曾令強, 羅睿童, 陳 瓊, 郝格非, 朱曉磊, 楊光富

(華中師范大學 化學學院 農(nóng)藥與化學生物學教育部重點實驗室，武漢 430079)

琥珀酸脫氫酶 (succinate dehydrogenase, SDH)又稱為琥珀酸泛醌氧化還原酶(succinate ubiquinone oxidoreductase, SQR)，其作為一類重要的殺菌劑靶標在農(nóng)藥研究領域扮演著十分重要的角色[1-5]。琥珀酸脫氫酶抑制劑(succinate dehydrogenase inhibitor,SDHI)具有高效、廣譜和環(huán)境友好等特點[6]。自20 世紀60 年代第1 個商品化SDHI 萎銹靈 (carboxin)上市以來，歷經(jīng)60 余年的發(fā)展，目前已有24 個SDHI 商品化[6-7]。然而，根據(jù)殺菌劑抗性行動委員會(Fungicides Resistance Action Committee, FRAC)的統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，已有20 多種植物病原菌對SDHI 類殺菌劑表現(xiàn)出抗性，其中16 種為田間報道的抗性[8]，而且植物病原菌對現(xiàn)有商品化SDHI 的抗性水平已達到中等甚至高水平抗性[9-20]。另外，市場上主流的SDHI 多為吡唑聯(lián)苯類，該類化合物由于聯(lián)苯片段的存在使得其合成成本相對較高[21]，且部分SDHI 類殺菌劑對防治植物病害的活性不高，如異丙噻菌胺(isofetamid)雖然對子囊菌等引起的病害具有優(yōu)異的防治效果，但是對半知菌以及卵菌活性不佳[22]。因此，發(fā)現(xiàn)合成成本較低且殺菌譜廣的新型SDHI 顯得尤為重要。

華中師范大學楊光富課題組開發(fā)出了“藥效團連接碎片虛擬篩選”(pharmacophore-linked fragment virtual screening, PFVS)方法[23]，隨后基于此方法成功創(chuàng)制出了新型SDHI 殺菌劑—氟苯醚酰胺 (flubeneteram)，試驗代號：Y13149 (本文中化合物11，圖式1)，中國專利申請?zhí)?01310502473.7，國際PCT/CN2013/089220。生物活性測試結(jié)果表明，氟苯醚酰胺對水稻紋枯病和黃瓜白粉病具有卓越的防治效果，同時對小麥白粉病等病菌具有良好的抑制作用。目前該化合物已經(jīng)轉(zhuǎn)讓給企業(yè)進行產(chǎn)業(yè)化開發(fā)?；诖耍疚膶腜FVS 的角度出發(fā)，對氟苯醚酰胺的創(chuàng)制過程予以介紹，重點分析其創(chuàng)制過程中的研究思路，以期給農(nóng)藥研究人員創(chuàng)制新農(nóng)藥以啟發(fā)。

圖式1 氟苯醚酰胺 (試驗代號：Y13149，本文中化合物11) 的化學結(jié)構(gòu)式Scheme 1 The chemical structure of flubeneteram(also named Y13149, compound 11)

1 藥效團連接碎片虛擬篩選

PFVS (圖1) 是一種基于分子碎片的藥物分子設計方法，該方法克服了傳統(tǒng)藥物設計方法中必須依賴生物物理技術(shù)進行碎片篩選及需要大量高純蛋白的不足，成功實現(xiàn)了分子碎片的高通量虛擬篩選，使得基于碎片的藥物設計方法成為一種更通用的分子設計方法。基于抑制劑與靶標之間的作用機制，PFVS 方法的核心思想是在保留抑制劑關鍵藥效團的前提下，對其他部分進行片段合理替換從而生成一個全新的虛擬分子，再結(jié)合Amber 分子動力學進行能量優(yōu)化，并對最后構(gòu)象進行結(jié)合自由能計算 (MM/PBSA)，挑選打分較高的化合物進行后續(xù)研究。該方法的優(yōu)點是可以合理地、高效率地找到高活性化合物?；谠摲椒ǎ菊n題組已經(jīng)成功設計并合成了第1 個活性達到皮摩爾級別的細胞色素bc1復合物Qo位點抑制劑，該部分內(nèi)容已有文獻做了詳細闡述[23]。隨后進一步把PFVS 方法應用到SDH 靶標中進行新型抑制劑的設計，最終獲得高活性候選殺菌劑氟苯醚酰胺 (詳見下文分析)，同時也進一步說明了PFVS 方法的普適性較高。

圖1 藥效團連接碎片虛擬篩選工作流程[23]Fig. 1 Work flow of PFVS[23]

