趙姝婷， 全志剛， 王 娟， 劉德志， 王一飛 武云嬌， 蘇有韜， 王維浩,2， 曹龍奎,2,3

(黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院1，大慶 163319) (黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)國(guó)家雜糧工程技術(shù)研究中心2，大慶 163319) (黑龍江省天然產(chǎn)物模擬移動(dòng)床色譜分離技術(shù)創(chuàng)新中心3，大慶 163319)

本實(shí)驗(yàn)以綠豆抗性淀粉(MB-RS4)為原料，采用硝酸-亞硒酸鈉法對(duì)MB-RS4進(jìn)行硒化，得到硒化綠豆抗性淀粉[MB-RS4Se(Ⅳ)]，并對(duì)硒化條件進(jìn)行優(yōu)化；通過光學(xué)顯微鏡、偏光十字顯微鏡和掃描電鏡觀察MB-RS4Se(IV)光學(xué)性質(zhì)及表觀形態(tài)，體外測(cè)定抗氧化活性及相關(guān)性分析，為開發(fā)以抗性淀粉為原料的功能性食品提供了參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.2 儀器與設(shè)備

DGA-9080A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，Aldpha1-2LD plus真空冷凍干燥機(jī)，透析袋(Mw:1 000 u)；S-570掃描電子顯微鏡，NP-800TRF型偏光顯微鏡，N-800M光學(xué)顯微鏡，SPECTROstar Nano酶標(biāo)儀，Specord 200紫外分光光度計(jì)。

1.3 方法

1.3.1 綠豆RS4的制備

根據(jù)李蒙娜等[13]的方法并作適當(dāng)修改。將淀粉與檸檬酸按照干基比5∶2混合，加入適量蒸餾水?dāng)嚢杈鶆颍脷溲趸c調(diào)節(jié)混合體系pH至3.5左右，室溫靜置12 h，于40 ℃烘干。取出干燥樣品粉碎過60目篩，取篩下物于150 ℃酯化4 h，反應(yīng)產(chǎn)物用無(wú)水乙醇洗滌3次，37 ℃烘干至含水量為8%，即得MB-RS4。

根據(jù)王麗波等[14]的方法并作適當(dāng)修改。用50 mL體積分?jǐn)?shù)為0.5%的HNO3溶液溶解樣品(1.0 g)，在室溫下攪拌30 min，加入1.0 gNa2SeO3和0.7 gBaCl2，將混合物在66 ℃攪拌反應(yīng)3.5 h。冷卻至室溫滴加1 mol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至7～8。加入0.5 gNa2SO4除去溶液中的雜質(zhì)Ba2+，4 000 r/min離心15 min，取上清液后透析出反應(yīng)產(chǎn)生的無(wú)機(jī)鹽和多余的Na2SeO3、濃縮、醇沉，凍干即得MB-RS4Se(Ⅳ)。

(1)

式中：m1為綠豆RS4Se(Ⅳ)的質(zhì)量/g；m為綠豆RS4的質(zhì)量/g。

根據(jù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)[15]選用分光光度法測(cè)MB-RS4Se(Ⅳ)中硒含量[16]。用移液管分別吸取0.1、0.2、0.4、0.8、1.6 mL的硒標(biāo)準(zhǔn)溶液至25 mL容量瓶，加入2 mL鄰苯二胺(2%)用HCl定容并調(diào)節(jié)pH至2，避光反應(yīng)1 h，最后用5 mL甲苯萃取，在334 nm處測(cè)定有機(jī)相吸光度，測(cè)得硒標(biāo)準(zhǔn)曲線方程y=19.380 21x-0.042 04，線性相關(guān)系數(shù)R2=0.995 7，其中：y為硒含量(mg)，x為吸光度。

