李霞，李慧，許聰聰，李軍峰，張冬冬

作者單位：1棗莊礦業(yè)集團中心醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，山東 棗莊 277800；2棗莊礦業(yè)集團棗莊醫(yī)院腫瘤科，山東 棗莊 277800；3棗莊市薛城區(qū)人民醫(yī)院腫瘤科，山東 棗莊 277800

肝癌是臨床常見的惡性腫瘤之一，其惡性程度高且發(fā)病迅速導(dǎo)致病人生存率降低，目前肝癌發(fā)病機制尚未完全闡明［1］。長鏈非編碼RNA（LncRNA）在肝癌等腫瘤組織中異常表達，并可能調(diào)控腫瘤細胞增殖、凋亡等過程從而抑制或促進腫瘤發(fā)生及發(fā)展，研究表明天然植物提取物可能通過調(diào)控LncRNA表達從而影響肝癌細胞增殖及凋亡等生物學(xué)過程［2-3］。但關(guān)于LncRNA與天然植物提取物調(diào)控的肝癌細胞增殖及凋亡過程之間的關(guān)系尚未完全闡明。肉靈芝又稱太歲，其主要組成成分為多糖類、維生素、氨基酸等，研究表明肉靈芝提取物具有抗腫瘤、抗氧化等作用［4］。但肉靈芝提取物對肝癌細胞增殖及凋亡的調(diào)控機制尚未闡明。長鏈非編碼

RNA NBR2（long non-coding RNA neighbour of BRCA1 gene 2，LncRNA NBR2）在結(jié)直腸癌中表達下調(diào)，姜黃素可通過上調(diào)LncRNA NBR2的表達而激活A(yù)MPK信號通路從而抑制結(jié)直腸癌發(fā)展進程［5］。雙特異性磷酸酶4/細胞外信號調(diào)節(jié)激酶（dual specificity protein phosphatase 4/extracellular signal regulated kinase，DUSP4/ERK）信號通路激活可促進胃癌細胞增殖及侵襲，而抑制DUSP4/ERK信號通路的活化可抑制胃癌細胞增殖及侵襲［6］。但肉靈芝提取物與LncRNA NBR2/DUSP4/ERK通路在肝癌細胞增殖及凋亡過程中的調(diào)控關(guān)系尚未可知。因此，本研究擬通過檢測肉靈芝提取物在抑制肝癌細胞Hep3B增殖及促進細胞凋亡過程中，LncRNA NBR2/DUSP4/ERK通路的表達變化，試圖闡明LncRNA NBR2/DUSP4/ERK通路可能參與肉靈芝提取物調(diào)控的Hep3B細胞增殖及凋亡過程，為肝癌靶向治療提供潛在靶點。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑肉靈芝提取物干粉購自吉林省白山市林源春生物科技有限公司；肝癌細胞Hep3B購自美國ATCC細胞庫；MTT、細胞凋亡檢測試劑盒購自美國Sigma公司；Lipofectamine2000、pcDNA3.1購自美國Invitrogen公司；si-LncRNA NBR2、si-NC購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司；Trizol試劑購自北京索萊寶科技有限公司；反轉(zhuǎn)錄與熒光定量檢測試劑盒購自日本TaKaRa公司；兔抗人增殖細胞核抗原（prolif-erating cell nuclear antigen，PCNA）、活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3（Cleaved-caspase-3）抗體購自美國CST公司；兔抗人DUSP4、p-ERK抗體購自美國Santa Cruz公司；HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組肉靈芝提取物干粉（1.5 g）溶解于蒸餾水（900 mL）中，充分混勻后轉(zhuǎn)移至容量瓶中（1 000 mL），定容至1 000 mL，充分混勻，制備濃度為1.5 g/L的肉靈芝提取物母液，采用0.22 μm的濾頭過濾母液后密封，置于-20℃冰箱內(nèi)保存，使用時進行稀釋，按照一定比例稀釋母液，調(diào)整藥物濃度分別為1 mg/L、2 mg/L、4 mg/L［7］。Hep3B細胞生長融合度達到80%時，加入0.25%胰蛋白酶消化，傳代培養(yǎng)。取對數(shù)生長期Hep3B細胞接種于96孔板（1×104個/孔），分別加入含有不同濃度（1 mg/L、2 mg/L、4 mg/L）的肉靈芝提取物的培養(yǎng)基處理24 h，分別記作1 mg/L肉靈芝提取物組、2 mg/L肉靈芝提取物組、4 mg/L肉靈芝提取物組。同時將正常培養(yǎng)的細胞作為NC組。后續(xù)實驗設(shè)置si-NC組（si-NC轉(zhuǎn)染至Hep3B細胞）、si-LncRNA NBR2組（si-LncRNA NBR2轉(zhuǎn)染至Hep3B細胞）、pcDNA-NC組（pcDNANC轉(zhuǎn)染至Hep3B細胞）、pcDNA-LncRNA NBR2組（pcDNA-LncRNA NBR2轉(zhuǎn)染至Hep3B細胞）、肉靈芝提取物+si-NC組（si-NC轉(zhuǎn)染至Hep3B細胞，加入含有濃度為4 mg/L肉靈芝提取物的培養(yǎng)基處理24 h）、肉靈芝提取物+si-LncRNA NBR2組（si-LncRNA NBR2轉(zhuǎn)染至Hep3B細胞，加入含有濃度為4 mg/L肉靈芝提取物的培養(yǎng)基處理24 h）。