2 氟苯醚酰胺的創(chuàng)制經(jīng)緯

2.1 現(xiàn)有商品化SDHI 作用機制研究

藥物分子的作用機制是新型藥物分子設計的基石。為此，我們選擇10 個商品化SDHI (圖式2)，測試了它們對豬心來源的SDH 酶水平的生物活性，與此同時，采用分子對接和結(jié)合自由能評價方法研究了其結(jié)合模式。結(jié)果如表1 所示，ΔGexp(△G= -RTlnKi) 與ΔGcal之間的相關性r2達到0.94，表明結(jié)合模式的正確性。

圖式2 10 個商品化SDHI 的化學結(jié)構(gòu)式(紅色表示酸部分，藍色表示胺部分)[24]Scheme 2 The chemical structures of ten commercial SDHI (The acid and the amine parts were colored by red and blue, respectively)[24]

表1 10 個商品化SDHI 與SDH 的結(jié)合自由能 (kcal/mol)c[24]Table 1 The binding free energies of ten SDHI with the Q-site of SDH (kcal/mol)c[24]

如圖2 所示，該類化合物中酸部分結(jié)構(gòu)嵌入活性腔中，與C_R46 形成陽離子-π 相互作用，酰胺鍵的羰基氧原子與B_W173 和D_Y91 形成氫鍵，其胺部分伸向活性腔口處，與C_W35、C_I43、C_I30 形成疏水相互作用。

圖2 10 個商品化SDHI 與SDH 作用方式疊合顯示圖(sub_amine 為胺部分，sub_acid 為酸部分，HEM 為血紅素)[24]Fig. 2 The overlay of the binding model of ten SDHI with SDH (sub_amine means the amine part, sub_acid means the acid part and HEM stands for heme)[24]

2.2 二苯醚片段的發(fā)現(xiàn)

基于上述作用機制，固定吡噻菌胺結(jié)構(gòu)中吡唑酰胺部分，采用PFVS 方法對其胺部分進行碎片篩選，獲得了8 個打分靠前的hit 苗頭化合物 (圖式3)。生物活性測試結(jié)果顯示，hit 4 在10 μmol/L 濃度下對豬心SCR (SDH 和復合物III 的混合物) 的IC50值為19.79 μmol/L，顯示出進一步優(yōu)化的價值。

圖式3 基于PFVS 篩選得到的8 個hit 化合物 (藍色表示PFVS 確定的部分)[25]Scheme 3 Chemical structures of eight hit compounds identified by PFVS(The fragments determined by PFVS are shown in blue)[25]

2.3 二苯醚片段上取代基的優(yōu)化

分子模擬結(jié)果顯示，化合物hit 4 與靶標的作用方式與商品化SDHI 類似 (圖3A)，其羰基的氧原子與D_Y91、B_W173 形成氫鍵相互作用。值得關注的是，相對于已有商品化SDHI 的胺部分化學結(jié)構(gòu) (圖式2)，hit 4 中二苯醚片段的柔性較大，末端苯環(huán)能夠與C_W35 形成π-π 相互作用。因此擬通過對hit 4 中末端苯環(huán)進行取代基衍生，以期進一步提高該類化合物的生物活性。

圖3 結(jié)合模式顯示圖Fig. 3 The binding modes

如圖4 所示，先對二苯醚末端苯環(huán)進行修飾獲得末端苯環(huán)的優(yōu)勢取代基，隨后固定末端苯環(huán)的優(yōu)勢取代基對吡唑環(huán)進行修飾最終獲得高活性化合物?；衔锏臉?gòu)效關系研究結(jié)果[26](表2) 表明：當化合物末端苯環(huán)2 號位上引入單取代基時，其對豬心SDH 的抑制率有著明顯的提高，如化合物2 (R2= 2-Cl)，其IC50值達到了1.98 μmol/L，比先導化合物hit 4 提高了近10 倍；而3 號位引入取代基則不利于SDH 抑制活性的提高，如化合物3 (R2= 3-Cl，IC50= 36.9 μmol/L)；4 號位的構(gòu)效關系比較復雜，如引入氟原子 (R2= 4-F，4) 或者強吸電子基如氰基 (R2= 4-CN，6) 時，其SDH抑制活性急劇下降，但是引入氯原子 (R2=4-Cl，5) 時，其IC50值達4.90 μmol/L。當末端苯環(huán)引入雙取代基時，2、4 位的修飾對活性的貢獻是最顯著的，如化合物7 (R2= 2,4-Cl2)，其對SDH 的IC50值為2.70 μmol/L；而化合物8 (R2= 2-Cl-4-CF3) 對SDH 的IC50值達0.28 μmol/L，是hit 4 的70 倍。

