曲雪嘉，李涪鋅，王春花

(牡丹江師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江牡丹江 157000)

仔豬腹瀉為規(guī)模化養(yǎng)殖場斷奶仔豬最常見疾病。產(chǎn)腸毒素大腸桿菌是早期斷奶仔豬腹瀉高發(fā)的重要誘因之一，由于藥物的不規(guī)范使用，導(dǎo)致臨床上的大腸桿菌普遍耐藥。中藥具有低毒低耐藥等特點，馬針顆粒由馬齒莧、三顆針兩味中藥組成，為我國三類新獸藥，臨床研究發(fā)現(xiàn)馬針顆粒對仔豬黃、白痢治愈率高達(dá)100%[1-3]，但其藥效成分與作用機(jī)制目前并不十分清楚。

中藥成分多而復(fù)雜，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)為中藥研究的難點與瓶頸問題提供了新的思路與方法[4-8]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是以系統(tǒng)生物學(xué)和多向藥理學(xué)理論為基礎(chǔ)，采用生物分子網(wǎng)絡(luò)分析的方法，為中醫(yī)藥治療疾病機(jī)理的研究與闡述提供了新途徑。它突破傳統(tǒng)的“一個基因一個藥物一個疾病”理念，從系統(tǒng)層面揭示中藥對機(jī)體調(diào)控網(wǎng)絡(luò)作用[9-10]。目前，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)在中獸藥與中藥功能性飼料添加劑領(lǐng)域的應(yīng)用還處于初始階段，值得深入探索，具有可觀的應(yīng)用前景。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)，通過對馬針顆粒成分、靶點、生物功能、調(diào)控通路與靶點器官定位分析，探討馬針顆粒防控仔豬腹瀉的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)與作用機(jī)制，為馬針顆粒治療仔豬腹瀉機(jī)制的揭示及拓展應(yīng)用范圍奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 馬針顆?；钚曰衔飿?gòu)建靶點網(wǎng)絡(luò) 利用TCMSP(http:∥tcmsp-e.com)、Drugbank(https:∥www.drug bank.ca)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索與收集馬齒莧與三顆針的化合物與靶點，依據(jù)Degree≥10靶點選取，應(yīng)用Cytoscape3.7.1軟件構(gòu)建化合物-靶點網(wǎng)絡(luò)，確定馬針顆粒的關(guān)鍵化合物與靶點。

1.2 馬針顆粒靶點蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 馬針顆粒靶點利用STRING數(shù)據(jù)庫(https:∥string-db.org)，物種選擇“sus scrofa”，打分值設(shè)置>0.9，進(jìn)行分析馬針顆粒與仔豬腹瀉靶點間關(guān)系，刪除單個或無關(guān)的靶點后，應(yīng)用Cytoscape3.7.1軟件構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，確定馬針顆粒治療豬腹瀉的重要靶點。

1.3 馬針顆粒靶點器官定位 通過BIOGPS數(shù)據(jù)庫(http:∥biogps.org/#goto=welcome)對馬針顆粒重要靶點(Degree值≥10)進(jìn)行定位分析，保留基因表達(dá)量排名前3位的組織與器官，應(yīng)用Cytoscape3.7.1構(gòu)建馬針顆粒核心靶點-定位網(wǎng)絡(luò)。

1.4 馬針顆粒靶點GO富集及靶點KEGG通路富集分析 馬針顆粒靶點上傳到DAVID數(shù)據(jù)庫(http：∥david.ncifcrf.gov)，限定物種為“sus scrofa”，設(shè)定閾值P<0.05，進(jìn)行GO(Gene ontology)生物學(xué)過程和KEGG(Kyoto encyclopedia of genes and genomes)代謝通路富集分析，構(gòu)建靶點-信號通路網(wǎng)絡(luò)，分析馬針顆粒治療豬腹瀉的調(diào)控通路。

