秦耀果, 楊朝凱, 張以涵, 周雨蓓, 潘世香,劉 彥, 石 卓, 楊新玲*,

(1. 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué) 理學(xué)院 農(nóng)藥創(chuàng)新研究中心，北京 100193；2. 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院 昆蟲(chóng)學(xué)系，北京 100193)

蚜蟲(chóng)是一種廣泛分布的農(nóng)林害蟲(chóng)，具有一年多世代、繁殖迅速、種類眾多以及易產(chǎn)生抗藥性等特點(diǎn)，對(duì)農(nóng)作物的危害十分嚴(yán)重[1-3]。作為刺吸式口器害蟲(chóng)，蚜蟲(chóng)主要通過(guò)直接刺吸韌皮部汁液、分泌蜜露誘發(fā)煙煤病和傳播植物病毒3 種方式為害農(nóng)作物。目前蚜蟲(chóng)的防治主要依靠傳統(tǒng)殺蟲(chóng)劑，但隨著蚜蟲(chóng)抗藥性的產(chǎn)生，殺蟲(chóng)劑的用量持續(xù)增加，不僅造成環(huán)境污染，而且部分殺蟲(chóng)劑對(duì)人畜、天敵、蜜蜂等非靶標(biāo)生物也存在一定毒性，從而引起全世界的高度關(guān)注[4-6]，這嚴(yán)重限制了傳統(tǒng)殺蟲(chóng)劑在蚜蟲(chóng)防治上的應(yīng)用。因此，開(kāi)發(fā)環(huán)境友好的新型蚜蟲(chóng)控制劑刻不容緩。以生態(tài)友好為前提，利用蚜蟲(chóng)自身分泌的具有行為調(diào)控功能的信息素已經(jīng)成為蚜蟲(chóng)防治的重要策略[7]。

蚜蟲(chóng)在受到外界干擾時(shí)會(huì)從腹管分泌出油狀液滴，這種液滴含有蚜蟲(chóng)報(bào)警信息素，其主要成分為(E)-β-farnesene (圖式1)，簡(jiǎn)稱EβF[8-9]。EβF能對(duì)同種其他個(gè)體產(chǎn)生報(bào)警反應(yīng)，使蚜蟲(chóng)逃離現(xiàn)場(chǎng)，停止侵害作物[10]。此外，EβF 還具有調(diào)控有翅蚜比例、高劑量毒殺、殺蟲(chóng)劑增效作用[11-14]，以及吸引天敵等多重生物活性[15]。由于EβF 分子結(jié)構(gòu)中存在不穩(wěn)定的共軛雙鍵，使其易揮發(fā)、易氧化，極大地限制了其在蚜蟲(chóng)防治中的實(shí)際應(yīng)用。因此，研究人員對(duì)EβF 的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了修飾和改造[16-26]，以期發(fā)現(xiàn)活性與穩(wěn)定性兼?zhèn)涞?EβF 類似物。

圖式1 (E)-β-farnesene 的結(jié)構(gòu)Scheme 1 The structure of (E)-β-farnesene

本課題組在EβF 的結(jié)構(gòu)改造和生物活性研究方面做了多年工作。前期通過(guò)引入吡唑環(huán)、吡啶環(huán)、噻唑環(huán)、三嗪環(huán)、水楊酸結(jié)構(gòu)等基團(tuán)，獲得大量EβF 類似物，部分類似物不僅對(duì)蚜蟲(chóng)具有較好的驅(qū)避活性, 而且穩(wěn)定性比EβF 有很大提高[2,22-26]，尤其是引入水楊酸結(jié)構(gòu)的EβF 類似物，還表現(xiàn)出強(qiáng)烈的與靶標(biāo)氣味結(jié)合蛋白OBPs 結(jié)合的活性。例如，水楊酸酯類EβF 類似物3e(2-羥基-3-甲氧基苯甲酸香葉酯)，不僅對(duì)桃蚜和豌豆蚜Acyrthosiphon pisum顯示出較高的驅(qū)避活性，而且有很好的穩(wěn)定性，可與豌豆蚜氣味結(jié)合蛋白ApisOBP3、ApisOBP7及ApisOBP9 強(qiáng)烈結(jié)合，尤其是與ApisOBP9 的結(jié)合最為明顯[25]。有文獻(xiàn)報(bào)道，含烷氧基的化合物具有殺蟲(chóng)、殺菌等生物活性[27-28]，為發(fā)現(xiàn)結(jié)構(gòu)新穎、對(duì)蚜蟲(chóng)有效的新型EβF 類似物，本研究以3e為先導(dǎo)，用不同取代的烷氧基替換3e中鄰位的羥基，設(shè)計(jì)合成了一系列含烷氧基的EβF 類似物(圖式2 和圖式3)，并測(cè)試了目標(biāo)化合物對(duì)蚜蟲(chóng)的驅(qū)避活性及其與靶標(biāo)ApisOBP9 蛋白的結(jié)合活性，最后利用分子對(duì)接技術(shù)研究了代表性化合物6i與ApisOBP9 的結(jié)合模式，以其為進(jìn)一步設(shè)計(jì)蚜蟲(chóng)行為控制劑提供理論基礎(chǔ)。