圖4 化合物設計思路Fig. 4 Compound design strategy

前期研究工作表明，將吡唑環(huán)上的三氟甲基替換為二氟甲基有利于化合物活性的提高[27]。因此，在保留前期所得的優(yōu)勢取代基 (R2= 2-Cl-4-CF3等) 的基礎上，進一步設計并合成了一系列二氟甲基取代的化合物，并對其進行了生物活性評價，結(jié)果 (表2) 和預期一致，即與相應的三氟甲基取代的化合物相比，二氟甲基取代的系列化合物的活性都有了明顯提高，大部分化合物對豬心來源的SDH 的抑制率要更優(yōu)于三氟甲基取代的化合物。隨后對其進行了活體殺菌活性評價，結(jié)果(表3) 表明：這一系列化合物對水稻紋枯病和黃瓜白粉病表現(xiàn)出了優(yōu)異的防治效果，其中化合物11 在12.5 mg/L 下對水稻紋枯病仍然保持了95%的防效，對黃瓜白粉病有67%的防效，優(yōu)于對照藥劑噻呋酰胺 (水稻紋枯病61%，黃瓜白粉病0%)，具有進一步開發(fā)的價值[26]。

表2 化合物對豬心SDH 的IC50 值[26]Table 2 IC50 value of compound against porcine SDH[26]

表3 化合物9～11 活體殺菌活性[26]Table 3 Fungicidal activities of compounds 9-11 in vivo[26]

3 田間藥效試驗和殺菌譜測試研究

為了進一步研究化合物11 對水稻紋枯病的防治效果，委托國家南方農(nóng)藥創(chuàng)制中心浙江基地分別在浙江紹興市和寧波市兩地對其進行水稻紋枯病的田間藥效試驗。結(jié)果如表4 所示：5%的化合物11 乳油對水稻紋枯病具有較好的防治效果[26,28]。以浙江寧波為例，按有效成分75.0 g/hm2處理，兩次施藥，第1 次與第2 次施藥間隔期為13 d。第2 次施藥后7 d 和21 d 防治效果分別達到了69.6%和81.2%，優(yōu)于對照藥劑24%的噻呋酰胺懸浮劑同劑量處理 (2 次施藥后7 d、21 d 防治效果分別為48.4%和75.4%)。同時，在水稻紋枯病初發(fā)期施藥2 次，化合物11 的防效持效期能夠維持21 d 以上，而對照藥劑的防效比5%的化合物11 乳油有所下降；浙江紹興的田間藥效試驗表明，按有效成分75.0 g/hm2處理，5%的化合物11 乳油的防效與對照藥劑相當。表明化合物11 具有良好的市場應用前景。

表4 化合物11 對水稻紋枯病的田間藥效試驗[26,28]Table 4 Control efficacy of compound 11 against R. solani in field trials [26,28]

隨后，對化合物 11 又進行了殺菌譜測試，如圖5 所示，化合物11 可以用于防治小麥上的眾多病害，如小麥白粉病、小麥條銹病、小麥葉銹病、小麥紋枯病、小麥赤霉病、小麥葉枯病等，同時還可以用于防治其他農(nóng)作物上病害，如油菜菌核病、大豆銹病、花生白絹病、甜瓜白粉病、玉米銹病等。

圖5 氟苯醚酰胺的作用譜Fig. 5 The antifungal spectrum of flubeneteram

與此同時，葉片傳導試驗表明，化合物11 還具有良好的向上和向下傳導性。需要特別提出的是，從其合成路線 (圖式4)可以看出，合成化合物11 的關鍵中間體為二氟甲基取代的吡唑酰氯和二苯醚，合成成本相對較低，有望在今后農(nóng)藥市場中大放異彩。

圖式4 化合物11 合成路線[26]Scheme 4 Synthetic route of compound 11[26]

4 化合物11 的作用機制研究

生物活性測試結(jié)果表明，化合物11 對水稻紋枯病和黃瓜白粉病的防治效果優(yōu)于對照藥劑噻呋酰胺 (表3 和表4)，為了合理解釋此現(xiàn)象，我們首先采用同源模建和膜動力學方法獲得水稻紋枯病菌 (致病菌為立枯絲核菌R. solani) SDH 的穩(wěn)定三維結(jié)構(gòu)，隨后結(jié)合分子對接技術(shù)和結(jié)合自由計算方法研究了化合物11 與不同物種來源的SDH 作用機制的差異性。分子模擬結(jié)果顯示，針對不同物種來源的SDH，結(jié)合模式的相同點為：化合物11的羰基氧原子與D_Y91 和B_W173 形成氫鍵，與C_R46 形成陽離子-π 作用 (圖3B 和圖3D)。值得關注的是，相對于對照藥劑噻呋酰胺 (圖3F) 來說，化合物11結(jié)構(gòu)中二苯醚片段的柔性較大，當與水稻紋枯病SDH 結(jié)合時，其二苯醚片段翻轉(zhuǎn)了近180°，從而和D_Y91 形成π-π 相互作用，使得其與靶標的作用力增強，提高其生物活性。

