魏 津，劉 博，馬 欣，王 甲，趙浩然，劉元杰，馮 妍，劉業(yè)兵，羅玉峰

(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081)

雞毒支原體(Mycoplasmagalliscepticum，MG)是致病性最強(qiáng)、引起損失最大的禽支原體，主要導(dǎo)致雞慢性呼吸道疾病(Chornic respiratory disease，CRD)[1]，以呼吸道啰音、咳嗽、流鼻涕為主要癥狀，部分表現(xiàn)為結(jié)膜炎、眶下竇炎。CRD雖然致死率不高，但嚴(yán)重影響家禽產(chǎn)蛋率、孵化率和飼料轉(zhuǎn)化率，給養(yǎng)殖企業(yè)造成重大經(jīng)濟(jì)損失[2]。臨床中由于長期使用或?yàn)E用抗菌藥物，導(dǎo)致雞毒支原體耐藥菌株不斷增加，給通過藥物防控該病帶來困難，甚至危及食品安全[3]，因此疫苗免疫是防控該病的重要手段，國內(nèi)市場上占主導(dǎo)地位的是雞毒支原體滅活疫苗[4]。效力檢驗(yàn)是評價疫苗質(zhì)量的最核心手段，《中國獸藥典(2020年版三部)》中收錄的該疫苗質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的效力檢驗(yàn)采用免疫攻毒法，攻毒方式為噴霧[5]。該方法需要制備500-600 mL的攻毒培養(yǎng)物，經(jīng)過菌種復(fù)蘇、擴(kuò)大培養(yǎng)、活菌預(yù)計(jì)數(shù)和攻毒菌液計(jì)數(shù)等步驟，且活菌計(jì)數(shù)周期長，攻毒感染劑量不易控制，對操作人員的經(jīng)驗(yàn)和技術(shù)要求高。同時，攻毒結(jié)果易受器械設(shè)備的影響較大，噴霧操作后消毒難度較大，存在生物安全隱患。為此，本研究通過將雞毒支原體檢驗(yàn)用攻毒菌種制備成方便使用和保存的凍干攻毒培養(yǎng)物，進(jìn)行氣囊注射攻毒試驗(yàn)和比較研究，旨在建立一種更加科學(xué)準(zhǔn)確、操作簡便的攻毒方法，也為相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)品的研究制備提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌種 雞毒支原體R株(CVCC 1651)由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所鑒定、保存和供應(yīng)。

1.2 材料與試劑 硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基(TG)、胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基(TSB)、12%明膠40%蔗糖保護(hù)劑均購自北京中海生物科技有限公司。圓形滅菌濾紙片，購自oxoid公司。雞毒支原體抗血清，實(shí)驗(yàn)室保存。CM液體和固體培養(yǎng)基由實(shí)驗(yàn)室自制。

1.3 實(shí)驗(yàn)動物 SPF雞購自北京勃林格殷格翰有限公司。

1.4 方法

1.4.1 凍干培養(yǎng)物制備

1.4.1.1 菌種擴(kuò)繁 將-20 ℃保存的雞毒支原體R株凍干菌種用1 mL CM液體培養(yǎng)基復(fù)溶后，按一定比例接種到CM液體培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng)24 h后，按一定比例接種培養(yǎng)基連續(xù)傳代，第3代菌液經(jīng)純粹檢驗(yàn)和活菌計(jì)數(shù)后待用。

1.4.1.2 分裝凍干 取生長良好，有輕度混濁，無沉淀的第3代菌液，按總體積10%比例加入保護(hù)劑，充分混勻后分裝至安瓿瓶內(nèi)凍干，凍干后置于-80 ℃冰箱保存。

1.4.2 凍干培養(yǎng)物的鑒定

1.4.2.1 常規(guī)檢驗(yàn) 對凍干培養(yǎng)物進(jìn)行性狀、純粹檢驗(yàn)、剩余水分、真空度、培養(yǎng)特性和活菌計(jì)數(shù)檢驗(yàn)。

1.4.2.2 特異性試驗(yàn) 代謝抑制試驗(yàn)：用CM液體培養(yǎng)基對雞毒支原體R株培養(yǎng)物進(jìn)行10倍系列稀釋到10-5，取1 mL稀釋好的菌液，加入含雞毒支原體抗血清0.05 mL(終濃度為5%)的CM培養(yǎng)基1 mL，同時設(shè)加陰性血清的小管為陽性對照，空白培養(yǎng)基作為陰性對照，置于培養(yǎng)箱37 ℃培養(yǎng)14 d，觀察培養(yǎng)基顏色變化。生長抑制試驗(yàn)：取直徑6 mm的圓形滅菌濾紙片，用未經(jīng)稀釋的雞毒支原體抗血清濕透后，放入無菌平皿內(nèi)，置于2～8 ℃干燥待用。將R 株培養(yǎng)物各0.3 mL分別接種到2個CM固體培養(yǎng)基，均勻鋪開，放置37 ℃培養(yǎng)箱使培養(yǎng)基表面稍干燥。用滅菌小鑷子夾取抗血清紙片貼在固體培養(yǎng)基表面靠中間位置，另一個固體培養(yǎng)基貼空白紙片作為對照，置于培養(yǎng)箱37 ℃培養(yǎng)10 d后在顯微鏡下觀察結(jié)果。

