向一立，鐘 璇，付晶晶，吳文雨，邵國(guó)強(qiáng)，王 峰，張 俊

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇 南京 210023；2.泰州市人民醫(yī)院 核醫(yī)學(xué)科，江蘇 泰州 225300；3.南京醫(yī)科大學(xué)附屬南京醫(yī)院、南京市第一醫(yī)院 核醫(yī)學(xué)科，江蘇 南京 210006)

成纖維細(xì)胞活化蛋白(fibroblast activation protein, FAP)在多種腫瘤的相關(guān)成纖維細(xì)胞中高度表達(dá)，但在正常組織表達(dá)有限，F(xiàn)AP同時(shí)還具有二肽基肽酶(the dipeptidyl peptidase, DPP)和肽鏈內(nèi)切酶活性，成為一種獨(dú)特的診療靶點(diǎn)[1-2]。目前，已有靶向FAP的多肽、抗體、納米顆粒和小分子抑制劑[3]等相關(guān)研究報(bào)道，其中FAP小分子抑制劑(FAP inhibitor, FAPI)備受關(guān)注。基于Jansen等[4-5]研究，Lindner和Loktev等[6-8]研發(fā)了一系列FAPI衍生物，其中FAPI-04展現(xiàn)了較好的應(yīng)用潛力。Kratochwil等[9]將68Ga-FAPI-04應(yīng)用于28種不同腫瘤顯像，分析得出一系列潛在適應(yīng)癥，如肉瘤、食管癌、肺癌、乳腺癌、膽管癌等，表明68Ga-FAPI-04可能在腫瘤診斷、分期、療效評(píng)估等方面具有良好前景。68Ga-FAPI-04是廣譜親腫瘤顯像劑，目前已開始用于臨床研究，但臨床對(duì)其最佳顯像適應(yīng)證仍處于探索階段。國(guó)內(nèi)已有研究顯示，肝癌HepG2荷瘤裸鼠的68Ga-FAPI-04 micro-PET腫瘤顯像清晰[10]。由于臨床常用的PET顯像劑18F-FDG在正常腦組織高度攝取，其在腦腫瘤中的診斷價(jià)值有限。研究發(fā)現(xiàn)，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中內(nèi)皮細(xì)胞和周細(xì)胞等多種細(xì)胞均表達(dá)FAP，因此可利用此靶點(diǎn)對(duì)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤進(jìn)行診斷和治療[11-15]。已有多項(xiàng)臨床前研究通過(guò)FAP酶活性抑制劑、FAP疫苗[16]、FAP特異性嵌合體抗原受體T細(xì)胞[17]、放射性標(biāo)記抗FAP單克隆抗體等方法對(duì)腫瘤進(jìn)行靶向診療。Pandya等[3]用放射性標(biāo)記抗FAP單克隆抗體F19，對(duì)FAP陽(yáng)性的U87MG荷瘤鼠進(jìn)行了一系列研究，89Zr-Df-Bz-F19的切倫科夫發(fā)光成像(cerenkov luminescence imaging, CLI)和micro-PET均顯示了良好的腫瘤攝取與較高的TBR。在核醫(yī)學(xué)和放射性藥物研究領(lǐng)域，通過(guò)靶向FAP對(duì)腫瘤進(jìn)行PET顯像是目前的研究熱點(diǎn)之一。本研究利用68Ga標(biāo)記FAPI-04，對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤進(jìn)行體內(nèi)外研究，評(píng)估其在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤PET顯像中的價(jià)值，通過(guò)生物分布、顯像分析68Ga-FAPI-04更佳適應(yīng)證。

1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器

1.1 細(xì)胞株和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

人腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株U87MG：美國(guó)ATCC公司；8只4～6周BALB/c雌性裸鼠，20只4～6周齡雌性ICR小鼠：許可證號(hào)為SCXK(蘇)2016-0010，均于無(wú)特殊病原體(specific-pathogen free, SPF)環(huán)境中飼養(yǎng)，常州卡文斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。

1.2 主要試劑

FAPI-04前體：江蘇華益公司；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)、磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered solution, PBS)：Gibco公司；Ultrapure純水、30%Ultrapure鹽酸：MerckGmbh公司；99.999%醋酸鈉：Sigma公司；無(wú)水檸檬酸：福州MXB 生物技術(shù)；FAP多克隆抗體：湖南艾方公司；生物素II抗、DAB顯色系統(tǒng)：上海Dako公司。