1.2.2 四甲基偶氮唑鹽比色法（MTT）檢測細胞增殖取對數(shù)生長期Hep3B細胞接種至96孔板（5×103個/孔），按照“1.2.1”分組處理，加入MTT溶液（每孔20 μL），加入DMSO（每孔150 μL），應(yīng)用酶標(biāo)儀檢測各孔在波長為490 nm處的OD值。

1.2.3 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率收集各組Hep3B細胞，加入預(yù)冷PBS洗滌，棄上清，收集細胞沉淀，分別加入500 μL Binding Buffer懸浮細胞，按照凋亡試劑盒說明書操作，應(yīng)用流式細胞儀檢測各組細胞凋亡率。

1.2.4 實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRTPCR）檢測細胞中LncRNA NBR2的表達水平采用Trizol法提取細胞總RNA，將總RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以cDNA為模板進行qRT-PCR反應(yīng)。LncRNA NBR2以β肌動蛋白（β-actin）為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計算LncRNA NBR2相對表達量。

1.2.5 蛋白質(zhì)印跡法檢測PCNA、Cleaved-caspase-3、DUSP4、p-ERK蛋白表達提取細胞總蛋白，檢測蛋白濃度，SDS-PAGE分離蛋白，轉(zhuǎn)膜、封閉，分別加入一抗稀釋液（1∶1 000）與二抗稀釋液（1∶2 000），室溫孵育1 h，暗室內(nèi)曝光顯影，應(yīng)用Image J軟件分析各條帶灰度值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 21.0統(tǒng)計學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)，計量資料以±s表示且均符合正態(tài)分布，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，多組間兩兩比較采用SNK-q檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度肉靈芝提取物對Hep3B細胞增殖的影響與NC組比較，1 mg/L肉靈芝提取物組、2 mg/L肉靈芝提取物組、4 mg/L肉靈芝提取物組細胞增殖率降低（P＜0.05），PCNA蛋白水平降低（P＜0.05），選取4 mg/L肉靈芝提取物進行后續(xù)實驗，見圖1，表1。

圖1 不同濃度肉靈芝提取物抑制Hep3B細胞PCNA蛋白相對表達

表1 不同濃度肉靈芝提取物對Hep3B細胞增殖的影響/±s

表1 不同濃度肉靈芝提取物對Hep3B細胞增殖的影響/±s

注：①與NC組比較，P＜0.05。

組別NC 1 mg/L肉靈芝提取物2 mg/L肉靈芝提取物4 mg/L肉靈芝提取物F值P值重復(fù)次數(shù)9 9 9 9 PCNA 0.91±0.09 0.75±0.07①0.55±0.05①0.32±0.04①137.04＜0.001細胞增殖率/%100.27±9.14 81.24±7.68①62.12±6.01①38.06±3.17①135.09＜0.001

2.2 肉靈芝提取物對Hep3B細胞凋亡的影響與NC組比較，肉靈芝提取物組細胞凋亡率升高（P＜0.05），Cleaved-caspase-3蛋白水平升高（P＜0.05），見圖2，表2。

