錢麗麗, 冷雪冬, 章采東, 符麗雪, 李殿威, 韓 馳, 左 鋒,3

(黑龍江八一農(nóng)墾大學食品學院1，大慶 163319 ) (國家雜糧工程技術研究中心2，大慶 163319) (黑龍江省農(nóng)產(chǎn)品加工與質(zhì)量安全重點實驗室3，大慶 163319)

稻谷是我國主要的糧食作物之一，儲運過程中易滋生霉菌，從而引起稻谷發(fā)霉、腐爛和變色，直接或間接地導致稻谷的品質(zhì)下降[1]。在儲運期間能夠引起稻谷品質(zhì)劣變的某些霉菌，例如黃曲霉菌等，會導致稻谷結塊，結塊稻谷的出糙率、整精米粒率較低，且不完善粒率明顯增加[2，3]。霉菌侵染稻谷后，會破壞或降低其營養(yǎng)價值和風味，造成細胞毒性、生殖毒性、免疫毒性、遺傳毒性、肝腎毒性以及致癌、致畸、致突變等毒副作用，給人們的身體健康造成隱患[4-6]。為保證稻谷的營養(yǎng)品質(zhì)與質(zhì)量安全，須采取有效措施控制霉菌污染。

天然植物精油是一種來源于植物的天然產(chǎn)物，具有廣譜殺菌、生物降解、安全無毒等優(yōu)點[7]，在糧食儲運中抑制霉變方面具有一定潛力。其物理和化學性質(zhì)不穩(wěn)定在常溫下能揮發(fā)，可通過蒸餾法、超臨界CO2法、冷壓法等進行提取[8]。天然植物精油對多種真菌和細菌具有極佳的抑制作用[9-11]，抑菌活性來源于主要成分的生物活性，或主要成分和次要成分的整體協(xié)同作用[12]，在食品藥品、日化用品和制藥工業(yè)等方面有著廣泛的應用[13]。肉桂精油和丁香精油對許多食品中的霉菌有良好的抑制作用，可延長貨架期[14]；百里香精油具有抗菌作用，可以預防食品在儲運過程中受到霉菌的污染；肉桂精油和丁香精油的組合可以產(chǎn)生一定的協(xié)同抗菌作用，這歸因于一些次要成分增強了丁香酚的活性[15]；肉桂精油、百里香精油和丁香精油具有較好的抑菌作用且可能存在協(xié)同增效作用，是配制復合抑菌精油的良好原料[16，17]。

實驗室前期通過對儲藏稻谷菌相分析，采用傳統(tǒng)培養(yǎng)法分離純化，基于宏基因組學技術獲得霉變稻谷中5種優(yōu)勢菌為A.sydowii、A.candidus、N.oryzae、A.versicolor和P.brocae[18]。在前期研究結果下，研究丁香精油、百里香精油和肉桂精油對霉變稻谷中5種優(yōu)勢霉菌的抑制作用，為植物精油在防控稻谷儲運過程中霉變應用提供參考，為開發(fā)綠色環(huán)保的儲藏運輸防霉劑提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

肉桂精油，百里香精油，丁香精油，吐溫-80，噻唑藍(MTT)，葡萄糖馬鈴薯培養(yǎng)基。供試菌種：A.sydowii、A.candidus、N.oryzae、A.versicolor和P.brocae由黑龍江八一農(nóng)墾大學食品學院微生物實驗室分離鑒定。

1.2 儀器與設備

Quintix 224-1CN電子天平，QP2010PLUS氣質(zhì)聯(lián)用(GC-MS)，LDZM-40KCS-III滅菌鍋。

1.3 方法

1.3.1 孢子懸浮液的準備

對實驗室前期獲得霉變稻谷中5種優(yōu)勢霉菌進行培養(yǎng)。向5種霉菌培養(yǎng)物(A.sydowii、A.candidus、N.oryzae、A.versicolor和P.brocae)中加入10 mL體積分數(shù)0.05%的無菌吐溫-80水溶液。用玻璃棒輕輕刮取培養(yǎng)基上霉菌孢子，4層紗布過濾，移入錐形瓶中。濾液進行充分振蕩，用血細胞計數(shù)器計數(shù)孢子數(shù)，稀釋至濃度為1×106～3×106CFU/mL，備用。