1.3 主要儀器

68Ge-68Ga發(fā)生器：德國(guó)ITG公司；高效液相色譜儀(high performance liquid chromatog-raphy, HPLC)：LC-20AT，日本島津公司；放射活度計(jì)：CRC-25PET，美國(guó)Capintec公司；Zorbax Rax-C18柱：江蘇漢邦科技有限公司；Sep-Pak C18 Plus Light固相萃取柱：美國(guó)Waters公司；γ計(jì)數(shù)器：美國(guó)WIZARD，PerkinElmer公司；micro-PET/CT：Inveon，西門子公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 68Ga-FAPI-04的制備

將FAPI-04前體溶于0.25 mol/L乙酸鈉溶液中備用。以5 mL 0.05 mol/L HCl淋洗68Ge-68Ga發(fā)生器，以1 mL/管分別收集淋洗液，取其中活度最高管用于后續(xù)標(biāo)記。在68Ga淋洗液中加入20 μg前體，并以乙酸鈉溶液調(diào)節(jié)淋洗液pH至4.0，置于100 ℃金屬浴反應(yīng)10 min。冷卻后通過(guò)C18柱，以5 mL生理鹽水沖洗除去雜質(zhì)，加入1 mL 體積分?jǐn)?shù)60%乙醇淋洗并收集產(chǎn)品，用生理鹽水稀釋后備用。68Ga-FAPI-04的合成路線示于圖1。

圖1 68Ga-FAPI-04的合成路線

2.2 68Ga-FAPI-04的質(zhì)量控制及體外穩(wěn)定性

2.2.1質(zhì)量控制 采用放射性HPLC檢測(cè)標(biāo)記率，計(jì)算放化純度。分析條件如下：流動(dòng)相A為含體積分?jǐn)?shù)0.1%三氟乙酸的水，流動(dòng)相B為含體積分?jǐn)?shù)0.1%三氟乙酸的乙腈。流速為1 mL/min。洗脫梯度為：0～5 min：流動(dòng)相B為0～10%，流動(dòng)相A為100%～90%；5～10 min：流動(dòng)相B為10%～50%，流動(dòng)相A為90%～50%；10～15 min：流動(dòng)相B為50%～100%，流動(dòng)相A為50%～0%。分析柱為Zorbax Rax-C18柱。紫外檢測(cè)器波長(zhǎng)為220 nm。

2.2.2體外穩(wěn)定性 將標(biāo)記物分別置于胎牛血清(FBS)與磷酸鹽緩沖液(PBS)中37 ℃孵育2 h，于0、1、2 h取樣用放射性HPLC測(cè)定，方法如2.2.1小節(jié)。

2.3 脂水分配系數(shù)

取3 μL純化后的68Ga-FAPI-04，加入含有 500 μL正辛醇及500 μL PBS 緩沖液的EP管中，室溫震蕩1 min，1.2×104r/min離心5 min，設(shè)3個(gè)復(fù)管。依次從 3 個(gè)EP 管中取有機(jī)相及水相各 200 μL，用γ計(jì)數(shù)器測(cè)量放射性計(jì)數(shù)。計(jì)算LogP值，LogP=Log(正辛醇γ計(jì)數(shù)/PBSγ計(jì)數(shù))。

2.4 小鼠體內(nèi)生物分布

2.4.1正常小鼠生物分布 取健康ICR小鼠20只，隨機(jī)分為5組，每組4只。每只小鼠均尾靜脈注射3.7 MBq68Ga-FAPI-04(0.1 mL)。分別于注射后5、15、30、60、120 min進(jìn)行眼球取血，并解剖分離出心、肝、膽囊、脾、肺、腎、胃、腸、胰、腦、肌肉、骨骼等器官和組織，生理鹽水清洗并吸去多余水分后置于相應(yīng)編號(hào)的空計(jì)數(shù)管內(nèi)。分別稱量各器官質(zhì)量后用γ計(jì)數(shù)儀測(cè)量放射性計(jì)數(shù)，并計(jì)算放射性攝取率(%ID/g)。