5 mg樣品中加入2 mL HNO3，4 ℃放置過夜。將樣品加熱至燒杯中無(wú)橙黃色煙霧生成，冷卻至室溫加入6 mol/L的鹽酸8 mL繼續(xù)加熱至無(wú)白色煙霧生成，轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定方法測(cè)定樣品溶液吸光度，并用式(2)計(jì)算樣品中硒含量。

(2)

式中：ρ為有機(jī)相中硒的質(zhì)量濃度/mg/mL，由標(biāo)準(zhǔn)曲線方程得出；V1為定容后待測(cè)溶液體積(25 mL)；V2為有機(jī)相總體積(5 mL)；V3為萃取前待測(cè)溶液體積(2 mL)；m為MB-RS4Se(Ⅳ)質(zhì)量(5 mg)。

1.3.5 MB-RS4·Se(Ⅳ)工藝條件研究1.3.5.1 MB-RS4·Se(Ⅳ)制備工藝單因素實(shí)驗(yàn)

將樣品溶解于一定體積分?jǐn)?shù)的HNO3(0.1、0.3、0.5、0.7、1%)中，并在室溫下處理30 min，改變樣品與Na2SeO3的物料比(1∶0.6、1∶0.8、1∶1.0、1∶1.2、1∶1.4)，反應(yīng)溫度(40、50、60、70、80 ℃)和反應(yīng)時(shí)間(2、3、4、5、6 h)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

以HNO3(A)、物料比(B)、反應(yīng)溫度(C)、反應(yīng)時(shí)間(D)為自變量，通過Box-Behnken設(shè)計(jì)四因素三水平的響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)，再分別以硒含量和MB-RS4·Se(Ⅳ)得率為響應(yīng)值，考察各因素對(duì)于響應(yīng)值的影響程度，響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素水平見表1。

表1 Box-Behnken響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平

1.3.6 光學(xué)特征及體外抗氧化性分析1.3.6.1 光學(xué)顯微鏡測(cè)定

將樣品溶于30%甘油中，混合均勻后取一滴滴在載玻片上，蓋上蓋玻片無(wú)氣泡后置于光學(xué)顯微鏡下觀察，調(diào)整物鏡倍數(shù)和焦距，直至能清晰看到顆粒形態(tài)和偏光十字即可，保存圖片。

1.3.6.2 掃描電子顯微鏡(SEM)測(cè)定

根據(jù)Asad等[18]的方法并作適當(dāng)修改對(duì)樣品的形貌和微觀結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究。將樣品置于雙面膠帶噴金，于50.0 kV收集圖像。

1.3.6.3 羥基自由基清除能力

羥自由基通常以反應(yīng)Fe2++H2O2=Fe3+OH-+·OH產(chǎn)生[19]。參照Huang等[20]的方法并作適當(dāng)修改，測(cè)定樣品對(duì)羥基自由基清除能力。按式(3)計(jì)算羥基自由基清除率。

(3)

式中：A0為空白對(duì)照在510 nm的吸光度；A1為待測(cè)樣品在510 nm的吸光度。

(4)

式中：A0為空白對(duì)照在330 nm的吸光度；A1為待測(cè)樣品在330 nm的吸光度。

1.3.6.5 ABTS自由基清除能力

ABTS自由基清除能力參照Li等[22]的方法并作適當(dāng)修改。按式(5)計(jì)算ABTS自由基清除率。

(5)

式中：A1為0.2 mL樣品稀釋液+1.2 mLABTS稀釋液；A2為0.2 mL樣品稀釋液+1.2 mL無(wú)水甲醇；A0為0.2 mL無(wú)水甲醇+1.2 mLABTS稀釋液。

1.3.6.6 總抗氧化能力測(cè)定

采用鐵離子還原能力法測(cè)定樣品的總抗氧化能力，參照Huang等[23]的方法并作適當(dāng)修改，每個(gè)樣品平行測(cè)定3次。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

所有實(shí)驗(yàn)均設(shè)置3組平行，數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS Statistics 25和Excel 2020對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析及相關(guān)性分析，采用Design Expert 11進(jìn)行響應(yīng)面分析，以P<0.05表示差異顯著，使用Origin 2019b進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