1.3.2 菌落直徑的測定

在Cakir等[19]的方法上稍作修改，采用瓊脂紙片擴散法測量3種植物精油的抗菌活性。向培養(yǎng)皿(d=9 cm)中加入20 mL PDA培養(yǎng)基，直至培養(yǎng)基冷卻凝固，吸取100 μL孢子懸浮液均勻地涂抹于培養(yǎng)基表面。采用無菌操作將濾紙片(d=8 mm)放置于培養(yǎng)基上，輕輕按壓濾紙片，使其與培養(yǎng)基完全接觸。將3 μL單方精油滴加到濾紙片上，每次進行3組平行實驗。所有操作均在無菌條件下進行，并置于27 ℃培養(yǎng)72 h，采用十字交叉法測定抑菌圈直徑，確定平均值。抑菌圈直徑越大，植物精油對5種霉菌菌株的抑制效果越好；相反抑菌圈直徑越小，抑制效果越差。

1.3.3 最低抑菌濃度(MIC)的測定

通過微量稀釋法確定每株霉菌的MIC，根據(jù)熊李波等[20]的方法并稍作修改。通過混料設計的設計方案，將精油按比例混合(肉桂精油∶丁香精油∶百里香精油=1∶0∶0；0∶1∶0；0∶0∶1；0.5∶0.5∶0；0.5∶0∶0.5；0∶0.5∶0.5；0.667∶0.167∶0.167；0.167∶0.667∶0.167；0.167∶0.167∶0.667；0.333∶0.333∶0.333)，3種植物精油分別用0.01% tween-80稀釋至100、50、25、12.5、6.25、3.125 μL/mL備用。向1.5 mL離心管中，加入770 μL 葡萄糖馬鈴薯液體培養(yǎng)基，孢子懸浮液200 μL，精油乳濁液10 μL和20 μL 0.5 mg/mL噻唑藍(MTT)。同時以未添加精油的離心管作空白對照。將混合物渦旋1 min直至充分混合，于28 ℃避光培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)結束后，觀察離心管中MTT溶液的顏色變化。MIC對應實驗組中植物精油對5種霉菌的最低抑菌濃度，置于 28 ℃培養(yǎng)24 h后未產(chǎn)生藍色晶體。每次同時進行3組平行實驗。

表1 混料設計示意表

提高植物精油對5種優(yōu)勢霉菌的抑制效果，通過混料設計方法研究3種植物精油的抑菌作用。混料設計示意如表1所示，對5種優(yōu)勢霉菌建立預測回歸方程。

1.3.4 基于混料設計方法植物精油抑菌研究

研究3種植物精油的一元、二元和三元抑菌作用，采用單純質(zhì)心設計。這些因子表示混合物中3種植物精油比例，范圍從0到1，不限制設計空間。圖1為復合精油在混料設計中的位置。三角形的頂點(1、2、3)表示3種單方精油，3條邊線(4、5、6)的中點為兩種精油的混合物，中心點(7)和3個增強點(8，9、10)表示3種精油的混合物。如表1所示，每株霉菌的實驗設計包含10個評估點和4組內(nèi)部驗證測試(11、12、13、14)。因變量(響應值)為相應復合精油對5種霉菌(A.sydowii、A.candidus、N.oryzae、A.versicolor和P.brocae)的MIC。