圖2 肉靈芝提取物抑制Cleaved-caspase-3蛋白的相對表達

表2 肉靈芝提取物對Hep3B細胞凋亡的影響/±s

表2 肉靈芝提取物對Hep3B細胞凋亡的影響/±s

組別NC肉靈芝提取物t值P值重復(fù)次數(shù)9 9 Cleaved-caspase-3 0.43±0.04 0.88±0.07 16.75＜0.001凋亡率/%8.69±0.71 25.16±2.21 21.29＜0.001

2.3 肉靈芝提取物對NBR2表達的影響與NC組比較，肉靈芝提取物組LncRNA NBR2的表達水平升高［（3.46±0.31）比（1.00±0.11），t=22.44，P＜0.05］。

2.4 NBR2對Hep3B細胞增殖和凋亡的影響與si-NC組比較，si-LncRNA NBR2組細胞增殖率、PCNA蛋白水平升高（P＜0.05），凋亡率及Cleaved-caspase-3蛋白水平降低（P＜0.05）；與pcDNA-NC組比較，pcDNA-LncRNA NBR2組細胞增殖率及PCNA蛋白水平降低（P＜0.05），凋亡率及Cleaved-caspase-3蛋白水平升高（P＜0.05），見圖3、表3。

表3 NBR2對Hep3B細胞增殖和凋亡的影響/±s

表3 NBR2對Hep3B細胞增殖和凋亡的影響/±s

注：①與si-NC組比較，P＜0.05。②與pcDNA-NC組比較，P＜0.05。

組別si-NC si-LncRNA NBR2 pcDNA-NC pcDNA-LncRNA NBR2 F值P值重復(fù)次數(shù)9 9 9 9 LncRNA NBR2 1.00±0.10 0.42±0.04①1.00±0.11 2.89±0.25①482.60＜0.001 PCNA 0.91±0.09 1.32±0.11①0.92±0.09 0.40±0.04②171.08＜0.001 Cleaved-caspase-3 0.46±0.04 0.19±0.02①0.48±0.05 0.83±0.08②227.45＜0.001細胞增殖率/%100.00±9.17 132.76±11.26①100.00±9.47 61.58±5.32②92.81＜0.001凋亡率/%8.51±0.72 3.89±0.31①8.63±0.73 18.16±1.71②317.87＜0.001

圖3 NBR2對Hep3B細胞中PCNA、Cleaved-caspase-3蛋白相對表達量的影響

2.5 LncRNA NBR2低表達可以逆轉(zhuǎn)肉靈芝提取物對Hep3B細胞增殖和凋亡的影響與肉靈芝提取物+si-NC組比較，肉靈芝提取物+si-LncRNA NBR2組細胞增殖率及PCNA蛋白水平升高（P＜0.05），凋亡率及Cleaved-caspase-3蛋白水平降低（P＜0.05），見圖4，表4。

表4 NBR2低表達可以逆轉(zhuǎn)肉靈芝提取物對Hep3B細胞增殖和凋亡的影響/±s

表4 NBR2低表達可以逆轉(zhuǎn)肉靈芝提取物對Hep3B細胞增殖和凋亡的影響/±s

注：①與肉靈芝提取物+si-NC組比較，P＜0.05。

組別肉靈芝提取物+si-NC肉靈芝提取物+si-LncRNA NBR2 t值P值重復(fù)次數(shù)9 9 LncRNA NBR2 1.00±0.09 0.46±0.03①17.08＜0.001 PCNA 0.30±0.04 0.73±0.07①16.00＜0.001 Cleaved-caspase-3 0.86±0.08 0.50±0.05①11.45＜0.001細胞增殖率/%100.00±10.32 152.12±14.76①17.19＜0.001凋亡率/%24.96±2.11 13.07±1.05①15.14＜0.001

圖4 LncRNA NBR2低表達逆轉(zhuǎn)肉靈芝提取物對Hep3B細胞中PCNA、Cleaved-caspase-3蛋白的相對表達

2.6 DUSP4/ERK信號通路蛋白表達情況與NC組比較，肉靈芝提取物組DUSP4、p-ERK蛋白水平降低（P＜0.05），si-LncRNA NBR2組DUSP4、p-ERK蛋白水平升高（P＜0.05）；與肉靈芝提取物+si-NC組比較，肉靈芝提取物+si-LncRNA NBR2組DUSP4、p-ERK蛋白水平升高（P＜0.05），見圖5，表5。