1.4.3 瓶間活菌數(shù)均一性試驗(yàn) 隨機(jī)抽取10瓶凍干培養(yǎng)物，使用顏色變化單位(簡稱CCU)分別對其進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，比較活菌數(shù)的差異。

1.4.4 氣囊注射攻毒方法的建立 將凍干培養(yǎng)物復(fù)溶后，根據(jù)凍干后活菌計(jì)數(shù)結(jié)果進(jìn)行10倍倍比稀釋為10-1、10-2，將原液和每個稀釋度進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)后分別取0.2 mL和0.4 mL氣囊注射10只75日齡SPF雞。制備雞毒支原體R株的培養(yǎng)物550 mL，進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)后在隔離器內(nèi)噴霧攻擊10只75日齡SPF雞。另取10只雞，5只氣囊注射0.4 mL培養(yǎng)基作為氣囊注射對照組，5只用培養(yǎng)基進(jìn)行噴霧作為噴霧對照組。7 d后記錄活菌計(jì)數(shù)結(jié)果，確定實(shí)際攻毒劑量。14 d后將所有組別的雞剖檢，記錄氣囊病變分?jǐn)?shù)結(jié)果，氣囊病變記分標(biāo)準(zhǔn)參照《中國獸藥典(2020年版三部)》“雞毒滅活疫苗質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)附注”[5]。將氣囊注射與噴霧攻毒的結(jié)果進(jìn)行單因素方差分析。

1.4.5 氣囊注射攻毒方法的評價 用噴霧和1.2.4項(xiàng)確定的氣囊注射兩種攻毒方法同時對5家企業(yè)5個批次的疫苗進(jìn)行兩次效力檢驗(yàn)。每批疫苗取1瓶搖勻后免疫56日齡SPF雞8只，1 mL/只。免疫30天后攻毒，比較兩種方法的對照組氣囊病變分?jǐn)?shù)情況和平均氣囊保護(hù)率，記分標(biāo)準(zhǔn)及計(jì)算方法參照《中國獸藥典(三部)》“雞毒滅活疫苗質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)附注”[5]，評價利用氣囊注射攻毒方法對滅活疫苗效力檢驗(yàn)的可行性。

2 結(jié)果與分析

2.1 常規(guī)檢驗(yàn) 凍干的165支菌種中，5支無輝光，160/165呈現(xiàn)白色或紫色輝光，真空度良好。純粹檢驗(yàn)結(jié)果符合規(guī)定，水分測定結(jié)果為0.7%、1.4%、0.2%、0.7%，均不超過4.0%?；罹?jì)數(shù)結(jié)果為109CCU/mL，培養(yǎng)菌落呈典型的“油煎蛋”狀外觀，符合培養(yǎng)特性的規(guī)定。

2.2 特異性試驗(yàn) 代謝抑制試驗(yàn)：加抗血清的培養(yǎng)基小管未變色，加陰性血清的培養(yǎng)基小管變黃，培養(yǎng)基對照管未變色。生長抑制試驗(yàn)：抗血清紙片周圍無菌落生長，出現(xiàn)大于2.0 mm的抑菌圈；空白紙片的平板有菌落生長，沒有抑菌圈，說明該菌種為雞毒支原體，符合規(guī)定。

2.3 瓶間活菌數(shù)均一性試驗(yàn) 10瓶凍干培養(yǎng)物活菌數(shù)均為109CCU，變異系數(shù)為0%。

2.4 氣囊注射攻毒方法的建立 噴霧攻毒用培養(yǎng)物活菌數(shù)為109CCU/mL，凍干培養(yǎng)物活菌數(shù)為109CCU/mL，稀釋后復(fù)數(shù)結(jié)果10-1、10-2兩個稀釋度對應(yīng)的活菌數(shù)為108CCU/mL和107CCU/mL。不同攻毒方法的氣囊病變分?jǐn)?shù)結(jié)果見表1：氣囊注射0.2×107CCU和0.4×107CCU的培養(yǎng)物，6/10和5/10分別出現(xiàn)2分以上的典型氣囊病變，不符合菌種毒力標(biāo)準(zhǔn)的發(fā)病要求[6]；噴霧組方差大于氣囊注射的6個實(shí)驗(yàn)組(方差反映一組數(shù)據(jù)的離散程度)，說明噴霧組分?jǐn)?shù)差異大，感染劑量不均一。將不同攻毒方法的病變分?jǐn)?shù)進(jìn)行單因素方差分析，結(jié)果見表2：在顯著水平α=0.05時，氣囊注射0.4×109CCU、0.2×108CCU和0.4×108CCU的F值均大于F臨界值，P值小于0.05，與噴霧結(jié)果差異顯著；氣囊注射0.2×109CCU的F值均小于F臨界值，P值大于0.05，與噴霧結(jié)果無顯著差異。