圖式2 目標(biāo)化合物的設(shè)計(jì)策略Scheme 2 Design strategy of the target compounds

圖式3 目標(biāo)化合物的合成路線Scheme 3 Synthetic routes of the target compounds

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與供試材料

Bruker DPX 300 或 Ascend 500 MHz 核磁共振儀 (以 DMSO-d6或CDCl3為溶劑，TMS 為內(nèi)標(biāo))(德國(guó)Bruker 公司)；FTICR-MS 7.0 質(zhì)譜儀 (美國(guó)瓦里安公司)；PerkinElmer Spectrum 100 傅立葉變換紅外光譜儀 (美國(guó)PerkinElmer 公司)； X-5 型數(shù)字顯示顯微熔點(diǎn)測(cè)試儀 (北京富凱儀器有限公司)；T 型行為嗅覺(jué)儀 (即雙向T 型嗅覺(jué)儀，由玻璃制成，橫臂長(zhǎng)20 cm，內(nèi)徑1.5 cm，橫臂中心處與一豎直管相通，豎直管起釋放蚜蟲(chóng)及出氣口作用，橫臂內(nèi)置濾紙片，方便蚜蟲(chóng)爬行。北京廣達(dá)恒益科技有限公司)；F-380 型熒光分光光度計(jì) (天津港東科技股份有限公司)。柱層析硅膠 (200～300 目，篩孔徑75～48 μm) 和薄層層析硅膠板，青島海洋化工廠；先導(dǎo)化合物3e (本課題組自制[25])；對(duì)照藥劑95% EβF (美國(guó)Sigma-Aldrich 公司)；中間體2-甲氧基苯甲酸 (2a) 和2-乙氧基苯甲酸 (2b) (北京偶合科技有限公司)；其余試劑均為市售化學(xué)純或分析純，除特別注明外，所用溶劑未經(jīng)無(wú)水處理。豌豆蚜Acyrthosiphon pisum由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所提供。

1.2 化合物的合成

1.2.1 2-芐氧基取代苯甲酸 (2c～2i) 的合成 中間體2-甲氧基苯甲酸 (2a) 和2-乙氧基苯甲酸 (2b) 為購(gòu)買所得。中間體2-芐氧基取代苯甲酸 (2c～2i) 參考文獻(xiàn)方法[29]合成。在200 mL 三口瓶中，加入取代水楊酸 (1，100.0 mmol)、相轉(zhuǎn)移催化劑四丁基溴化銨 (TBAB) 3.2 g (10.0 mmol)、50 mL 二氯甲烷和50 mL 水，冰浴下滴加溴化芐 (300.0 mmol)，在常溫下反應(yīng)5 h。用二氯甲烷萃取，無(wú)水硫酸鈉干燥，減壓濃縮，硅膠柱層析分離 (V(石油醚) :V(乙酸乙酯) = 10: 1) 除去多余的溴化芐。將分離后的產(chǎn)物投入100 mL 三口瓶中，加入氫氧化鈉12.0 g (300.0 mmol)和50 mL 乙醇，回流4 h。減壓脫溶，用水溶解所得白色固體，滴加6 mol/L 的鹽酸溶液至pH = 4.0。過(guò)濾，濾餅用乙醇潤(rùn)洗，干燥得中間體2c～2i。

1.2.2 目標(biāo)化合物5a～5f 的合成 參考文獻(xiàn)方法[30]進(jìn)行。0 ℃下，向50 mL 三口瓶中加入先導(dǎo)化合物3e (6.6 mmol)、叔丁醇鉀(t-BuOK，9.9 mmol)和20 mL 無(wú)水四氫呋喃 (THF)，將中間體4 (33.0 mmol) 用10 mLN,N-二甲基甲酰胺 (DMF) 溶解后滴加至上述反應(yīng)液后反應(yīng)0.5 h，隨后在常溫下反應(yīng)4 h。反應(yīng)液用1 mol/L 的鹽酸調(diào)節(jié)pH 至中性，用飽和氯化鈉萃取，無(wú)水硫酸鈉干燥，過(guò)濾，減壓脫溶，硅膠柱層析 (V(石油醚) :V(乙酸乙酯) = 80 : 1) 分離純化，得到目標(biāo)化合物5a～5f。

1.2.3 目標(biāo)化合物6a～6i 的合成 參考文獻(xiàn)方法[25-26]進(jìn)行。在100 mL 三口瓶中，加入香葉醇(10.0 mmol)、2-烷氧基取代苯甲酸(10.0 mmol)、二環(huán)己基碳二亞胺 (DCC) 2.3 g (11.0 mmol) 和40 mL無(wú)水THF，0 ℃下將4-二甲氨基吡啶 (DMAP) 0.1 g(1.0 mmol)用10 mL 無(wú)水THF 溶解后滴加至上述反應(yīng)液反應(yīng)0.5 h，然后常溫下反應(yīng)8 h。用二氯甲烷萃取，無(wú)水硫酸鈉干燥，過(guò)濾，減壓脫溶，硅膠柱層析 (V(石油醚) :V(乙酸乙酯) = 100 : 1) 分離純化，得到目標(biāo)化合物6a～6i。

1.3 蚜蟲(chóng)驅(qū)避活性測(cè)試

采用 T 型行為嗅覺(jué)儀測(cè)定目標(biāo)化合物對(duì)豌豆蚜A.pisum的驅(qū)避活性，測(cè)定方法及劑量參照文獻(xiàn)方法[22]進(jìn)行。由釋放口釋放 20 頭豌豆蚜無(wú)翅成蚜, 每臂經(jīng)抽氣泵通入經(jīng)活性炭及蒸餾水的持續(xù)氣流。嗅覺(jué)儀的兩臂分別放置 5 μg 樣品 (氣味源) 和等體積的溶劑，記錄導(dǎo)入樣品 15 min 時(shí)蚜蟲(chóng)在各臂的數(shù)目[31]。按 (1) 式計(jì)算驅(qū)避率RP。

其中RP為驅(qū)避率(repellent proportion)，C為對(duì)照組蟲(chóng)數(shù)，T為處理組蟲(chóng)數(shù)。

利用SPSS 軟件 (IBM 公司) 對(duì)化合物的驅(qū)避率進(jìn)行單因素方差分析，并在α= 0.05 的水平上使用Tukey B 檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性差異分析。

