袁佩穎，楊瀟劍,2，吳振威，榮倩倩，張 姝，任移嶸

（1.信陽學院 理工學院,河南 信陽 464000；2.信陽學院 分析測試中心,河南 信陽 464000）

信陽毛尖是河南省信陽市著名特產(chǎn)，屬于我國十大名茶，營養(yǎng)豐富，富含茶多酚等多種營養(yǎng)成分。相關(guān)研究表明，長期飲用信陽毛尖可以有效起到抗菌消炎、清除體內(nèi)自由基、降低人體膽固醇、抑制細胞癌變等作用。

據(jù)公開數(shù)據(jù)統(tǒng)計，截至2019年，信陽市茶園面積14.25萬hm，茶葉產(chǎn)量達7.2萬t，預測到2022年茶葉產(chǎn)量達到8.2萬t。根據(jù)相關(guān)研究及實際走訪，筆者發(fā)現(xiàn)在制茶過程中大約會產(chǎn)生35%的殘次品，一般為大葉、老葉、茶末和梗等。再加上市場對信陽毛尖“一芽一葉”和“嫩芽”2種工藝的追捧，勢必會產(chǎn)生更多的殘次品，原材料浪費嚴重。信陽毛尖中的殘次品品相較差，茶湯苦澀偏黃，諸多加工作坊便以“口糧茶”的名義對外售賣，價格低廉，甚至是成品茶的百分之一，其經(jīng)濟價值較低。由此可見，信陽毛尖殘次品對深加工的需求更為強烈。因此，從信陽毛尖茶殘次品中提取天然活性物質(zhì)便成為回收利用的有效途徑之一。

茶多酚是茶葉中重要的生物活性物質(zhì)和色香味的主要成分，是多酚類物質(zhì)的總稱，其含量占茶葉干質(zhì)量的10%～36%。茶多酚能夠控制自由基的產(chǎn)生、阻斷人體內(nèi)過氧化過程、抑制腫瘤生長，以及降低紫外線對人體皮膚的傷害等。因此，茶多酚被廣泛應(yīng)用于食品、保健、醫(yī)療等領(lǐng)域，發(fā)展前景廣闊。經(jīng)相關(guān)研究，信陽毛尖中茶多酚含量明顯高于六安瓜片和碧螺春等其他綠茶，與普洱生茶基本相同。同時，信陽毛尖不同部位的茶多酚含量也不盡相同，茶多酚含量由高到低為第一葉（22.34%～26.39%）＞芽＞第二葉＞梗（15.07%～16.82%）。

當前已有學者關(guān)注了茶葉殘次品中茶多酚、多糖、總黃酮等活性物質(zhì)的提取。例如，吳金松研究了信陽毛尖茶末中多糖的分離純化以及其抗氧化活性；馮歡歡利用響應(yīng)面優(yōu)化機械化學法來提取茶末的總黃酮；蘭林等重點關(guān)注了竹葉青茶茶末中茶氨酸的提取工藝的優(yōu)化。目前，針對信陽毛尖殘次品中茶多酚的相關(guān)研究還未見報道。

本研究選用信陽毛尖殘次品為原料，利用超聲輔助溶劑萃取技術(shù)來提取茶多酚，并用響應(yīng)曲面法進行優(yōu)化，之后對其清除強氧化性自由基的能力進行了探究。該研究主要聚焦在信陽毛尖殘次品中茶多酚的提取上，同時對信陽毛尖中茶多酚的抗氧化性研究進行了補充。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

信陽毛尖茶殘次品（信陽市羅山縣出產(chǎn)的非市售農(nóng)家茶）；磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、硫酸亞鐵、酒石酸鈉（分析純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；無水乙醇（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）；沒食子酸—水合物（分析純，上海笛柏生物科技有限公司）。

DHG-9240A電熱鼓風干燥箱（上海一恒科學儀器有限公司）；KQ-500DE超聲波清洗器（昆山市舒美超聲儀器有限公司）；BSA124S電子天平（賽多利斯科學儀器有限公司）；TU-1901紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責任公司）；GWB-1SUPER超純水機（北京普析通用儀器有限責任公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 茶葉預處理 信陽市羅山縣出產(chǎn)的非市售信陽毛尖殘次品，其特點是葉大梗大。將茶葉散置于表面皿中，放入烘箱中80℃烘干12 h，去除多余水分，取出烘干的茶葉均勻放入粉碎機中，粉碎至粉末，并過40目篩，以便與溶劑接觸均勻，然后將粉末放入保鮮袋冷藏。