表1 不同攻毒方法的氣囊病變分?jǐn)?shù)結(jié)果Tab 1 Air sac leision scores of different challenge methods

表2 不同劑量氣囊注射與噴霧攻毒方法氣囊病變結(jié)果方差分析Tab 2 Variance analysis of aerosol challenge and air sac injection with different doses

2.5 氣囊注射攻毒方法的評價 2.4項(xiàng)結(jié)果表明，氣囊注射0.2 mL 109CCU/mL的凍干培養(yǎng)物與現(xiàn)行噴霧方法無顯著差異，選用該攻毒劑量進(jìn)行氣囊注射攻毒。兩次效力檢驗(yàn)攻毒對照組氣囊病變分?jǐn)?shù)結(jié)果見表3：兩次氣囊注射攻毒分?jǐn)?shù)無明顯差異，和噴霧方法相比，分?jǐn)?shù)也無明顯差異。

表3 不同攻毒方法兩次效力檢驗(yàn)的氣囊病變分?jǐn)?shù)Tab 3 Air sac leisions scores of different challenge methods in two potency tests

兩次效力檢驗(yàn)結(jié)果比較見表4。結(jié)果表明，5家企業(yè)5批產(chǎn)品采用兩種攻毒方法進(jìn)行效力檢驗(yàn)平均氣囊保護(hù)率無明顯差異，檢驗(yàn)結(jié)果符合率100%。

表4 不同攻毒方法兩次效力檢驗(yàn)的結(jié)果比較Tab 4 Comparative results of different challenge methods in two potency tests

3 結(jié)論與討論

目前國內(nèi)外雞毒支原體滅活疫苗效力檢驗(yàn)均采用噴霧攻毒法。在雞毒支原體的研究過程中，有多種方法用于雞的攻毒感染試驗(yàn)，包括鼻、眼、竇和氣管內(nèi)的接種[7]，氣囊注射[8]、氣霧攻毒[9]、肺內(nèi)注射[10]。據(jù)賴月輝等2018年報道[11]氣囊攻毒的病變比肺內(nèi)攻毒出現(xiàn)的病變更典型，效果更好，具有良好的重復(fù)性。采用氣囊注射具有易定位、易操作和接種量更精確的優(yōu)點(diǎn)，直接感染氣囊，避免了噴霧攻毒試驗(yàn)雞由于吸入量可能不同導(dǎo)致感染劑量不均一，發(fā)病情況差異大的問題。同時，采用注射攻毒，所需培養(yǎng)物量少，易于制備，并利于隔離器消毒處理，大大降低了生物安全隱患。

采用新鮮培養(yǎng)物攻毒，需要每次預(yù)培養(yǎng)摸索攻毒菌株在該批培養(yǎng)基的生長曲線，并據(jù)此重新培養(yǎng)進(jìn)行攻毒，兩次培養(yǎng)條件和結(jié)果很難達(dá)到完全一致，有可能會對效力評價結(jié)果產(chǎn)生一定影響。本研究制備了凍干攻毒用培養(yǎng)物，保存于-80 ℃，通過攻毒試驗(yàn)確定了攻毒劑量，應(yīng)用于兩次雞毒支原體疫苗效力檢驗(yàn)中，結(jié)果表明，在此段時間內(nèi)活菌數(shù)和毒力均保持穩(wěn)定，且效力檢驗(yàn)結(jié)果與噴霧方法無顯著差異。將其應(yīng)用于效力檢驗(yàn)將減少復(fù)蘇強(qiáng)毒菌種和再培養(yǎng)等步驟，降低工作量。每次采用同一批攻毒用凍干培養(yǎng)物，提高了檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可重復(fù)性，提升了檢驗(yàn)效率，為研制攻毒用標(biāo)準(zhǔn)品提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

未來可通過不同保存條件、保存時長內(nèi)活菌數(shù)和毒力穩(wěn)定性的監(jiān)測，確定本研究中凍干培養(yǎng)物的保存要求和時限。同時可考慮篩選一種新的凍干保護(hù)劑，提高其在不同溫度環(huán)境存放的穩(wěn)定性并延長保存期，實(shí)現(xiàn)對外供應(yīng)，為提高雞毒支原體疫苗效力評價水平奠定基礎(chǔ)。