1.4 ApisOBP 蛋白結(jié)合實(shí)驗(yàn)

參照文獻(xiàn)方法[25-26]，利用大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)出靶標(biāo)蛋白ApisOBP9，并經(jīng)過(guò)離子交換層析對(duì)重組蛋白純化。蛋白競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合實(shí)驗(yàn)所用容器為1 cm 寬的石英杯，縫寬為10 nm。設(shè)定激發(fā)光波長(zhǎng)為337 nm，掃描的發(fā)射光波長(zhǎng)范圍為390～500 nm。向熒光比色皿中加入1 mL 濃度為50 mmol/L 的Tri-HCl 緩沖液(pH=8.0)，使ApisOBP9的終濃度為2 μmol/L，選擇N-苯基-1-萘胺 (1-NPN) 為熒光探針，陸續(xù)向比色皿中加入溶于甲醇的1 mmol/L 熒光探針1-NPN，使加入的1-NPN濃度從2 μmol/L 遞增到20 μmol/L，每加入一次1-NPN 就記錄該濃度下的最大熒光強(qiáng)度值，利用Scatchard 方程計(jì)算ApisOBP9 和1-NPN 的結(jié)合常數(shù)。用熒光競(jìng)爭(zhēng)的方法測(cè)試化合物與蛋白ApisOBP9的結(jié)合能力：在熒光比色皿中加入1 mL 50 mmol/L的Tri-HCl 緩沖液(pH=8.0)，然后加入ApisOBP9和熒光探針1-NPN，終濃度均為2 μmol/L，記錄最大熒光強(qiáng)度值。隨后將溶于甲醇的1 mmol/L 化合物逐次加入到熒光比色皿中，使加入的化合物濃度從2 μmol/L 遞增到20 μmol/L，記錄各梯度濃度下的最大熒光強(qiáng)度值。每次試驗(yàn)重復(fù)3 次。根據(jù)IC50值(ApisOBP/1-NPN 復(fù)合物的熒光強(qiáng)度值下降一半時(shí)配體的濃度)，按 (2) 式計(jì)算目標(biāo)物和ApisOBP9 的解離常數(shù)(Kd)。

其中[1-NPN] 為未結(jié)合的1-NPN 的濃度，K1-NPN為ApisOBP/1-NPN 復(fù)合物的結(jié)合常數(shù)。

1.5 化合物與ApisOBP9 的分子對(duì)接研究

由于ApisOBP9 的氨基酸與PDB 蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)中的蛋白晶體模板序列同源性都低于30%，為了獲得更好的模型，使用一種快速準(zhǔn)確的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)算法 (名稱為trRosetta，https://yanglab.nankai.edu.cn/trRosetta)[32]對(duì)ApisOBP 9 的結(jié)構(gòu)進(jìn)行建模，最終的3D 模型在在線結(jié)構(gòu)分析和驗(yàn)證服務(wù)器上使用多種方法進(jìn)行評(píng)估(http://services.mbi.ucla.edu/SAVES/)。采用Sybyl 7.3 軟件包中的Surflex Dock 算法進(jìn)行配體和ApisOBP9 之間的分子對(duì)接研究，使用AMBER MMFF94 力場(chǎng)和電荷對(duì)化合物進(jìn)行構(gòu)建和優(yōu)化，選擇代表性化合物的低能構(gòu)象作為初始對(duì)接構(gòu)象。配體分子保留30 個(gè)對(duì)接構(gòu)象，保留得分最低的構(gòu)象以進(jìn)一步探究配體與蛋白質(zhì)的相互作用。

2 結(jié)果與分析

2.1 化合物合成

中間體2-芐氧基取代苯甲酸 (2c～2i) 由取代-水楊酸與溴化芐發(fā)生親核取代反應(yīng)的產(chǎn)物經(jīng)皂化反應(yīng)得到。目標(biāo)化合物5a～5f 由先導(dǎo)化合物3e 與碘代烷發(fā)生烷基化反應(yīng)制得，3e 的合成參考文獻(xiàn)方法[25]，由香葉醇與3-甲氧基水楊酸經(jīng)親核取代反應(yīng)得到。目標(biāo)化合物6a～6i 則以香葉醇 (3) 為起始原料，與相應(yīng)的2-烷氧基苯甲酸 (2a～2i) 發(fā)生親核取代反應(yīng)制得。目標(biāo)化合物的結(jié)構(gòu)表征數(shù)據(jù)如下。

2-乙基-3-甲氧基苯甲酸香葉酯 (5a)：無(wú)色液體, 產(chǎn)率73.3%.1H NMR (500 MHz, DMSO-d6),δ: 7.22 (dd,J= 7.4,2.4 Hz, 1H, ArH), 7.16～7.10 (m, 2H, ArH), 5.41 (td,J= 7.1,1.0 Hz, 1H, C=CH), 5.13～4.96 (m, 1H, C=CH), 4.75 (d,J=7.1 Hz, 2H, O=COCH2), 3.98 (q,J=7.0 Hz, 2H, ArOCH2),3.81 (d,J=7.4 Hz, 3H, ArOCH3), 2.13～1.99 (m, 4H,CCH2CH2), 1.72 (s, 3H, CH3), 1.62 (s, 3H, CH3), 1.56 (s, 3H,CH3), 1.26 (t,J= 7.0 Hz, 3H, CH3). IR (KBr),ν/cm-1: 2 974, 2 931,1 726, 1 581, 1 475, 1 383, 1 309, 1 261, 1 147, 1057. HRMS(ESI)：C20H28O4[M + Na]+，測(cè)量值355.188 6, 計(jì)算值355.188 0。

2-丙基-3-甲氧基苯甲酸香葉酯 (5b)：無(wú)色液體, 產(chǎn)率68.5%.1H NMR (500 MHz, DMSO-d6),δ: 7.21 (dd,J= 7.5,2.1 Hz, 1H, ArH), 7.16～7.09 (m, 2H, ArH), 5.40 (t,J= 6.9 Hz,1H, C=CH), 5.07 (t,J= 6.6 Hz, 1H, C=CH), 4.75 (d,J= 7.1 Hz, 2H, O=COCH2), 3.88 (t,J= 6.7 Hz, 2H, ArOCH2), 3.81(s, 3H, ArOCH3), 2.05 (dt,J= 21.0, 6.7 Hz, 4H, CCH2CH2),1.71 (s, 3H, CH3), 1.68 (dd,J= 14.2, 7.1 Hz, 2H, CH2), 1.62(s, 3H, CH3), 1.56 (s, 3H, CH3), 0.94 (t,J= 7.4 Hz, 3H, CH3).IR (KBr),ν/cm-1: 2 964, 2 933, 2 881, 1 726, 1 670, 1 581, 1 473, 1 382,1 309, 1 261, 1 147, 1058. HRMS(ESI)：C21H30O4[M +Na]+，測(cè)量值369.203 2, 計(jì)算值369.203 6。

