生境中物種數(shù)目的多少，即群落豐富度；比較Shannon，Simpson指數(shù)，可以反映該樣品中的分類總數(shù)和每個(gè)分類所占的比例，即群落多樣性。群落多樣性越高，物種分布越均勻，Shannon指數(shù)值越大，Simpson與之相反。群落覆蓋率（goods_coverage）能夠反映是否取樣充分。本研究中，由表4可知，3組的覆蓋率均為99%，說明本研究取樣充分，能較好地反映出瘤胃液中微生物菌群的多樣性；精氨酸水平為1.08%組的Chao1指數(shù)值顯著高于其他組，Simpson指數(shù)值極顯著高于其他組，Shannon指數(shù)值與其相反，說明精氨酸水平為1.08%時(shí)，仔鹿瘤胃細(xì)菌較其他組豐富，但各物種分布不均，推測(cè)其優(yōu)勢(shì)菌群占總細(xì)菌群落比例較高，需要結(jié)合瘤胃細(xì)菌豐度分析的結(jié)果來驗(yàn)證；另外，本研究通過UPGMA聚類樹和PCoA分析，結(jié)合Amova組間差異分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，精氨酸水平為1.08%和1.26%時(shí)，仔鹿瘤胃細(xì)菌具有較相似的群落結(jié)構(gòu)，但與精氨酸水平為0.80%組的仔鹿瘤胃細(xì)菌存在明顯差異。這些結(jié)果說明，瘤胃液中的細(xì)菌群落因精氨酸水平的差異而發(fā)生了變化。Dias等［32］、Jami等［33］和Koringa等［34］對(duì)犢牛的研究顯示，微生物群落在犢牛生命早期變化很大，隨著固體飼料的攝入，大量微生物逐漸引入并以一種特定的、漸進(jìn)的順序定殖于瘤胃形成菌群對(duì)飼料進(jìn)行消化利用，隨后逐漸建立穩(wěn)定的瘤胃微生物區(qū)系。早期特定的飼糧結(jié)構(gòu)也會(huì)影響定殖的微生物群落豐富度和多樣性。由此可知，本研究飼糧中精氨酸水平能夠影響仔鹿瘤胃細(xì)菌的多樣性以及改變細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，適當(dāng)提高精氨酸水平能夠提高細(xì)菌豐富度，改變瘤胃中優(yōu)勢(shì)菌群所占的比例。