圖1 3種植物精油混料設計概述圖

1.3.5 植物精油氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)分析

GC-MS系統(tǒng)為島津GC-MS系統(tǒng)，配有DB-17MS毛細管柱(L=30 m，d=0.25 mm，0.25 μm)和質(zhì)譜儀5973 Network MSD。將植物精油用丙酮稀釋200倍，進樣量為2 μL。柱溫：初始溫度40 ℃，保持5 min，采用3 ℃/min升溫至210 ℃。載氣為氦氣，流速1 mL/min，通過分流模式進樣，分流比為10∶1。采用電子電離方式，電離能量70 eV，離子源溫度250 ℃，接口溫度230 ℃。得到的EI質(zhì)譜與NIST標準質(zhì)譜庫進行比較，分析3種植物精油的化學組成。

1.3.6 統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)分析和響應模型的建立由DX-8 MFC Application 8.0軟件處理，采用SPSS17.0軟件對數(shù)據(jù)進行方差分析，采用Duncan多重比較分析。

2 結果與分析

2.1 3種植物精油成分GC-MS分析

由于植物精油的種類、提取部位、生長期和產(chǎn)地等因素影響，同一植物精油成分略有不同，抑菌效果也不同。通過GC-MS分析3種植物精油化學成分，結果如表2所示。不同植物精油所含的成分組成和含量不同，肉桂精油包含8種成分(面積>1%)，占比97.51%，主要成分為反式肉桂醛(71.59%)和鄰苯二甲酸二乙酯(12.71%)；丁香精油由7種成分組成(面積>1%)，占比97.71%，主要成分為對傘花烴(11.13%)，1-石竹烯(22.95%)，丁子香酚(42.54%)和鄰苯二甲酸二乙酯(13.08%)；百里香精油包含10個成分(面積>1%)，占比97.07%，主要成分為α-蒎烯(15.19%)，對傘花烴(55.73%)和百里香酚(8.2%)。3種植物精油中均檢測到對傘花烴和鄰苯二甲酸二乙酯，肉桂精油和丁香精油均含有丁香酚和鄰苯二甲酸二丁酯，丁香精油和百里香精油均含有丁香酚和石竹烯。植物精油中某種成分，如肉桂精油中的反式肉桂醛，丁香精油中的丁香酚和百里香精油中的百里酚，具有較強的抗菌性能[21]。Li等[22]評估了來自3個物種和7個產(chǎn)地的肉桂精油中的成分，發(fā)現(xiàn)9個樣品的精油中的主要化合物為反式肉桂醛(66.28%～81.97%)，而對傘花烴、丁香酚和其他物質(zhì)含量較低。研究表明，l-石竹烯和丁子香酚是丁香精油的主要成分[23]；百里香精油主要成分為對傘花烴、百里酚和香芹酚，總質(zhì)量分數(shù)從57.3%到62.5%不等[24]。除了這些化合物外，本研究在百里香精油中還發(fā)現(xiàn)了α-蒎烯，與Rasooli等[25]研究的結果一致。

表2 3種植物精油GC-MS分析結果

2.2 單一植物精油對5種優(yōu)勢霉菌抑制作用研究

通過抑菌圈直徑大小對單一植物精油抑菌效果進行評價，判定其對霉變稻谷中5種優(yōu)勢霉菌的抑制作用，如圖2所示。

注：不同字母表示抑菌圈大小差異顯著(P<0.05)。圖2 不同精油對霉菌的抑制效果評價

3種植物精油對A.candidaus，A.versicolor和A.sydowii的抑制作用強弱為肉桂精油>丁香精油>百里香精油(P<0.05)。對N.oryzae的抑制作用強弱為肉桂精油=丁香精油>百里精香油(P<0.05)。對P.brocae的抑制作用強弱丁香精油=百里香精油<肉桂精油(P<0.05)。結果表明植物精油的抑菌作用與其化學成分和霉菌的種類有關，不同種類的植物精油抑制不同霉菌的能力也各不同。謝姊歡等[26]究肉桂、山蒼子、芳樟及丁香4種植物精油及復合精油對草莓致病菌的抑菌效果，由此可知復合植物精油相比于單一植物精油具有較強的抑菌效果并可減少精油用量，所以有必要對復合精油抑菌效果進行研究。