2-正丁基-3-甲氧基苯甲酸香葉酯 (5c)：無(wú)色液體, 產(chǎn)率60.4%.1H NMR (500 MHz, DMSO-d6),δ: 7.21 (dd,J=7.6, 2.2 Hz, 1H, ArH), 7.16～7.08 (m, 2H, ArH), 5.40 (td,J=7.1, 1.0 Hz, 1H, C=CH), 5.14～5.00 (m, 1H, C=CH), 4.74 (d,J= 7.1 Hz, 2H, O=COCH2), 3.92 (t,J= 6.6 Hz, 2H, ArOCH2),3.80 (d,J= 4.1 Hz, 3H, ArOCH3), 2.05 (tt,J= 13.7, 7.0 Hz,4H, CCH2CH2), 1.71 (s, 3H, CH3), 1.67～1.60 (m, 5H, CH2,CH3), 1.55 (s, 3H, CH3), 1.45～1.36 (m, 2H, CH2), 0.91 (t,J=7.4 Hz, 3H, CH3). IR (KBr),ν/cm-1: 2 959, 2 933, 1 726, 1 581, 1 477,1 381, 1 310, 1 262, 1 147, 1058. HRMS(ESI)：C22H32O4[M +Na]+，測(cè)量值383.218 4, 計(jì)算值383.219 3。

2-正戊基-3-甲氧基苯甲酸香葉酯 (5d)：無(wú)色液體, 產(chǎn)率57.7%.1H NMR (500 MHz, DMSO-d6),δ: 7.21 (dd,J=7.5, 2.0 Hz, 1H, ArH), 7.15～7.08 (m, 2H, ArH), 5.40 (t,J= 7.0 Hz, 1H, C=CH), 5.07 (t,J= 6.6 Hz, 1H, C=CH), 4.74 (d,J=7.1 Hz, 2H, O=COCH2), 3.91 (t,J= 6.6 Hz, 2H, ArOCH2),3.81 (s, 3H, ArOCH3), 2.12～1.98 (m, 4H, CCH2CH2), 1.71 (s,3H, CH3), 1.69～1.64 (m, 2H, CH2, CH2), 1.62 (s, 3H, CH3),1.55 (s, 3H, CH3), 1.41～1.26 (m, 4H, CH2, CH2), 0.88 (t,J=7.0 Hz, 3H, CH3). IR (KBr),ν/cm-1: 2 933, 1 727, 1 581, 1 474, 1 381,1 310, 1 262, 1 232, 1 147, 1057. HRMS(ESI)：C23H34O4[M +H]+，測(cè)量值375.252 5, 計(jì)算值375.253 0。

2-正己基-3-甲氧基苯甲酸香葉酯 (5e)：淺黃色液體, 產(chǎn)率53.2%.1H NMR (500 MHz, DMSO-d6),δ: 7.30 (dd,J=7.4, 1.8 Hz, 1H, ArH), 7.08～6.99 (m, 2H, ArH, ArH), 5.46 (t,J= 6.9 Hz, 1H, C=CH), 5.09 (t,J= 6.6 Hz, 1H, C=CH), 4.82 (d,J= 7.1 Hz, 2H, O=COCH2), 4.00 (t,J= 6.9 Hz, 2H, ArOCH2),3.85 (s, 3H, ArOCH3), 2.16～2.03 (m, 4H, CCH2CH2), 1.79(dd,J= 14.6, 7.3 Hz, 2H, CH2), 1.75 (s, 3H, CH3), 1.68 (s, 3H,CH3), 1.60 (s, 3H, CH3), 1.49～1.39 (m, 2H, CH2), 1.33 (dd,J=8.7, 5.4 Hz, 4H, CH2, CH2), 0.90 (t,J= 6.7 Hz, 3H, CH3). IR(KBr),ν/cm-1: 2 930, 2 858, 1 727, 1 581, 1 474, 1 381, 1 310, 1 261,1 147, 1058. HRMS(ESI)：C24H36O4[M + Na]+，測(cè)量值411.250 1,計(jì)算值411.250 6。

2-正庚基-3-甲氧基苯甲酸香葉酯 (5f)：淺黃色液體, 產(chǎn)率42.4%.1H NMR (500 MHz, DMSO-d6),δ: 7.21 (dd,J=6.9, 2.9 Hz, 1H, ArH), 7.16～7.08 (m, 2H, ArH), 5.39 (dd,J=7.1, 6.1 Hz, 1H, C=CH), 5.07 (dd,J= 9.5, 3.9 Hz, 1H, C=CH),4.74 (d,J= 7.1 Hz, 2H, O=COCH2), 3.90 (t,J= 6.6 Hz, 2H,ArOCH2), 3.81 (s, 3H, ArOCH3), 2.12～2.00 (m, 4H,CCH2CH2), 1.71 (s, 3H, CH3), 1.68～1.61 (m, 5H, CH3, CH2),1.56 (s, 3H, CH3), 1.39～1.24 (m, 8H, CH2, CH2, CH2, CH2),0.86 (t,J= 6.9 Hz, 3H, CH3). IR (KBr),ν/cm-1: 2 927, 2 856, 1 727,1 581, 1 474, 1 381, 1 310, 1 261, 1 146, 1058. HRMS(ESI)：C25H38O4[M + H]+，測(cè)量值403.284 3, 計(jì)算值403.284 3。