2 結(jié)果與分析

2.1 馬針顆?；衔?靶點相互作用網(wǎng)絡(luò) 見圖1。通過TCMSP、Drugbank數(shù)據(jù)庫收集、并去除無靶點化合物后收集到的18個馬針顆粒的化合物和423個作用靶點。馬針顆?；衔?靶點網(wǎng)絡(luò)共包含441個節(jié)點，214條邊，平均每個化合物有23.5個靶點，根據(jù)化合物Degree值排名前5的成分主要為異甜菜甙(isobetanin_qt)、異甜菜素(isobetanidin)、花生四烯酸(arachidonic acid)、β-胡蘿卜素(beta-carotene)、槲皮素(quercetin)，Degree值≥30的化合物為馬針顆粒關(guān)鍵成分(表1)。Degree值≥10的靶點為馬齒莧-三顆針關(guān)鍵靶點(表2)，根據(jù)靶點Degree值排名前5個關(guān)鍵靶點分別為溶解酵素(lysozyme)、CA2蛋白酶(Carbonic anhydrase 2)、原癌基因絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶pim-1(Proto-oncogene serine/threonine-protein kinase Pim-1)、載脂蛋白A-Ⅱ(Apolipoprotein A-II)、視紫紅質(zhì)(rhodopsin)。

箭形節(jié)點代表靶點，圓形節(jié)點代表馬針顆粒組方中藥化合物，箭形節(jié)點大小與Degree成正比，圓形節(jié)點顏色深淺(由紅到黃)與Degree值成正比圖1 化合物-靶點網(wǎng)絡(luò)圖Fig 1 Compound target network diagram

表1 馬針顆粒度值≥30的活性化合物基本信息Tab 1 Basic information of active compounds with particle size value ≥30 of Ma Zhen Granule

2.2 馬針顆粒-豬腹瀉靶點蛋白PPI網(wǎng)絡(luò) 如圖2所示，PPI網(wǎng)絡(luò)馬針顆粒作用靶點與19個腹瀉靶點直接相關(guān)，其中包括TP53(腫瘤蛋白53)、MAPK3(絲裂原活化蛋白激酶3)、MAPK1(絲裂原活化蛋白激酶1)、STAT1(信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活子1)與NFKB1(核因子κB亞基1)5個豬腹瀉與馬針顆粒共有靶點。根據(jù)Degree值大小排名TP53、TNF(腫瘤壞死因子)、JUN(jun原癌基因)、CASP3(半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3)、MAPK14(絲裂原活化蛋白激酶14)、MAPK3、MAPK1、PPARG(過氧化物酶體增生激活受體γ)、MYC(myc癌基因)等，與豬腹瀉靶點相互關(guān)系最緊密，為馬針顆粒治療豬腹瀉的重要靶點(Degree>65)。

表2 馬針顆粒度值≥10的靶點基本信息Tab 2 Basic information of the target of Ma Zhen Granule equine needle particle size value ≥10

圖左側(cè)為仔豬腹瀉靶點，右側(cè)為馬針顆?；衔锇悬c，中間為仔豬腹瀉與化合物的共同靶點，節(jié)點大小、顏色深淺(由紅到黃)與Degree值成正比圖2 馬針顆粒-關(guān)鍵靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)Fig 2 Ma Zhen Granule -key target-disease network

2.3 靶點定位分析與歸經(jīng)理論的相關(guān)性分析 如圖3所示，馬針顆粒重要靶點主要分布在空腸(Jejunum，Degree=6)，巨噬細(xì)胞(Macrophage，Degree=6)，骨髓(Marrow，Degree=5)，回腸(lleum，Degree值=4)，胸腺(Thymus，Degree=3)，十二指腸(Duodenum，Degree=2)，說明馬針顆粒在腸道、免疫功能中具有重要作用，這也馬針顆粒具有較好的仔豬腹瀉治療作用的主要原因。另外，馬針顆粒重要靶點在卵巢(Ovary，Degree=5)，胎盤(Placenta，Degree=3)，子宮(Uterus，Degree=2)的分布也較多，推測馬針顆粒可能在妊娠母豬應(yīng)用中具有一定風(fēng)險，具體具有何種風(fēng)險能否應(yīng)用于妊娠母豬值得進(jìn)一步研究。