1.2.2 茶多酚的檢測及計算 根據(jù)鄧祥等對酒石酸亞鐵比色法和福林酚比色法進行的對比研究，得出酒石酸亞鐵標準曲線法相比福林酚比色法，具有更寬的線性范圍；同時，酒石酸亞鐵比色法測定茶葉提取物中茶多酚含量具有較高的可信度。因此，本試驗中將使用酒石酸亞鐵比色法進行茶多酚的測定。

離心后立即用移液器取提取后的上清液1 mL并稀釋25倍，吸取稀釋后的茶多酚提取液2 mL注入50 mL容量瓶中，加去離子水8 mL和酒石酸亞鐵溶液10 mL，充分混合均勻，再加pH值為7.5的磷酸緩沖液30 mL至刻度線。用空白溶液作參比，使用10 nm比色皿，在540 nm處測吸光度，根據(jù)標準曲線得出茶多酚提取率。

1.2.3 單因素影響試驗方法 取粉碎好的茶粉1.0 g于50 mL試管中，加入一定量的乙醇水溶液，然后在試管口蓋上保鮮膜，防止乙醇揮發(fā)，混勻后投入到超聲波清洗器中，接著在不同乙醇濃度、超聲時間、料液比的條件下開始進行單因素超聲提取試驗，分別考察其對茶多酚提取率的影響。

1.2.4 響應(yīng)曲面設(shè)計方法 通過3組單因素試驗，以乙醇濃度（A）、超聲時間（B）、料液比（C）為響應(yīng)因子，分別以最高點作為編碼水平0，最高點的左邊作為編碼水平-1，最高點的右邊作為編碼水平1，并且以提取率為響應(yīng)值做響應(yīng)曲面設(shè)計，最后采用Design Expert中的Box-Benhnken中心組合設(shè)計原理來分析處理。

1.2.5 抗氧化性測試方法 取優(yōu)化后提取的茶多酚原溶液1 mL稀釋100倍，并配制相同質(zhì)量分數(shù)濃度的維生素C溶液，再分別取0.5、1、1.5、2、2.5、3 mL稀釋后的溶液加入到6支比色管中，加水稀釋到5 mL，再加入5 mmol·L的水楊酸溶液和5 mmol·L的FeSO溶液各5 mL，混勻后加入5 mL的稀HO，在35℃下水浴反應(yīng)30 min，于510 nm處測其吸光度值記為，用蒸餾水代替水楊酸的吸光度記為，以蒸餾水代替茶多酚稀釋液的吸光度記為。按照下式計算茶多酚對·OH的清除率。

1.3 數(shù)據(jù)分析

試驗均重復3次，采用Origin 8.0軟件進行圖表繪制，采用Design-Expert 8.0.6統(tǒng)計軟件進行響應(yīng)面優(yōu)化分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 乙醇濃度的影響 準確稱取信陽毛尖殘次品粉末1.0 g于50 mL試管中，采用料液比為1∶16 g·mL，超聲時間為30 min，乙醇濃度分別為50%、60%、70%、80%、90%進行試驗。從圖1-A可以看出，在乙醇濃度在50%～70%時，提取率逐步上升；當乙醇濃度為70%時，提取率達到最高值；乙醇濃度為70%～90%時，提取率開始下降。這表明提取率不會隨乙醇的濃度增加而一直增加。原因可能是乙醇濃度不斷增加會使脂溶性雜質(zhì)和色素等雜質(zhì)大量溶解出來，進而影響茶多酚的溶出，使茶多酚提取率降低。因此，選擇乙醇濃度60%、70%、80%為響應(yīng)面優(yōu)化的3個水平。