2-甲氧基苯甲酸香葉酯 (6a)：淺黃色液體, 產(chǎn)率67.0%.1H NMR (300 MHz, CDCl3),δ: 7.77～7.80 (m, 1H, ArH),7.42～7.48 (m, 1H, ArH), 6.94～6.99 (m, 2H, ArH), 5.44～5.49(m, 1H, =CH), 5.08～5.12 (m, 1H, =CH), 4.82 (d, 2H,J= 7.06 Hz, CH2), 3.90 (s, 3H, ArOCH3), 2.05～2.13 (m, 4H, CH2CH2),1.76 (s, 3H, CH3), 1.68 (s, 3H, CH3), 1.60 (s, 3H, CH3). IR(KBr),ν/cm-1: 2 966, 2 923, 2 855, 1 377, 1 601, 1 583, 1 491, 1 463,1 727, 1250. HRMS(ESI)：C18H25O3[M + H]+，測(cè)量值289.179 86,計(jì)算值289.179 82。

2-乙氧基苯甲酸香葉酯 (6b)：淺黃色液體, 產(chǎn)率78.0%.1H NMR (300 MHz, CDCl3),δ: 7.75～7.78 (m, 1H, ArH),7.39～7.44 (m, 1H, ArH), 6.93～6.97 (m, 2H, ArH), 5.45～5.50(m, 1H, =CH), 5.08～5.10 (m, 1H, =CH), 4.82 (d, 2H,J= 7.02 Hz, CH2), 4.11 (q, 2H, ArOCH2CH3), 2.03～2.17(m, 4H,CH2CH2), 1.76 (s, 3H, CH3), 1.6 8(s, 3H, CH3), 1.60 (s, 3H,CH3), 1.45 (t, 3H,J= 6.18 Hz, ArOCH2CH3). IR (KBr),ν/cm-1:2 980, 2 926, 1 384, 1 601, 1 582, 1 492, 1 453, 1 728, 1248.HRMS(ESI)：C19H26O3Na [M + Na]+，測(cè)量值325.177 40,計(jì)算值325.177 42。

2-芐基-3-甲基苯甲酸香葉酯 (6d)：黃色液體, 產(chǎn)率41.7%.1H NMR (300 MHz, CDCl3),δ: 7.66～7.69 (m, 1H,ArH), 7.47～7.50 (m, 2H, ArH), 7.33～7.41 (m, 4H, ArH), 7.07(t, 1H,J= 15.31 Hz, ArH), 5.39～5.44 (m, 1H, =CH),5.07～5.09 (m, 1H, =CH), 4.96 (s, 2H, CH2), 4.81 (d, 2H,J=7.12 Hz, CH2), 2.31 (s, 3H, ArCH3), 2.02～2.09 (m, 4H,CH2CH2), 1.70 (s, 3H, CH3), 1.64 (s, 3H, CH3), 1.59 (s, 3H,CH3). IR (KBr),ν/cm-1: 2 966, 2 923, 1 376, 1 593, 1 497, 1 454, 3 030,1 724, 1286. HRMS(ESI)：C25H31O3[M + H]+，測(cè)量值379.226 32,計(jì)算值379.226 77。

2-芐基-4-甲基苯甲酸香葉酯 (6e)：黃色液體, 產(chǎn)率70.1%.1H NMR (300 MHz, CDCl3),δ: 7.75 (d, 1H,J= 7.77 Hz, ArH), 7.24～7.52 (m, 5H, ArH), 6.78～6.82 (m, 2H, ArH),5.41～5.47 (m, 1H, =CH), 5.15 (s, 2H, CH2), 5.07～5.11 (m, 1H,=CH), 4.82 (d, 2H,J= 7.02 Hz, CH2), 2.35 (s, 3H, ArCH3),2.02～2.11 (m, 4H, CH2CH2), 1.73 (s, 3H, CH3), 1.67 (s, 3H,CH3), 1.59 (s, 3H, CH3). IR (KBr),ν/cm-1: 2 966, 2 924, 2 856,1 384, 1 623, 1 579, 1 504, 1 452, 1 672, 1250. HRMS(ESI)：C25H31O3[M + H]+，測(cè)量值379.226 41, 計(jì)算值379.226 77。

2-芐基-5-甲基苯甲酸香葉酯 (6f)：黃色液體, 產(chǎn)率44.4%.1H NMR (300 MHz, CDCl3),δ: 7.62 (d, 1H, J = 2.19 Hz, ArH), 7.46～7.49 (m, 2H, ArH), 7.17～7.38 (m, 4H, ArH),6.88 (d, 1H,J= 8.46 Hz, ArH), 5.43～5.48 (m, 1H, =CH), 5.11(s, 2H, CH2), 5.08～5.09 (m, 1H, =CH), 4.83 (d, 2H,J= 7.05 Hz, CH2), 2.28 (s, 3H, ArCH3), 2.05～2.13 (m, 4H, CH2CH2),1.73 (s, 3H, CH3), 1.69 (s, 3H, CH3), 1.59 (s, 3H, CH3). IR(KBr),ν/cm-1: 2 924, 1 381, 1 614, 1 583, 1 502, 1 454, 1 724,1249. HRMS(ESI)：C25H31O3[M + H]+，測(cè)量值379.226 81,計(jì)算值379.226 77。

2-芐基-3-甲氧基苯甲酸香葉酯 (6g)：黃色液體, 產(chǎn)率68.4%.1H NMR (300 MHz, CDCl3),δ: 7.52 (d, 2H,J= 7.03 Hz, ArH), 7.27～7.38 (m, 4H, ArH), 7.02～7.11 (m, 2H, ArH),5.37～5.42 (m, 1H, =CH), 5.08 (s, 2H, CH2), 5.04～5.05 (m, 1H,=CH), 4.78 (d, 2H,J= 7.05 Hz, CH2), 3.85 (s, 3H, ArOCH3),2.00～2.09 (m, 4H, CH2CH2), 1.74 (s, 3H, CH3), 1.66 (s, 3H,CH3), 1.58 (s, 3H, CH3). IR (KBr),ν/cm-1: 2 967, 2 929, 1 376, 1 581,1 497, 1 475, 1 725, 1264. HRMS(ESI)：C25H31O4[M + H]+，測(cè)量值395.221 28, 計(jì)算值395.221 69。