5 結(jié)語與展望

通過對10 個商品化SDHI 類殺菌劑的作用機制進行研究，確定了其結(jié)合模式，在此基礎上利用PFVS 方法進行虛擬篩選，得到了8 個hit 化合物。綜合合成難易程度、可修飾性和對SDH 抑制率的高低，優(yōu)先選擇了hit4苗頭作為先導化合物進行優(yōu)化?；谧饔脵C制以及前期工作，對吡唑環(huán)和二苯醚末端苯環(huán)進行取代優(yōu)化，得到了在酶水平和活體水平上均優(yōu)于商品化對照藥劑噻呋酰胺和吡噻菌胺的化合物11。該創(chuàng)制過程進一步證明了PFVS 的廣譜性以及該方法在農(nóng)藥創(chuàng)制過程中具有廣泛的應用前景。運用該方法，成功獲得了具有自主知識產(chǎn)權(quán)的新型SDHI 殺菌劑——氟苯醚酰胺。目前，關于氟苯醚酰胺的抗性風險評估和相關毒理學數(shù)據(jù)還不夠完善，未來將繼續(xù)補充試驗數(shù)據(jù)以加速其商品化進程。最后，隨著我國對新農(nóng)藥創(chuàng)制投入力度的加大，相信未來將有越來越多的具有自主知識產(chǎn)權(quán)的優(yōu)秀的產(chǎn)品在農(nóng)藥市場占據(jù)一席之地。

謹以此文慶賀中國農(nóng)業(yè)大學農(nóng)藥學學科成立70周年。

Dedicated to the 70th Anniversary of Pesticide Science in China Agricultural University.

作者簡介：

曾令強，男，2020 年畢業(yè)于西南大學植物保護學院，獲農(nóng)學學士學位。2020 年9 月于華中師范大學繼續(xù)攻讀碩士學位，主要研究具有新穎結(jié)構(gòu)的琥珀酸脫氫酶抑制劑的設計與合成及生物活性，目前已獲得一些階段性的成果，旨在創(chuàng)制農(nóng)藥新品種。

朱曉磊，女，2008 年畢業(yè)于華中師范大學化學學院，獲理學博士學位。2016—2017 年赴美國哈佛大學化學與化學生物院訪問學者?，F(xiàn)任華中師范大學教授，博士生導師。長期從事藥物分子設計工作，作為主要參與人創(chuàng)制出氟苯醚酰胺和苯醚唑酰胺兩個候選殺菌劑，均實現(xiàn)成果轉(zhuǎn)化，預計2024 年前后取得登記上市。截至目前，先后主持承擔包括5 項國家自然科學基金在內(nèi)的多項國家及省部級和企業(yè)委托科技項目。近五年以第一和通訊作者身份在JAFC 等國際農(nóng)藥學領域權(quán)威期刊發(fā)表30 篇SCI 論文，1 篇論文為高被引論文，獲中國發(fā)明專利及歐美等發(fā)達國家專利授權(quán)6 件。

楊光富，男，1997 年畢業(yè)于南開大學元素有機化學研究所，獲理學博士學位。2004—2005 年赴美國肯塔基大學藥學院高級訪問學者，2012 年8 月赴加拿大麥克馬斯特大學高級訪問學者?，F(xiàn)任華中師范大學教授、校學術(shù)委員會副主任、農(nóng)藥與化學生物學教育部重點實驗室主任。長期從事農(nóng)藥創(chuàng)制研究，在農(nóng)藥分子設計研究方面取得系統(tǒng)性研究成果，創(chuàng)制出全球第一個高粱地選擇性除草劑喹草酮和進入登記程序的吡唑喹草酯、氟苯醚酰胺、苯醚唑酰胺等多個農(nóng)藥候選新品種。2009 年獲國家杰出青年科學基金資助，2016 年入選“萬人計劃”科技創(chuàng)新領軍人才。曾獲教育部自然科學一等獎、湖北省自然科學一等獎、中國農(nóng)藥工業(yè)協(xié)會技術(shù)創(chuàng)新一等獎、侯德榜科技創(chuàng)新獎、藥明康德生命化學研究獎、中國化學會農(nóng)業(yè)化學貢獻獎及三農(nóng)金橋獎各1 項。自2020 年起連續(xù)入選Elsevier“中國高被引學者”榜單。先后被授予全國模范教師、全國優(yōu)秀科技工作者等榮譽稱號。指導博士學位論文獲全國百篇優(yōu)秀博士學位論文獎1 項和提名獎2 項。