邵穎穎，李 雙，何淑芬，李燦濤，丁少波，何瑞榮

(1.南方醫(yī)科大學附屬東莞醫(yī)院 藥學部，廣東 東莞523059；2.中南大學湘雅醫(yī)院 臨床藥理研究所，湖南 長沙410008)

惡性腦膠質(zhì)瘤是一種致死程度較高的惡性腦腫瘤，占成人原發(fā)性腦部腫瘤的80%[1]?，F(xiàn)有的治療手段主要以手術聯(lián)合放化療為主，雖然近年來此疾病的治療手段有了明顯提升，但是患者的預后仍不理想，中位生存時間只有14個月，五年內(nèi)的存活率小于5%[2-3]。因此，尋找到預后生物標志物可以為此疾病的預后治療提供新的思路。長鏈非編碼RNA(Lnc RNA)是一種長度大于200nt的RNA分子，在細胞生長分化、細胞周期調(diào)控、細胞凋亡、遷移侵襲、免疫反應等多種生命活動中均發(fā)揮重要作用[4]。其中，小核仁RNA宿主基因12(SNHG12)在多種癌癥中均有異常表達[5-10]，且在腦膠質(zhì)瘤中已有報道顯示其與此疾病病理分級、不良預后有關[11]，本研究結(jié)合公共生物信息數(shù)據(jù)庫中以及國內(nèi)醫(yī)院收集到的病例樣本信息，通過探討LncRNA SNHG12在腦膠質(zhì)瘤中的表達水平，分析其是否可作為腦膠質(zhì)瘤預后良好指標。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)庫樣本數(shù)據(jù)收集根據(jù)研究目的與研究內(nèi)容確定研究樣本的篩選標準為樣本數(shù)較大，至少大于50例且有正常對照組的數(shù)據(jù)集，據(jù)此標準從GEO數(shù)據(jù)庫下載GSE4290數(shù)據(jù)集，對其中23例正常腦組織樣本(癲癇患者腦組織)和153例惡性腦膠質(zhì)瘤樣本中LncRNA SNHG12表達進行相關數(shù)據(jù)分析，同時，對從TCGA數(shù)據(jù)庫中下載的614例惡性腦膠質(zhì)瘤患者的LncRNA SNHG12表達進行分析。并且，從GEO數(shù)據(jù)庫下載GSE4271數(shù)據(jù)集以及TCGA數(shù)據(jù)庫中下載惡性腦膠質(zhì)瘤患者的臨床病理資料進行整理，分析LncRNA SNHG12表達對惡性腦膠質(zhì)瘤患者預后的影響。

1.2 臨床資料選取2007 年至 2013 年在湖南省中南大學附屬湘雅醫(yī)院的91例Ⅰ-Ⅳ級惡性腦膠質(zhì)瘤患者和12例腦外傷患者或癲癇患者。本研究樣本采集獲得中南大學湖南省重點實驗室臨床藥理研究所獨立倫理委員會的倫理批件(CTXY-1300041-3)，患者或家屬知情同意并簽署知情同意書。

1.3 納入與排除標準

1.3.1納入標準 (1)2007年至2013年在湖南省中南大學附屬湘雅醫(yī)院新診治為多形性膠質(zhì)母細胞瘤，并經(jīng)該院神經(jīng)疾病病理科根據(jù)2007年版的膠質(zhì)瘤分級指南確診；(2)行根治性手術，術前未行任何放射性治療、化學藥物治療以及手術治療；(3)隨訪資料以及病例信息均完整；(4)患者知情并自愿同意參加本研究，簽署知情同意書。

1.3.2排除標準 (1)復發(fā)性膠質(zhì)瘤患者；(2)初次手術后行放射性治療、化學藥物治療以及手術治療的膠質(zhì)瘤患者；(3)死于除了腫瘤進展病因之外原因的膠質(zhì)瘤患者；(4)病例信息或隨訪資料不完整。

1.4 隨訪采用門診或者電話的方式進行隨訪，隨訪時間為患者確診后的1-60個月，如果患者死亡隨訪時間結(jié)束。

1.5 主要試劑與儀器Trizol(美國Invitrogen公司，批號：15596018)；氯仿(批號：67-66-3)，異丙醇(批號：67-63-0)，乙醇(批號：64-17-5)均購自國藥集團化學試劑有限公司；RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒 PrimeScriptTMRT Master Mix(TaKaRa，批號：RR037A)；SYBR Green qPCR SuperMix-UDG(美國Invitrogen公司，批號：C11744-100)；引物由上海博尚生物科技有限公司合成。核酸濃度測定儀Nanodrop 2000(美國Thermoscientific公司)；普通PCR擴增儀AG6321(德國Eppendorf公司)；實時熒光定量 PCR 儀(Roche LC480公司，瑞士)；低溫高速離心機(Eppendorf公司，德國)。