2-芐基-4-甲氧基苯甲酸香葉酯 (6h)：黃色液體, 產(chǎn)率40.8%.1H NMR (300 MHz, CDCl3),δ: 7.88 (d, 1H,J= 8.46 Hz, ArH), 7.51 (d, 2H,J= 7.40 Hz, CH2), 7.25～7.39 (m, 3H,ArH), 6.48～6.51 (m, 2H, ArH), 5.39～5.44 (m, 1H, =CH), 5.14(s, 2H, CH2), 5.07～5.09 (m, 1H, =CH), 4.81 (d, 2H,J= 6.98 Hz, CH2), 3.79 (s, 3H, ArOCH3), 2.02～2.11 (m, 4H, CH2CH2),1.70 (s, 3H, CH3), 1.67 (s, 3H, CH3), 1.59 (s, 3H, CH3). IR(KBr),ν/cm-1: 2 925, 2 855, 1 381, 1 608, 1 577, 1 504, 1 442, 1 719,1249. HRMS(ESI)：C25H29O4[M-H]-，測(cè)量值393.206 39,計(jì)算值393.206 04。

2-芐基-5-甲氧基苯甲酸香葉酯 (6i)：黃色液體, 產(chǎn)率76.6%.1H NMR (300 MHz, CDCl3),δ: 7.47 (d, 2H,J= 7.08 Hz, ArH), 7.24～7.38 (m, 4H, ArH), 6.91～6.99 (m, 2H, ArH),5.42～5.47 (m, 1H, =CH), 5.09 (s, 2H, CH2), 5.06～5.07 (m, 1H,=CH), 4.83 (d, 2H,J= 7.05 Hz, CH2), 3.77 (s, 3H, ArOCH3),2.02～2.11 (m, 4H, CH2CH2), 1.73 (s, 3H, CH3), 1.67 (s, 3H,CH3), 1.59 (s, 3H, CH3). IR (KBr),ν/cm-1: 2 967, 2 928, 1 380, 1 584,1 500, 1 454, 1 726, 1284. HRMS(ESI)：C25H31O4[M + H]+，測(cè)量值395.220 25, 計(jì)算值395.221 69。

2.2 驅(qū)避活性

以豌豆蚜為對(duì)象，首先測(cè)試了無(wú)翅成蚜對(duì)溶劑正己烷的行為反應(yīng)，結(jié)果顯示蚜蟲(chóng)不偏向行為嗅覺(jué)儀的任何一端 (x2= 0.12,df= 1,P= 0.729)；然后測(cè)試了目標(biāo)化合物的驅(qū)避活性。結(jié)果(表1)表明：在5 μg 劑量下，所有目標(biāo)化合物對(duì)豌豆蚜均有驅(qū)避活性，部分活性較明顯，例如化合物 6c、6e、6f、6h 和6i 的驅(qū)避率達(dá)到 50%以上；化合物5c～5f 的活性較低，驅(qū)避率僅為20%左右。當(dāng)苯環(huán)上的酚羥基被烷氧基或芐氧基取代后，化合物的驅(qū)避活性都不及先導(dǎo)化合物3e 和對(duì)照藥劑EβF，其中6i 的活性最高，驅(qū)避率達(dá)到60.9%，與先導(dǎo)3e 的活性沒(méi)有顯著性差異。因此，在水楊酸2 位引入含醚基團(tuán)對(duì)EβF 類似物的驅(qū)避活性不利。以6i 為先導(dǎo)化合物，在水楊酸的2 位仍保持羥基結(jié)構(gòu)或引入酯基[25-26]等與靶標(biāo)位點(diǎn)有較好結(jié)合的基團(tuán)，設(shè)計(jì)合成其他結(jié)構(gòu)的類似物，有進(jìn)一步研究的價(jià)值。

在進(jìn)行地表施工作業(yè)時(shí)，地表淺層土通常是施工的重要目標(biāo)。但是地表淺層土?xí)軠囟?、土體、氣候等多方面因素的干擾，因此其水分場(chǎng)與溫度場(chǎng)都會(huì)不斷改變，而且相互影響。土壤的溫度在發(fā)生改變時(shí)，土體內(nèi)部的水分也會(huì)相應(yīng)變化，這一變化進(jìn)而會(huì)導(dǎo)致其自身導(dǎo)熱系數(shù)與比熱的改變，最終引起土壤溫度場(chǎng)與傳熱能力的變化。在溫度降低的時(shí)候，土壤會(huì)迅速凝固并釋放熱能，此時(shí)水分也會(huì)相應(yīng)發(fā)生移動(dòng)，那么土體的溫度場(chǎng)就會(huì)產(chǎn)生變化。［2］

表1 目標(biāo)化合物的豌豆蚜驅(qū)避活性Table 1 The aphid repellent activity against A. pisum

初步構(gòu)效關(guān)系分析表明，R1與R2取代基均對(duì)化合物驅(qū)避活性有影響。當(dāng)R1為3-甲氧基時(shí)，不論R2為芐基或烷基，化合物的驅(qū)避活性均不明顯，尤其是R2為C4～C7直鏈烷基時(shí)的驅(qū)避活性僅為20%左右 (5c～5f)；當(dāng)R1為氫時(shí)，R2為芐基比烷基對(duì)活性有利 (6c ＞ 6a 和6b)，且R2為乙基比甲基對(duì)活性有利 (6b ＞ 6a)。當(dāng)R2為甲基或乙基時(shí)，不論R1為氫或3-甲氧基，化合物的驅(qū)避活性均不理想。由此可見(jiàn)，R2為芐基較烷基對(duì)驅(qū)避活性更有利。當(dāng)R2為芐基時(shí)，R1基團(tuán)為4 位取代或5 位取代對(duì)活性更有利，如6e 和6f ＞ 6d，6h 和6i ＞ 6g。