2.4.2荷瘤鼠生物分布 4只U87MG荷瘤裸鼠經(jīng)尾靜脈注射0.1 mL 3.7 MBq示蹤劑，90 min眼眶取血后用頸椎脫臼法處死，取腫瘤、心、肝、膽囊、脾、肺、腎、胃、腸、胰、腦、肌肉、骨骼等組織樣本，稱重后用γ計(jì)數(shù)儀測(cè)量各組織的放射性計(jì)數(shù)，并計(jì)算放射性攝取率(%ID/g)以及腫瘤/腦的放射性攝取比。

2.5 U87MG荷瘤鼠micro-PET顯像

選取4只BALB/c裸鼠，分別于雙上肢肩背部注射0.1 mL 5×106個(gè)U87MG細(xì)胞，待腫瘤直徑約1 cm時(shí)用于實(shí)驗(yàn)。每只U87MG荷瘤鼠經(jīng)異氟烷氣體麻醉，尾靜脈注射68Ga-FAPI-04(0.1 mL 3.7 MBq)后30、60、90、120 min進(jìn)行micro-PET 靜態(tài)掃描，采集時(shí)間為10 min，能峰350～650 keV，衰減校正后經(jīng)計(jì)算機(jī)重建得到U87MG荷瘤鼠靜態(tài)顯像圖像。勾畫荷瘤鼠主要臟器及腫瘤的感興趣區(qū)域(region of interest, ROI)，繪出時(shí)間放射性曲線(time to activity curve, TAC)。

2.6 HE染色及免疫組化

U87MG荷瘤鼠顯像完成后，分離出腫瘤組織，福爾馬林固定、石蠟包埋后進(jìn)行HE染色。將FAP抗體稀釋后行EnVision二步法染色。石蠟切片脫蠟至水后置入檸檬酸微波抗原修復(fù)，3% H2O2室溫孵育，滴加FAP 抗體、Ⅱ抗，二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine, DAB)顯色、脫水、透明、封片。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

3 結(jié)果與討論

3.1 68Ga-FAPI-04的標(biāo)記合成與質(zhì)量控制

68Ga-FAPI-04合成時(shí)間約20 min，放化產(chǎn)率為68.21%±2.67%(n=3)，純化后放射性濃度為65.86～90.65 MBq/mL，標(biāo)記率為97.38%±1.32%(圖2)，尾靜脈注射前用生理鹽水稀釋使殘留乙醇濃度<10%，68GaCl3的保留時(shí)間為(2.8±0.1)min，68Ga-FAPI-04示蹤劑保留時(shí)間為(5.4±0.1)min。純化后68Ga-FAPI-04的放化純度為100.00%±0.00%(n=3)(圖2c)。產(chǎn)物為無(wú)色透明溶液，pH在6.0～7.0之間。

圖2 68Ga-FAPI-04的放射性HPLC分析圖

3.2 68Ga-FAPI-04的體外穩(wěn)定性

標(biāo)記物置于PBS及FBS中37℃孵育2 h后放化純度均為100%(圖3)，68Ga-FAPI-04體外穩(wěn)定性好。68Ga-FAPI-04置于PBS中37 ℃孵育0、1、2 h的保留時(shí)間分別為5.0、4.8、5.0 min，置于FBS中37 ℃孵育0、1、2 h的保留時(shí)間分別為5.3、5.2、5.2 min。

圖3 68Ga-FAPI-04體外穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)放射性HPLC分析圖

與單克隆抗體F19相比，F(xiàn)API-04為小分子，耐高溫并且具有對(duì)FAP的親和力高、可標(biāo)記多種核素等優(yōu)勢(shì)。89Zr-Df-Bz-F19制備復(fù)雜、89Zr4+與螯合劑結(jié)合不穩(wěn)，而68Ga-FAPI-04標(biāo)記簡(jiǎn)易、標(biāo)記率高、68Ga與DOTA螯合緊密、耐高溫。本實(shí)驗(yàn)成功制備了68Ga-FAPI-04，并進(jìn)行了生物分布和腦膠質(zhì)瘤模型的micro-PET顯像研究。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，68Ga-FAPI-04標(biāo)記方便，標(biāo)記率大于95%，在生理?xiàng)l件下孵育2 h仍可維持自身基本性狀，證實(shí)68Ga-FAPI-04體外穩(wěn)定性好，為后續(xù)的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)提供了保證。