圖中橘色節(jié)點代表馬針顆粒重要靶點，紫色、綠色、湖藍(lán)色、深藍(lán)色、黃色節(jié)點代表各類組織器官圖3 馬針顆粒靶點-歸經(jīng)網(wǎng)絡(luò)Fig 3 Target meridian network of Ma Zhen Granule

2.4 靶點通路分析 將馬針顆粒調(diào)控豬腹瀉的核心靶點蛋白輸入DAVID數(shù)據(jù)庫，GO功能富集分析得到GO條目114個(P<0.05)，其中生物過程(BP)條目75個，占總比例的66%，分子功能(CC)條目16個，占14%，細(xì)胞組成(MF)相關(guān)條目23個，占20%，主要條目如圖4所示。

圖4 馬針顆粒靶點GO富集Fig 4 GO enrichment at Ma Zhen Granule targets

KEGG通路注釋分析，發(fā)現(xiàn)信號通路282條(P<0.05)，按P值排在前15的信號通路(圖5)包括Toll樣受體信號通路(Toll-like receptor signaling pathway)、TNF信號通路(tumor necrosis factor signaling pathway)兩個重要炎性反應(yīng)信號調(diào)控通路，其中靶點MAPK3、MAPK10、MAPK8等在通路中出現(xiàn)的次數(shù)較多。另外，MAPK3為馬針顆粒與豬腹瀉共有靶點，在馬針顆粒治療仔豬腹瀉靶點與機(jī)制研究中值得重點關(guān)注。

圖5 馬針顆粒靶點KEGG通路Fig 5 KEGG pathway of Ma Zhen Granule target

3 討 論

近些年，防控仔豬腹瀉的替抗產(chǎn)品研究主要集中在益生菌、有機(jī)酸、酶制劑、植物提取物、發(fā)酵飼料、中短鏈脂肪酸以及低蛋白質(zhì)飼糧[9]。這些產(chǎn)品多以改善斷奶仔豬腸道健康為目的，具有提高生產(chǎn)性能、降低腹瀉率的作用，文獻(xiàn)顯示植物提取物降低腹瀉率優(yōu)于其他替抗物質(zhì)，更接近抗生素的防控腹瀉效果[10]，這可能與一些植物提取物具有抗菌、抗病毒、抗氧化、增強(qiáng)免疫等多重功效有關(guān)[10-12]。中藥具有多成分多靶點，防控豬腹瀉同時還可改善脾胃功能、提高仔豬生長性能，是其他類型替抗產(chǎn)品無法替代的，在防控仔豬腹瀉特別是ETEC導(dǎo)致的斷奶仔豬腹瀉中應(yīng)更具有前景性[13]。馬針顆粒是由馬齒莧和三顆針組成的中藥制劑，為我國三類新獸藥，在防治仔豬黃、白痢中具有顯著療效[1-3]，本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)，通過虛擬篩選確定馬針顆粒的核心化合物與作用靶點，進(jìn)一步探討了馬針顆粒核心化合物對仔豬腹瀉的調(diào)控機(jī)制。