2.3 蛋白結(jié)合活性

蚜蟲(chóng)OBP9 幾乎只在觸角中表達(dá)，在不同蚜蟲(chóng)種類之間具有良好的保守性[33]，在豌豆蚜、桃蚜、麥長(zhǎng)管蚜中均有報(bào)道[25,33-35]，是識(shí)別氣味小分子的關(guān)鍵靶標(biāo)蛋白。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，ApisOBP9可與EβF 及其大多數(shù)類似物強(qiáng)烈結(jié)合，其結(jié)合能力甚至高于已報(bào)道的潛在靶標(biāo)ApisOBP3 和ApisOBP7[25-26]。D'Onofrio 等研究發(fā)現(xiàn)，豌豆蚜ApisOBP9 還與長(zhǎng)鏈的、尤其是與16 個(gè)碳原子的醇類和醛類揮發(fā)物有好的結(jié)合[33]。麥長(zhǎng)管蚜的SaveOBP9 與大多數(shù)小麥揮發(fā)物具有廣譜且較高的結(jié)合能力[34]。桃蚜的MperOBP9 則與EβF 及部分植物揮發(fā)物具有較高的結(jié)合活性[35]。

參考文獻(xiàn)方法[25]，表達(dá)純化出模式蚜蟲(chóng)豌豆蚜的氣味結(jié)合蛋白ApisOBP9，并研究其與目標(biāo)化合物的結(jié)合特性。結(jié)果 (圖1，圖2) 表明：與驅(qū)避活性所得結(jié)果相似，苯環(huán)上的酚羥基被烷氧基或芐氧基取代后的目標(biāo)物仍與ApisOBP9 表現(xiàn)出結(jié)合活性。部分化合物的蛋白結(jié)合活性較好，例如化合物 6b、6c、6e 和6i，其中6i 的蛋白結(jié)合活性最高，但不及先導(dǎo)3e；而R2為脂肪鏈的化合物5a～5f 與ApisOBP9 的結(jié)合活性較低。

圖1 目標(biāo)化合物與ApisOBP9 的熒光競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合曲線Fig. 1 Fluorescence competitive binding curves of the target compounds to ApisOBP9

圖2 目標(biāo)化合物與ApisOBP9 的結(jié)合活性Fig. 2 Binding activity of the target compounds with ApisOBP9 from A. pisum

初步構(gòu)效關(guān)系分析表明，取代基R1與R2的種類均對(duì)蛋白結(jié)合活性有影響?？傮w上，R2為芐基比烷基對(duì)活性有利，尤其是當(dāng)R2為C2-C7直鏈烷基時(shí)，化合物 (5a～5f) 的蛋白結(jié)合活性較低，結(jié)合常數(shù) (解離常數(shù)的倒數(shù)：1/Kd) 僅為0.62 μmol/L及以下。當(dāng)R2為芐基時(shí)， R1基團(tuán)為4 位取代或5 位取代對(duì)活性更有利，如6e 和6f ＞ 6d，6h 和6i ＞ 6g。對(duì)比分析目標(biāo)化合物的蚜蟲(chóng)驅(qū)避活性和蛋白結(jié)合活性，發(fā)現(xiàn)二者表現(xiàn)出一致性的趨勢(shì)。例如，目標(biāo)化合物6i 具有最高的蛋白結(jié)合活性，也具有最好的驅(qū)避活性，而R2為直鏈烷基的化合物 (5a～5f) 則表現(xiàn)出較弱的蛋白結(jié)合活性，它們的驅(qū)避活性也相對(duì)較低。

2.4 分子對(duì)接結(jié)果分析

選擇代表性化合物6i，研究其與蛋白ApisOBP9的結(jié)合模式。分子對(duì)接結(jié)果顯示，6i 與3e 在蛋白結(jié)合口袋中的方向一致，但也有所不同：3e 的芳香環(huán)區(qū)域靠近Leu130 一側(cè)，EβF 鏈靠近Pro69 一側(cè)[26]，而6i 的雙芳香環(huán)區(qū)域靠近Arg126 一側(cè)，EβF 鏈靠近Cys97 一側(cè) (圖3)；此外，6i 的EβF鏈與氨基酸殘基Pro69、Pro71、Phe74、Tyr94、Cys97、Phe112、Ala116 和Val127 形成疏水相互作用，而3e 的EβF 鏈則主要與Met53、Met62、Pro69、Pro71、Phe74、Val93、Lys96、Ala113 和Ala116 等氨基酸殘基形成重要的疏水作用。這表明6i 在與ApisOBP9 的結(jié)合作用上，可能與3e 分子有類似的作用機(jī)理。但對(duì)比3e 與6i的結(jié)合構(gòu)象圖發(fā)現(xiàn)，3e 分子是舒展的線形分子，6i 分子則因?yàn)樵? 位引入了新的大位阻基團(tuán)芐基，導(dǎo)致配體分子扭曲折疊起來(lái)。因此推測(cè)6i 在2-OH 位點(diǎn)引入芐基后，導(dǎo)致分子的空間位阻過(guò)大，與ApisOBP9的結(jié)合口袋不匹配，這可能是導(dǎo)致該化合物與ApisOBP9 結(jié)合活性降低的原因。此外，新引入化合物6i 的芐基基團(tuán)可以與Phe117 形成“T-π”相互作用，同時(shí)又與Arg126 形成了“Cation-π”相互作用，增強(qiáng)了其與蛋白的結(jié)合活性。因此引入的芐基芳香環(huán)可能發(fā)揮了重要的極性相互作用。這也可能是含芐基類化合物結(jié)合活性高于脂肪鏈化合物的原因之一 (6i ＞ 5a～5f)。

圖3 目標(biāo)化合物6i 與豌豆蚜氣味結(jié)合蛋白ApisOBP9 的結(jié)合模式Fig. 3 Binding mode of the compound 6i with ApisOBP9