3.3 68Ga-FAPI-04的脂水分配系數(shù)

68Ga-FAPI-04的脂水分配系數(shù)LogP為-3.376±0.083(n=3)(表1)，說(shuō)明示蹤劑親水性較強(qiáng)。

表1 68Ga-FAPI-04在PBS及正辛醇中的放射性計(jì)數(shù)

3.4 小鼠體內(nèi)生物分布

尾靜脈注射68Ga-FAPI-04后正常小鼠的生物分布結(jié)果示于圖4，U87MG荷瘤鼠生物分布示于圖5。標(biāo)記物在正常小鼠中主要通過(guò)腎臟排泄，5 min時(shí)的放射性攝取率為(40.43±12.71)%ID/g，120 min時(shí)僅為(1.38±0.07)%ID/g。68Ga-FAPI-04在血液中清除快，5 min時(shí)的放射性攝取率為(12.84±0.57)%ID/g，15 min時(shí)已降至(4.94±2.73)%ID/g。肝、膽囊、脾、胃、腸、腦中的攝取較低，尤其腦中5 min的攝取值為(0.51±0.11)%ID/g，120 min時(shí)僅為(0.03±0.00)%ID/g。U87MG荷瘤裸鼠給藥后90 min可見腫瘤組織放射性濃聚，放射性攝取率為(1.68±0.28)%ID/g，腎臟為(14.36±5.40)%ID/g，腦部放射性攝取率低，為(0.09±0.01)%ID/g。

圖4 68Ga-FAPI-04在正常小鼠的體內(nèi)生物學(xué)分布

圖5 68Ga-FAPI-04在U87MG荷瘤鼠的體內(nèi)生物學(xué)分布(n=4)

68Ga-FAPI-04脂水分配系數(shù)測(cè)定實(shí)驗(yàn)顯示，68Ga-FAPI-04親水性強(qiáng)，提示腎臟為主要排泄器官，與健康ICR小鼠生物分布及U87MG荷瘤鼠micro-PET圖像結(jié)果一致。生物分布結(jié)果顯示，68Ga-FAPI-04在血液中清除快，肺、肝、脾和腦中的攝取較低，在腦中攝取最低。U87MG荷瘤鼠micro-PET顯像結(jié)果顯示，腦部放射性攝取較少，與生物分布結(jié)果一致，腫瘤攝取明顯，腫瘤與腦的TBR高。國(guó)內(nèi)已有學(xué)者將68Ga-FAPI-04用于肝癌模型顯像，腫瘤部位可見示蹤劑的特異性攝取，腫瘤與肝的TBR較高[10]。與此肝癌模型相比，U87MG皮下移植瘤與腦的TBR更高，這可能與FAP在U87MG膠質(zhì)瘤中高表達(dá)而在正常腦組織中低表達(dá)有關(guān)。由生物分布結(jié)果可知，68Ga-FAPI-04在肝臟中的攝取較低，但仍高于其在腦中的攝取，68Ga-FAPI-04在腦中本底更低。另一方面，有文獻(xiàn)指出[11]，F(xiàn)AP在腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)引人注目，且普遍表達(dá)于腦膠質(zhì)瘤血管及血管周圍，這可能是腦膠質(zhì)瘤攝取68Ga-FAPI-04高于其他類型腫瘤的原因。因此，68Ga-FAPI-04可能更適用于新生血管豐富腫瘤的臨床顯像應(yīng)用。

3.5 荷瘤鼠micro-PET顯像

U87MG荷瘤鼠注射68Ga-FAPI-04 后30、60、90、120 min的靜態(tài)掃描圖像(圖6)顯示，腎臟與膀胱均高放射性攝取，表明68Ga-FAPI-04親水性好，主要通過(guò)腎臟排泄，此結(jié)果與脂水分配系數(shù)和生物分布結(jié)果一致。腫瘤部位快速顯影，30 min已見腫瘤明顯攝取，但此時(shí)本底稍高。隨時(shí)間推移，本底逐漸降低，腫瘤部位放射性仍較濃聚，腫瘤在注射后30、60、90、120 min時(shí)的放射性攝取率分別為(2.10±0.14)%ID/g、(2.30±0.14)%ID/g、(2.50±0.00)%ID/g、(2.45±0.07)%ID/g，腫瘤輪廓清晰。腦部放射性攝取較少，68Ga-FAPI-04注射后30、60、90、120 min的TBR分別為(6.26±0.09)、(5.06±0.02)、(5.54±1.47)、(5.51±0.03)。