1.6 方法

1.6.1RNA的提取 取腦膠質(zhì)瘤組織和正常腦組織解凍后，超聲勻漿，加入1 ml Trizol試劑，充分混勻后室溫靜置10 min；加入200 μl氯仿上下顛倒10次并在振蕩器上振蕩15 s，靜置5 min待充分乳化或呈乳白色后在4℃，12 000 g離心15 min；小心吸取收集上層無色水相層于新的1.5 ml EP管中并加入500 μl異丙醇，上下顛倒10次充分混勻室溫靜置10 min后4℃，12 000 g離心15 min；輕輕倒去上清加入1 ml無水乙醇慢慢加至EP管中(注意勿觸及沉淀)，輕輕上下顛倒10次后4℃，12 000 g離心5 min，重復操作一次后棄去上清，置于室溫干燥15 min后加入合適量(約20 μl)DEPC水溶解RNA，待溶解完全后保存在-80℃超低溫冰箱中備用。

表1 引物序列

1.7 統(tǒng)計學方法采用SPSS 18.0軟件(IBM,SPSS,Chicago,IL)進行一般統(tǒng)計分析。所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示。采用Student’st檢驗比較腦膠質(zhì)瘤組織與正常腦組織樣本間LncRNA SNHG12的表達水平。LncRNA SNHG12表達水平與臨床病理特征的關系采用皮爾遜卡方檢驗或費舍爾精確檢驗。采用Kaplan-Meier法和log-rank檢驗法來比較計算總生存率。臨床病理特征變量和LncRNA SNHG12表達水平對總生存率的影響通過單變量和多變量分析進行評估。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 LncRNA SNHG12在腦膠質(zhì)瘤組織以及正常腦組織中的表達水平比較對從GSE4290和TCGA數(shù)據(jù)庫中下載的樣本的表達數(shù)據(jù)進行分析，結(jié)果顯示LncRNA SNHG12在腦膠質(zhì)瘤中的表達水平明顯高于正常腦組織，且隨著腦膠質(zhì)瘤惡性程度的升高而升高，見圖1。采用qRT-PCR法對從湖南省湘雅醫(yī)院收集到的91例Ⅰ-Ⅳ 級惡性腦膠質(zhì)瘤組織和12例正常腦組織中LncRNA SNHG12的表達水平進行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與正常腦組織相比，腦膠質(zhì)瘤組織中LncRNA SNHG12呈現(xiàn)高表達水平，且與數(shù)據(jù)庫中的樣本分析結(jié)果一致，也隨著膠質(zhì)瘤病理等級的升高而升高，見圖2。

圖1 LncRNA SNHG12在GSE4290和TCGA數(shù)據(jù)庫中的表達差異

圖2 LncRNA SNHG12在膠質(zhì)瘤中高表達與膠質(zhì)瘤病理分級相關

2.2 LncRNA SNHG12表達與腦膠質(zhì)瘤患者臨床病理特征的關系在對湘雅醫(yī)院收集的惡性腦膠質(zhì)瘤患者的臨床病例資料進行進一步分析，以腦膠質(zhì)瘤患者LncRNA SNHG12表達水平均值為分界線，高于平均值為高表達，低于平均值為低表達。腦膠質(zhì)瘤組織中LncRNA SNHG12表達情況與患者年齡、性別、病灶位置無關(P值分別是0.437,0.580,0.203)，與患者病理分級有關(P<0.001)，見表2。

2.3 影響腦膠質(zhì)瘤患者預后因素的Cox回歸分析為評估LncRNA SNHG12表達對膠質(zhì)瘤患者的預后價值，進一步對湘雅醫(yī)院收集的惡性腦膠質(zhì)瘤患者的臨床病例資料進行Cox模型多因素分析結(jié)果顯示LncRNA SNHG12過表達(HR=0.161,95% CI=0.083-0.312,P<0.001)，腫瘤分級(HR=0.381,95% CI:0.220-0.659,P=0.001)和病灶位置(枕骨vs.顳部)(HR=0.211,95% CI=0.048-0.928,P=0.039) 是影響腦膠質(zhì)瘤預后的危險因素。Cox比例風險模型多因素分析結(jié)果顯示，LncRNA SNHG12的表達水平(HR=0.173,95% CI=0.084-0.358,P<0.001)和腫瘤分級(HR=0.458,95% CI=0.242-0.868,P=0.017) 是影響腦膠質(zhì)瘤患者生存的獨立預后指標 ，見表2。