表5 DUSP4/ERK信號通路蛋白表達情況/±s

表5 DUSP4/ERK信號通路蛋白表達情況/±s

注：①與NC組比較，P＜0.05。②與肉靈芝提取物+si-NC組比較，P＜0.05。

組別NC肉靈芝提取物si-LncRNA NBR2肉靈芝提取物+si-NC肉靈芝提取物+si-LncRNA NBR2 F值P值重復(fù)次數(shù)9 9 9 9 9 DUSP4 0.79±0.07 0.35±0.03①1.02±0.09①0.38±0.04 0.70±0.06②189.59＜0.001 p-ERK1 0.37±0.03 0.12±0.01①0.45±0.04①0.04±0.01 0.34±0.03②382.88＜0.001 p-ERK2 0.60±0.06 0.27±0.02①0.88±0.09①0.25±0.03 0.58±0.05②199.54＜0.001 ERK1 0.42±0.04 0.40±0.04 0.39±0.03 0.41±0.04 0.38±0.03 1.71 0.168 ERK2 0.86±0.08 0.89±0.08 0.85±0.07 0.87±0.06 0.84±0.07 0.64 0.640

圖5 蛋白質(zhì)印跡法檢測肉靈芝提取物和LncRNA NBR2對DUSP4/ERK信號通路蛋白表達情況

3 討論

肝癌早期癥狀不明顯導(dǎo)致病人確診時已處于中晚期，而天然植物的有效成分具有抗炎、抗氧化及抗腫瘤等作用，且副作用較小，既往研究顯示胡蘿卜苷等中藥具有抗肝癌的作用，多種中藥具有多靶點、多效應(yīng)等作用，但關(guān)于其作用機制尚未闡明［8-9］。

肉靈芝提取物抗肝癌的作用機制尚未闡明，本研究結(jié)果顯示不同濃度的肉靈芝提取物可抑制肝癌細胞增殖，促進細胞凋亡，肉靈芝提取物處理后PCNA的表達下調(diào)，Cleaved-caspase-3的表達上調(diào)，與相關(guān)文獻報道結(jié)果相似［10-11］，證實肉靈芝提取物可抑制肝癌細胞增殖及誘導(dǎo)細胞凋亡。

NBR2在非小細胞肺癌中表達水平降低，并可能通過調(diào)節(jié)Notch1途徑而抑制非小細胞肺癌EMT進展［12］。NBR2表達上調(diào)可能通過調(diào)節(jié)Notch1信號傳導(dǎo)而抑制骨肉瘤細胞EMT轉(zhuǎn)化［13］。本研究結(jié)果顯示肉靈芝提取物處理后肝癌細胞中NBR2的表達水平升高，進一步分析顯示干擾NBR2表達后細胞增殖率升高，凋亡率降低，PCNA的表達水平升高，Cleaved-caspase-3的表達水平降低，而NBR2過表達后細胞增殖率降低，凋亡率升高，PCNA的表達水平降低，Cleaved-caspase-3的表達水平升高，提示肉靈芝提取物可能通過上調(diào)NBR2的表達從而發(fā)揮抗肝癌的作用。同時本研究結(jié)果顯示干擾NBR2表達可逆轉(zhuǎn)肉靈芝提取物對肝癌細胞增殖及凋亡的作用。ERK屬于MAPKs家族成員，DUSP4屬于雙特異性磷酸酶家族成員，其可通過促進ERK磷酸化從而促進細胞增殖，抑制DUSP4/ERK信號通路活化可抑制腫瘤細胞增殖及侵襲［14-15］。本研究結(jié)果顯示肉靈芝提取物可明顯降低DUSP4、p-ERK的表達水平，干擾NBR2表達后DUSP4、p-ERK蛋白水平明顯升高，而干擾NBR2表達與肉靈芝提取物共同處理后DUSP4、p-ERK蛋白水平明顯升高，提示NBR2可能通過抑制DUSP4/ERK信號通路激活而發(fā)揮作用，肉靈芝提取物可通過上調(diào)NBR2表達而調(diào)控DUSP4/ERK信號通路從而影響肝癌細胞增殖及凋亡過程。

綜上所述，NBR2/DUSP4/ERK通路介導(dǎo)肉靈芝提取物對肝癌細胞Hep3B細胞增殖的抑制作用及其對細胞凋亡的促進作用，但NBR2/DUSP4/ERK通路的具體分子機制尚需進一步闡明，NBR2可能作為肝癌治療的潛在靶點。