圖6 荷U87MG裸鼠注射68Ga-FAPI-04后不同時(shí)間micro-PET顯像圖(箭頭示腫瘤)

68Ga-FAPI-04 在U87MG荷瘤鼠腫瘤、腦、肌肉中的TAC示于圖7。由圖7結(jié)果可見，30～120 min腫瘤內(nèi)的放射性攝取較高且基本穩(wěn)定。腦、肌肉內(nèi)放射性攝取較低，隨時(shí)間延長(zhǎng)始終未見明顯攝取，120 min時(shí)腦、肌肉內(nèi)放射性攝取率分別為(0.44±0.01)%ID/g、(0.44±0.03)%ID/g。

圖7 68Ga-FAPI-04在U87MG荷瘤鼠腫瘤、腦、肌肉中的時(shí)間放射性曲線

18F-FDG可用于腦膠質(zhì)瘤的診斷、分期，但正常腦組織高葡萄糖代謝可導(dǎo)致18F-FDG濃聚，降低了腦部病灶檢出敏感性。本實(shí)驗(yàn)顯示，68Ga-FAPI-04在正常腦組織中極少攝取，遠(yuǎn)低于在肝臟中的攝取，這使得腦的本底更低，更利于發(fā)現(xiàn)腦部病變。既往研究顯示，F(xiàn)AP在多種腫瘤間質(zhì)高表達(dá)[18]。在腦膠質(zhì)瘤研究中，U87MG異種移植瘤組織可檢測(cè)到FAP蛋白[15]，進(jìn)一步研究顯示，F(xiàn)AP可由微環(huán)境中多種類型細(xì)胞表達(dá)，包括膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中內(nèi)皮細(xì)胞、周細(xì)胞等，腫瘤細(xì)胞也有部分表達(dá)[11]，這使得FAP成為膠質(zhì)瘤較好的診療靶點(diǎn)。micro-PET實(shí)驗(yàn)顯示，膠質(zhì)瘤裸鼠模型腫瘤顯影清晰，68Ga-FAPI-04注射120 min后TBR仍高達(dá)5.51±0.03，證實(shí)68Ga-FAPI-04對(duì)膠質(zhì)瘤具有較好的靶向性。但需注意的是，F(xiàn)AP除在腫瘤間質(zhì)表達(dá)外，也可在創(chuàng)傷愈合和瘢痕組織中表達(dá)[19]，因此膠質(zhì)瘤放療、化療或手術(shù)引起的修復(fù)過(guò)程可能導(dǎo)致FAP表達(dá)的改變，導(dǎo)致假陽(yáng)性顯像，實(shí)際臨床應(yīng)用時(shí)需要進(jìn)行鑒別。

3.6 組織病理

U87MG荷瘤鼠顯像完成后處死，取出腫瘤組織，進(jìn)行HE染色及免疫組化檢查，結(jié)果示于圖8。由圖8可知，U87MG膠質(zhì)瘤組織內(nèi)可見成纖維細(xì)胞胞膜及胞質(zhì)呈淡黃色或棕黃色，證明其中FAP呈陽(yáng)性表達(dá)。

a——鏡下100倍腫瘤組織HE染色；b——鏡下400倍腫瘤組織HE染色；c——鏡下100倍腫瘤組織免疫組化染色；d——鏡下400倍腫瘤組織免疫組化染色

4 結(jié)論

68Ga-FAPI-04標(biāo)記簡(jiǎn)易、標(biāo)記率高、體外穩(wěn)定性好、U87MG荷瘤鼠顯像效果佳，這為FAP表達(dá)豐富的神經(jīng)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤提供了潛在的新型PET顯像劑，為膠質(zhì)瘤診療提供了新的思路。