表2 LncRNA SNHG12與腦膠質(zhì)瘤患者臨床病理特征的關系

2.4 LncRNA SNHG12表達水平與腦膠質(zhì)瘤患者預后的關系根據(jù)LncRNA SNHG12表達的中位數(shù)，分為高表達組和低表達組。結(jié)果顯示，在TCGA(圖3A)和GSE4271(圖3B)數(shù)據(jù)集中，LncRNA SNHG12的高表達均與膠質(zhì)瘤患者的預后生存不佳相關。為了進一步評估驗證這一結(jié)果，對湘雅醫(yī)院收集的91例病人樣本進行同樣的分析，結(jié)果顯示與前述數(shù)據(jù)庫中分析結(jié)果一致，腦膠質(zhì)瘤患者中LncRNA SNHG12高表達者的總存活率顯著低于低表達患者的總存活率(HR=1.984,95% CI=0.809-4.865,P<0.0001)(圖3C)。

圖3 LncRNA SNHG12在膠質(zhì)瘤中的表達水平與患者預后的關系

3 討論

近年來，發(fā)現(xiàn)和識別用于診斷、治療和預后的潛在生物標志物已成為改善癌癥患者生存狀態(tài)不佳的重要途徑。越來越多的證據(jù)表明，LncRNA參與了多種生物學過程包括細胞的生長、周期調(diào)控、凋亡以及癌癥在內(nèi)的多種疾病的發(fā)生發(fā)展過程[12]。隨著基因芯片技術的發(fā)展，越來越多的LncRNA被鑒定為癌癥患者的潛在生物標志物和治療靶點。腦膠質(zhì)瘤作為一種5年生存率極低的惡性腫瘤，迫切需要新的預后標志物和治療靶點[13]。

研究表明，LncRNA在腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用[14-16]。Ruan W.等闡明了LncRNA SNHG12通過誘導AMOT基因過表達促進骨肉瘤細胞的增殖和遷移[17]。Lan等發(fā)現(xiàn)LncSNHG12在肝癌細胞中可以通過競爭性結(jié)合miR-199 a/b-5p而間接影響NF-κB通路來調(diào)控肝癌細胞的凋亡和遷移[18]。在結(jié)直腸癌中，上調(diào)的LncRNA SNHG12可以通過抑制癌細胞凋亡從而促進結(jié)直腸癌的發(fā)生與發(fā)展[19]。近年來，在腦膠質(zhì)瘤的研究中雖已有報道顯示LncRNA SNHG12與此疾病病理分級、不良預后有關[20]，本研究通過對GEO數(shù)據(jù)庫、TCGA數(shù)據(jù)庫中以及從湘雅醫(yī)院收集到的患者病例資料信息以及qRT-PCR檢測LncRNA SNHG12表達水平進行分析，在不同人種不同國家地區(qū)來源的惡性腦膠質(zhì)瘤患者中LncRNA SNHG12的表達水平顯著高于正常腦組織，且在高級別病理分級的惡性腦膠質(zhì)瘤組織中的表達水平顯著高于低級別(P<0.05)；且LncRNA SNHG12高表達的惡性腦膠質(zhì)瘤患者的總存活率顯著低于低表達患者(HR=1.984,95% CI=0.809-4.865,P<0.0001)。在對湘雅醫(yī)院收集的惡性腦膠質(zhì)瘤患者的臨床病例資料進行進一步分析發(fā)現(xiàn)，在惡性腦膠質(zhì)瘤組織中LncRNA SNHG12的表達情況與患者年齡、性別以及病灶位置無關(P值分別是0.437,0.580,0.203)，與患者的腫瘤病理分級有關(Ⅰ-Ⅱ級 vs.Ⅲ-Ⅳ級,P<0.0001)；Cox模型多因素分析結(jié)果顯示，患者的腫瘤病理分級是影響惡性腦膠質(zhì)瘤患者預后的獨立危險因素(HR=0.173,95% CI=0.084-0.358,P<0.001)。因此，結(jié)合公共數(shù)據(jù)庫樣本以及醫(yī)院收集的臨床樣本信息，對國內(nèi)外患者進行統(tǒng)一分析后認為LncRNA SNHG12可能成為膠質(zhì)瘤患者潛在預后療效的生物標志物且不受人種地域等條件的限制，具有普適性。