2.1.2 超聲時間的影響 準確稱取信陽毛尖粉末1.0 g于50 mL試管中，采用料液比為1∶16 g·mL，乙醇濃度為70%，超聲時間分別設(shè)定為30、40、50、60、70 min進行試驗。從圖1-B可以看出，在30～50 min內(nèi)，隨著超聲時間的增加，提取率逐步上升；在50 min時，提取率上升到16.22%，達到最高；超過50 min后，提取率又開始下降。這表明提取率不會隨超聲時間的增加而一直增加。時間較短時，乙醇對信陽毛尖茶粉溶解不夠充分，提取率偏低；但時間過長時，可能會引起超聲波的空化效應(yīng)和熱效應(yīng)，致使局部溫度過高，使得茶多酚氧化或分解，降低提取率。因此，選擇超聲時間40、50、60 min為響應(yīng)面優(yōu)化的3個水平。

2.1.3 液料比的影響 準確稱取信陽毛尖粉末1.0 g于50 mL試管中，采用超聲時間為50 min，乙醇濃度配制成70%，分別把料液比設(shè)定為1∶4、1∶8、1∶12、1∶16、1∶20、1∶24 g·mL進行試驗。從圖1-C可以看出，在料液比為1∶8、1∶12、1∶16 g·mL時，茶多酚的提取率逐步上升，在料液比為1∶16 g·mL時，提取率上升到14.40%，隨后提取率開始下降。這表明茶多酚的提取率不會隨著乙醇體積的增加相應(yīng)增加。乙醇體積較小的原因可能是信陽毛尖茶粉與溶劑接觸不充分，不利于茶多酚的提取；乙醇體積較大時，信陽毛尖茶粉與溶劑充分接觸，但較多的溶劑會吸收一定量的超聲波轉(zhuǎn)化為熱能，這可能會降低了超聲波對細胞壁的破碎能力，導致細胞內(nèi)的茶多酚溶出減少，提取率下降；也有可能是茶多酚分子上的羥基與乙醇形成氫鍵作用，乙醇體積越大氫鍵作用逐漸增強，從而導致茶多酚的提取率降低。因此，選擇超聲時間1∶12、1∶16、1∶20 g·mL為響應(yīng)面優(yōu)化的3個水平。

圖1 3種因素對茶多酚提取含量的影響

2.2 響應(yīng)曲面法的優(yōu)化

2.2.1 試驗結(jié)果分析 根據(jù)單因素試驗的結(jié)果，列出響應(yīng)曲面法設(shè)計因素與水平如表1所示。通過Box-Benhnken中心組合設(shè)計對單因素結(jié)果分析，得到17組試驗，按照上述方法分別進行這17組試驗，并得出茶多酚提取率，結(jié)果見表2。

表1 響應(yīng)曲面法設(shè)計因素與水平

表2 響應(yīng)面實驗設(shè)計方案與結(jié)果

對表2數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合，得到以茶多酚提取率（）為應(yīng)變量，以乙醇濃度（），超聲時間（）和料液比（）這3個單因素為自變量的編碼多元二次回歸方程如下所示，并對該回歸方程進行方差分析。

由表3可知，=31.82，＜0.000 1，表示回歸方程極其顯著，=0.9761表示模型可信度高，模型擬合較好，=0.945 5表示單個變量占引起茶多酚提取率變化的94.55%。失擬項的=2.33，=0.2162（＞0.05），可見失擬項表現(xiàn)為不顯著，這表明未知因素對試驗結(jié)果的影響比較小，該回歸方程模型能夠較為客觀地反映試驗內(nèi)容，可以用于對試驗結(jié)果進行替代分析。

同時由表3回歸模型系數(shù)顯著性檢驗表明，模型一次項極顯著，不顯著；交互項顯著，不顯著，因此在本試驗中對茶多酚提取率的影響因子的大小順序為：乙醇濃度因子作用效果顯著，料液比因子作用效果次之，超聲時間因子作用效果最不顯著，即＞＞。同時，利用Design-Expert 8.0.6統(tǒng)計軟件做出3D曲面圖，結(jié)果如圖2所示。