3.3 精氨酸水平對(duì)瘤胃細(xì)菌組成的影響

飼料中的碳水化合物被瘤胃內(nèi)各種細(xì)菌發(fā)酵，并被轉(zhuǎn)化成各種揮發(fā)性脂肪酸。因此，瘤胃內(nèi)產(chǎn)生的乙酸、丙酸和丁酸的比例除了受到飼料結(jié)構(gòu)和類型的影響外，還與瘤胃細(xì)菌的種類和數(shù)量有關(guān)［35-36］。本研究對(duì)瘤胃菌群門水平下的豐度分析中發(fā)現(xiàn)，擬桿菌門、厚壁菌門和變形菌門在所有仔鹿的瘤胃細(xì)菌中占主導(dǎo)地位。這與前人對(duì)幼齡反芻動(dòng)物的研究結(jié)果一致［37-38］，說明仔鹿瘤胃菌群中優(yōu)勢(shì)菌門不會(huì)因精氨酸水平的變化而發(fā)生改變，與其他幼齡反芻動(dòng)物一致；但隨著飼糧的變化其相對(duì)豐度會(huì)發(fā)生適應(yīng)性改變［39］。本研究中，精氨酸水平為1.08%時(shí)，與另外兩組相比，仔鹿瘤胃中擬桿菌門豐度有所降低，厚壁菌門豐度則顯著提高；與擬桿菌門主要分解非結(jié)構(gòu)多糖不同，厚壁菌門與結(jié)構(gòu)多糖的降解有關(guān)［40］。在飼糧精粗比一致的條件下，結(jié)合本研究未發(fā)表有關(guān)NDF營(yíng)養(yǎng)消化率數(shù)據(jù)顯示，精氨酸水平為1.08%時(shí)，NDF營(yíng)養(yǎng)消化率顯著高于其他組，表明適當(dāng)提高精氨酸水平，可以改變擬桿菌門和厚壁菌門的比例，增加的厚壁菌門促進(jìn)了飼料中纖維素的消化率；Turnbaugh等［41］指出，厚壁菌門更易攝取飼料中可發(fā)酵碳水化合物，從而加快機(jī)體對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收利用和能量代謝。本研究還發(fā)現(xiàn)，精氨酸水平為0.80%和1.26%時(shí)，擬桿菌門與厚壁菌門之和均高于精氨酸水平為1.08%組，造成此結(jié)果的原因可能是擬桿菌門與厚壁菌門降解飼糧的速率較慢，需要更多細(xì)菌參與。來自擬桿菌門的普雷沃氏菌屬已被證明是反芻動(dòng)物瘤胃內(nèi)豐度最高的菌屬［42-43］，而本研究中，并未檢測(cè)到該菌屬，但檢測(cè)到與其相關(guān)的未分類普雷沃氏菌科可作為仔鹿的優(yōu)勢(shì)菌屬，在瘤胃內(nèi)降解飼料中的碳水化合物、蛋白質(zhì)、氨基酸等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)并通過發(fā)酵產(chǎn)生乙酸、丙酸等為機(jī)體供能［44］。這與Si等［45］的研究結(jié)果類似。另外，精氨酸水平為1.08%時(shí)，變形菌門豐度顯著高于其他組，該門類下的琥珀酸弧菌屬也是該組仔鹿的絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌屬，有研究報(bào)道［46-48］，琥珀酸弧菌屬通過與產(chǎn)甲烷菌爭(zhēng)奪H作為底物產(chǎn)生琥珀酸進(jìn)而通過蘋果酸-琥珀酸途徑產(chǎn)生丙酸，從而限制甲烷的生成；精氨酸水平為0.80%組的甲烷短桿菌屬豐度極顯著高于其他兩組，是該組仔鹿的優(yōu)勢(shì)菌屬，該菌屬在其他反芻動(dòng)物瘤胃微生物的研究中也有報(bào)道［49-51］。以上結(jié)果可知，適宜水平的精氨酸能夠增加琥珀酸弧菌屬豐度，從而促進(jìn)瘤胃發(fā)酵向丙酸發(fā)酵模式轉(zhuǎn)變，還可以降低甲烷的產(chǎn)生；而精氨酸水平過低，會(huì)促使甲烷短桿菌屬豐度增加，導(dǎo)致甲烷排放量增加，從而對(duì)環(huán)境造成負(fù)面影響。值得注意的是，在精氨酸水平為1.08%組的仔鹿瘤胃內(nèi)檢測(cè)到Dialister，為該組菌屬豐度排名第3的菌屬；據(jù)報(bào)道［52］，Dialister是一種專性厭氧的革蘭氏陰性細(xì)菌，能夠利用琥珀酸脫羧基生成丙酸；Cui等［53］在牦牛犢瘤胃中也檢測(cè)到Dialister且證實(shí)該菌種與牦牛犢的生長(zhǎng)性能呈正相關(guān)。精氨酸水平為1.26%組檢測(cè)到的未分類普雷沃氏菌科和琥珀酸弧菌屬的豐度相比于其他兩組并不占優(yōu)勢(shì)，但解琥珀酸菌屬的豐度有所增加，該菌屬主要功能是將琥珀酸轉(zhuǎn)化為丙酸，為宿主提供能量，但不能發(fā)酵飼料中的碳水化合物和氨基酸［54］。因此，精氨酸水平過高可為宿主提供少量丙酸，但并不能促進(jìn)飼料的消化吸收。

4 結(jié)論

在本試驗(yàn)條件下，飼糧精氨酸水平為1.08%時(shí)，能夠顯著提高梅花鹿仔鹿瘤胃菌群豐富度并改變細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和優(yōu)勢(shì)菌比例；提高厚壁菌門和變形菌門豐度，降低擬桿菌門豐度；提高未分類普雷沃氏菌科、琥珀酸弧菌屬和Dialister豐度，能夠促使仔鹿的瘤胃發(fā)酵方式轉(zhuǎn)變?yōu)楸嵝桶l(fā)酵，增強(qiáng)機(jī)體供能。