3 結(jié)論

本研究以前期發(fā)現(xiàn)的水楊酸酯類EβF 類似物3e 為先導(dǎo)，以蚜蟲(chóng)氣味結(jié)合蛋白為靶標(biāo)，通過(guò)活性亞結(jié)構(gòu)拼接設(shè)計(jì)并合成了一系列新型2-烷氧基取代苯甲酸香葉酯類EβF 類似物，其結(jié)構(gòu)均經(jīng)過(guò)1H NMR、IR 和HRMS 確證?；钚詼y(cè)定結(jié)果表明，目標(biāo)化合物對(duì)豌豆蚜無(wú)翅成蚜都有驅(qū)避活性，但均不及先導(dǎo)化合物3e，其中6i 的驅(qū)避活性最高，在5 μg 劑量下達(dá)到60.9%，與先導(dǎo)3e 的活性沒(méi)有顯著性差異。靶標(biāo)蛋白結(jié)合實(shí)驗(yàn)證明，部分目標(biāo)化合物與氣味結(jié)合蛋白ApisOBP9 具有較好的結(jié)合活性，尤其是化合物6i 與ApisOBP9 的結(jié)合活性最優(yōu)。進(jìn)一步分子對(duì)接結(jié)果表明， 6i 與ApisOBP9 具有較好的疏水作用力，可以很好地結(jié)合到靶標(biāo)氣味結(jié)合蛋白的活性位點(diǎn)，其結(jié)合模式和先導(dǎo)相似。本研究結(jié)果表明，在先導(dǎo)化合物3e 的水楊酸2 位羥基結(jié)構(gòu)上引入直鏈烷氧基或芐氧基后，化合物的蚜蟲(chóng)驅(qū)避活性和靶標(biāo)蛋白結(jié)合活性均有不同程度的降低。因此，在水楊酸2 位引入含醚基團(tuán)對(duì)EβF 類似物的驅(qū)避活性不利，建議水楊酸2 位仍保持羥基結(jié)構(gòu)或引入酯基等與靶標(biāo)位點(diǎn)結(jié)合較好的基團(tuán)。該研究結(jié)果為后續(xù)化合物的進(jìn)一步設(shè)計(jì)和結(jié)構(gòu)優(yōu)化提供了重要參考價(jià)值。

謹(jǐn)以此文慶賀中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)藥學(xué)學(xué)科成立70 周年。

Dedicated to the 70th Anniversary of Pesticide Science in China Agricultural University.

作者簡(jiǎn)介：

秦耀果，女，講師。2011 年6 月在貴州大學(xué)植物保護(hù)專業(yè)獲農(nóng)學(xué)學(xué)士學(xué)位。2011.9—2017.6 在中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)藥學(xué)專業(yè)碩博連讀，并獲博士學(xué)位，期間（2014.10—2015.09）由國(guó)家留學(xué)基金委資助在英國(guó)Rothamsted Research 進(jìn)行博士聯(lián)合培養(yǎng)，畢業(yè)后在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所從事博士后研究工作。2020 年入職中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)，研究方向?yàn)檠料x(chóng)及其天敵感知?dú)馕斗肿拥淖饔脵C(jī)制。主持國(guó)家自然科學(xué)基金青年基金 1 項(xiàng)，主持博士后基金面上基金 1 項(xiàng)。

楊朝凱，男，博士研究生。2016年6 月在山西農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)專業(yè)獲農(nóng)學(xué)學(xué)士學(xué)位。2016 年9 月至今在中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院農(nóng)藥學(xué)專業(yè)碩博連讀，期間 (2019年5 月至8 月) 在學(xué)校研究生國(guó)際化培養(yǎng)提升項(xiàng)目資助下赴美國(guó)加州大學(xué)戴維斯分校進(jìn)行合作研究，主要從事基于植物揮發(fā)性物質(zhì)的新型蚜蟲(chóng)行為控制劑的設(shè)計(jì)、合成和生物活性研究。

楊新玲，教授，博士生導(dǎo)師，綠色農(nóng)藥分子設(shè)計(jì)與發(fā)現(xiàn)團(tuán)隊(duì)負(fù)責(zé)人。1995年于北京農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)藥學(xué)專業(yè)獲得理學(xué)博士學(xué)位。1995 年至今在中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)從事教學(xué)科研工作，研究領(lǐng)域?yàn)樾罗r(nóng)藥分子設(shè)計(jì)與合成、化學(xué)生物學(xué)，主要研究方向包括靶標(biāo)導(dǎo)向的新型昆蟲(chóng)生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的創(chuàng)制、以昆蟲(chóng)源或植物源活性物質(zhì)為模型的新型害蟲(chóng)行為控制劑研究等，先后主持或參加國(guó)家自然科學(xué)基金、國(guó)家科技支撐計(jì)劃、973 計(jì)劃、農(nóng)業(yè)部公益行業(yè)項(xiàng)目、國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃等課題10 余項(xiàng)。曾獲IUPAC 農(nóng)藥化學(xué) ‘農(nóng)藥科學(xué)特殊貢獻(xiàn)獎(jiǎng)’，現(xiàn)任北京農(nóng)藥學(xué)會(huì)副理事長(zhǎng)兼秘書(shū)長(zhǎng)，中國(guó)農(nóng)藥工業(yè)協(xié)會(huì)知識(shí)產(chǎn)權(quán)專業(yè)委員會(huì)副主任委員，中國(guó)化工學(xué)會(huì)農(nóng)藥專業(yè)委員會(huì)委員，中國(guó)化學(xué)會(huì)農(nóng)業(yè)化學(xué)專業(yè)委員會(huì)委員，中國(guó)生化制藥工業(yè)協(xié)會(huì)多肽分會(huì)專家委員會(huì)委員等。擔(dān)任Pest Management Science等期刊編委，現(xiàn)任《農(nóng)藥學(xué)學(xué)報(bào)》常務(wù)編委。