表3 回歸方程方差分析表

3D響應(yīng)曲面卷曲程度越明顯，則說明2因素間交互作用越明顯，對提取率造成的影響越大，反之亦然。由圖2可知，乙醇濃度（）和料液比（）、超聲時間（）和料液比（）的曲面圖卷曲程度相對明顯，說明乙醇濃度和料液比、超聲時間和料液比兩兩因素間有比較好的交互作用；而乙醇濃度（）和超聲時間（）的響應(yīng)曲面卷曲程度不是很明顯，說明乙醇濃度和超聲時間這2個因素的交互作用對茶多酚的提取最不顯著，這與表3回歸方程方差分析結(jié)果一致。

圖2 交互作用曲面圖

2.2.2 響應(yīng)曲面分析與優(yōu)化 根據(jù)軟件預測得出的最佳條件和提取率即乙醇濃度配制為74.3%、超聲時間設(shè)定為48.2 min、料液比為1∶18.8 g·mL，此時提取率最高為19.47%。

為了驗證這一結(jié)論可靠性，在得到的最優(yōu)條件下重復3次試驗，得到平均提取率為19.34%，理論值比較偏差為0.13%，即模型預測的結(jié)果與實際實驗的情況很符合，說明此模型可行。

2.3 抗氧化性試驗結(jié)果

·OH是氧化性極強的自由基，可以與細胞中的許多分子發(fā)生反應(yīng)，從而引起各種病變，引發(fā)疾病和衰老。由圖3可見，在茶多酚溶液0.5～2.5 mL的投加量范圍內(nèi)，即含量在51.45～308.7 μg范圍內(nèi)，隨著信陽毛尖殘次品中提取的茶多酚溶液投加量的增加，其對·OH清除能力逐漸提升，基本呈線性關(guān)系，展示出非常好的量效對應(yīng)關(guān)系；在投加量達到2.5 mL，其對·OH清除率達到97.3%，當投加量超過2.5 mL時，其對·OH清除能力基本不變，投加量在3 mL時，清除率為97.9%。由此可見，稀釋過后的茶多酚溶液在投加量為2.5 mL時，其清除·OH的能力已達到最優(yōu)，此時茶多酚含量為257.25 μg，根據(jù)清除率擬合曲線=(33.827+13.05)×100%（表示清除率，表示茶多酚溶液投加量，0.5≤≤2.5），得到信陽毛尖殘次品茶多酚對羥基自由基的ID50為1.09 mL，即112.40 μg，維生素C清除羥基自由基的ID50為147.20 μg。由此可見，該型信陽毛尖殘次品中茶多酚相對于維生素C而言，其對·OH清除能力更強。

圖3 茶多酚溶液投加量對·OH清除的影響

3 結(jié)論與討論

（1）使用響應(yīng)曲面法對超聲輔助下信陽毛尖茶殘次品中茶多酚的提取進行優(yōu)化，其在乙醇濃度為74.3%、超聲時間48.2 min、料液比為1∶18.8 g·mL的最佳工藝條件下所提取的茶多酚為19.34%。

（2）該提取率與其他研究得出的信陽毛尖成品茶中茶多酚提取率（36.2%）還有不小的差距。究其原因，本試驗采用的茶葉為信陽毛尖中的殘次品，大葉、老葉和梗比較多，茶多酚含量相對較低，這一結(jié)果也與相關(guān)針對茶葉不同部位茶多酚含量的研究結(jié)果類似。

（3）抗氧化性試驗結(jié)果表明，信陽毛尖殘次品中的茶多酚具有較強的·OH清除能力，可應(yīng)用到食品保健等前述領(lǐng)域，發(fā)展前景廣闊。

（4）當前，對信陽毛尖茶殘次品的深入加工研究和應(yīng)用還是比較少的，使得次等茶葉原材料產(chǎn)生了極大浪費，本試驗采用的工藝流程簡單，設(shè)備易得操作要求較低，為信陽毛尖殘次品的回收利用提供解決問題的路徑。

（5）同時本研究與其他科研人員所做的工作都是在為信陽當?shù)夭璁a(chǎn)業(yè)的發(fā)展找尋其他途徑，關(guān)注茶葉尤其是品級較低、量大的殘次品中各種天然活性營養(yǎng)物質(zhì)的深度加工利用，這對于發(fā)展本地食品、醫(yī)藥、保健等高端產(chǎn)業(yè)工業(yè)都是有非常大的促進作用。