2.3 復合精油抑菌模型的建立及霉菌抑制效果

復合精油對5種優(yōu)勢霉菌菌株的抑制能力進行方差分析，如表3所示。所選模型與數(shù)據(jù)具有很好的擬合性。線性、二次方和特殊立方多項式擬合的模型分別代表1種、2種和3種植物精油復合對5種霉菌菌株的抑制效果。通過方差分析(ANOVA)可知，所獲得的回歸模型具有統(tǒng)計學意義。復合精油對5株霉菌的MIC均以二次方和特殊立方多項式擬合最佳模型，間接證明植物精油間存在協(xié)同增效作用。選擇顯著性最強的多項式建立預測模型，復合植物精油對5株霉菌的MIC值的等高線圖，旨在確定精油的聯(lián)合抑菌作用,即最小化MIC值。

表3 復合精油對不同菌株抑制能力的方差分析

表4 模型的響應系數(shù)及顯著性水平

建立模型的響應系數(shù)及其顯著性水平表，如表4所示。由響應數(shù)據(jù)可知，百里香精油的系數(shù)最大，其次是丁香精油和肉桂精油。因此，本實驗進一步驗證了這3種植物精油抑菌作用的強弱。肉桂精油與其他2種植物精油復合對5種霉菌具有顯著的協(xié)同增效作用(P<0.05)。將丁香精油和百里香精油進行復合，則對A.candidus、N.oryzae、P.brocae和A.sydowii具有顯著協(xié)同作用(P<0.05)，對A.versicolor有顯著的拮抗作用(P<0.05)。對于3種植物精油之間的相互作用，所得系數(shù)顯示對A.sydowii、A.candidus、A.versicolor(P<0.05)3株霉菌具有顯著的協(xié)同抑制作用，而對N.oryzae和P.brocae抑制作用不顯著。3種精油的復合對A.candidus，A.versicolor和A.sydowii的最佳抑制區(qū)位于三角形的中心進一步驗證丁香精油、百里香精油和肉桂精油復合對5種霉菌具有協(xié)同增效作用。

2.4 基于抑菌效果的復合精油優(yōu)化最佳配比研究

根據(jù)響應優(yōu)化分析，復合植物精油抑菌模型對霉變稻谷中5種霉菌菌株A.candidus、N.oryzae、A.versicolor、P.brocae、A.sydowii擬合的MIC分別為0.051、0.046、0.023、0.015、0.034 μL/mL。復合精油對5個霉菌菌株擬合的MIC值均不大于(0.062 5±0.010 0) μL/mL，低于單方精油實驗組濃度，復合抑制值大于90.9%。當肉桂精油、丁香精油和百里香精油的復合比例分別為55.2%∶26.9%∶17.9%時，對5株優(yōu)勢霉菌的抑制作用最佳。

3 結論

肉桂精油、百里香精油和丁香精油復合對抑制霉變稻谷中5種優(yōu)勢霉菌具有協(xié)同抑制作用。觀察抑菌圈直徑大小可知植物精油對5種霉菌菌株的抑制效果，對A.candidaus，A.versicolor和A.sydowii的抑制強弱為肉桂精油>丁香精油>百里香精油；對N.oryzae的抑制強弱為肉桂精油=丁香精油>百里精香油；對P.brocae的抑制強弱為丁香精油=百里香精油<肉桂精油。建立復合精油抑菌模型確定3種植物精油具有協(xié)同作用，通過響應面優(yōu)化分析得到肉桂精油∶丁香精油∶百里香精油的體積比為55.2%∶26.9%∶17.9%時，對霉變稻谷中5種霉菌菌株(P.brocae、A.versicolor、A.sydowii、A.candidus和N.oryzae)的抑制作用最佳，復合抑制值大于90.9%。