馬針顆粒核心化合物異甜菜甙、異甜菜素、花生四烯酸、β-胡蘿卜素、槲皮素具有抗炎、抗菌、抗病毒與調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)作用，是馬針顆粒防治豬腹瀉性疾病的重要物質(zhì)基礎(chǔ)。研究顯示，槲皮素具有廣泛的抗病毒抗菌作用，對流行性豬腹瀉病毒PEDV 3CLpro有抑制作用[14]，可提高腸道細(xì)胞Occludin和ZO-1 mRNA水平。飼料中添加槲皮素可改善肥育豬的豬肉品質(zhì)以及提高抗病力肥育豬，還可促進(jìn)畜禽飼料利用率，提高仔豬生長性能[14]?；ㄉ南┧嵩诿庖呒?xì)胞的磷脂中含量較高，代謝物PGE、PGI2和LTs為治療炎癥感染的重要因子，其代謝物中前列腺素D2和脂氧素B2濃度增高可進(jìn)一步抑制炎癥反應(yīng)[15-16]。β-胡蘿卜素能抑制炎癥因子IL-18、IL-6、TNF-α等信號傳導(dǎo)，在炎癥修復(fù)中發(fā)揮重要作用[17]。

通過化合物-靶點分析發(fā)現(xiàn)馬針顆粒關(guān)鍵靶點與炎癥等疾病相關(guān)，其重要靶點TP53、TNF、JUN、CASP3、MAPK14、MAPK3、MAPK1等與脂多糖引起的炎性反應(yīng)過程、蛋白轉(zhuǎn)運、腺苷酸環(huán)化酶調(diào)控、細(xì)胞凋亡有關(guān)。TP53可通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、凋亡、DNA修復(fù)和代謝變化相關(guān)基因的表達(dá)參與應(yīng)激誘導(dǎo)反應(yīng)[18]。TP53與結(jié)腸粘膜炎癥密切相關(guān)，TP53降低可導(dǎo)致凋亡前基因Casp3活性的增加[19]。CASP3是Caspase依賴途徑中凋亡的執(zhí)行者[20]，與仔豬營養(yǎng)吸收與腸道損傷的發(fā)生有關(guān)。ETEC感染會導(dǎo)致仔豬空腸中CASP3激活與細(xì)胞凋亡顯著增加[21]，CASP3激活可抑制脂肪酸在腸內(nèi)的吸收，其機(jī)制可能與CD36和FATP4基因有關(guān)[22]。TNF在機(jī)體自穩(wěn)、防御反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，研究顯示粘膜炎癥水平與組織TNF水平呈正相關(guān)，TNF針對性治療手段常被用于治療炎癥性腸病[23]。MAPK1(ERK2)、MAPK3(ERK1)、MAPK14(p38MAPK)為MAPK信號通路重要成員，在胃腸道的發(fā)生發(fā)展、免疫性炎癥異常激活中起著至關(guān)重要的作用[24-26]。研究顯示，ERK1/ERK2和p38MAPK與IBD引起的腸粘膜損傷密切相關(guān)，ERK1/ERK2表達(dá)增加可以減少腸道炎癥和上皮細(xì)胞凋亡[27]。KEGG分析發(fā)現(xiàn)這些核心靶點主要富集于腫瘤壞死因子信號途徑(TNF signaling pathway)、Toll樣受體信號途徑(Toll like receptor signaling pathway)等炎性反應(yīng)與免疫調(diào)控相關(guān)信號通路，說明馬針顆粒干預(yù)豬腹瀉過程可能與介導(dǎo)TNF、TLR信號通路調(diào)控炎性反應(yīng)與免疫過程有關(guān)，作用CASP3靶點結(jié)果為馬針顆粒應(yīng)用與研究提高豬生長性能提供基礎(chǔ)與方向，值得進(jìn)一步研究確認(rèn)。通過靶點定位得到馬針顆粒靶點主要分布在腸道與免疫系統(tǒng)中，這可能是馬針顆粒在防治仔豬腹瀉具有顯著療效的重要原因。

綜上所述，馬針顆粒防治仔豬腹瀉作用與異甜菜甙、異甜菜素、花生四烯酸、β-胡蘿卜素、槲皮素等化合物作用于TP53、TNF、JUN、CASP3、MAPK14、MAPK3、MAPK1等核心靶點，調(diào)控TNF、TLR等炎性反應(yīng)通路抑制或減輕炎癥有關(guān)。