由圖1知，4 h時(shí)得率達(dá)到最大值23.35%，硒含量為2.04 mg/g。隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，得率降低。結(jié)果表明，合成MB-RS4Se(Ⅳ)與時(shí)間密切相關(guān)，時(shí)間短底物MB-RS4與Na2SeO3反應(yīng)不充分，時(shí)間過長(zhǎng)會(huì)促進(jìn)MB-RS4降解，導(dǎo)致得率降低[25]。

圖1中硝酸體積分?jǐn)?shù)對(duì)產(chǎn)物得率及硒含量的影響較大，硝酸體積分?jǐn)?shù)達(dá)到0.5%，得率及硒含量達(dá)到最大值；但硝酸體積分?jǐn)?shù)超過0.5%，得率及硒含量呈下降趨勢(shì)，是因?yàn)樵谳^高濃度的硝酸存在下(硝酸屬于強(qiáng)酸，可導(dǎo)致降解，不利于硒化反應(yīng))，MB-RS4的羥基被氧化或者斷鏈等因素有關(guān)[26]。因此選擇硝酸體積分?jǐn)?shù)為0.5%。

由圖1知MB-RS4和亞硒酸鈉的質(zhì)量比從1∶0.6到1∶1.4過程中反應(yīng)未飽和，隨反應(yīng)物的增加反應(yīng)趨于正反應(yīng)階段，但當(dāng)質(zhì)量比達(dá)到1∶1后，反應(yīng)底物MB-RS4完全轉(zhuǎn)化，再加入過量的亞硒酸鈉，反應(yīng)則向逆反應(yīng)方向進(jìn)行，產(chǎn)物得率及硒含量則降低。這可能是由于飽和結(jié)合位點(diǎn)引起的非特異性攝取[25]。因此選擇最佳物料比為1∶1。

圖1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.2.1 硒化MB-RS4的Box-Behnken響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表2 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

利用Design-Expert 11軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到二次多項(xiàng)回歸方程：

Se含量=2-0.40A-0.021B-1.57C-1.63D-0.095AB+0.25AC+0.16AD-0.13BC+0.14BD+4.8CD-0.85A2-0.93B2+1.58C2+1.54D2

MB-RS4·Se(Ⅳ)得率=27.30+1.91A-1.37B-1.69C+0.35D-2.19AB+2.85AC-1.25AD-0.61BC+2.49BD+2.57CD-1.55A2-4.35B2-5.08C2-0.71D2

對(duì)回歸方程進(jìn)行方差分析，見表3。其中，F(xiàn)值可用來檢驗(yàn)各變量對(duì)響應(yīng)值影響的顯著性的高低，F(xiàn)值越大，則相應(yīng)變量的顯著程度越高。當(dāng)模型的顯著性檢驗(yàn)概率P<0.05時(shí)，認(rèn)為該模型具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。由表3知，2個(gè)模型的P值均小于0.01，表明模型對(duì)響應(yīng)值有極顯著影響，且失擬相P值均大于0.05(即不顯著)，表明2個(gè)模型都具有高度的擬合度，并且實(shí)驗(yàn)誤差很小，能夠準(zhǔn)確描述各因素與響應(yīng)值之間的關(guān)系，即可以用這2個(gè)模型對(duì)硒化的得率和硒含量進(jìn)行分析和預(yù)判。

表3 響應(yīng)Se含量及MB-RS4Se(IV)得率 擬合回歸方程的方差分析結(jié)果

表3 響應(yīng)Se含量及MB-RS4Se(IV)得率 擬合回歸方程的方差分析結(jié)果

方差來源MB-RS4?Se(IV)得率擬合Se含量擬合F值P值顯著性F值P值顯著性回歸模型73.21<0.000 1??4 028.64<0.000 1??A97.50<0.000 1??1 455.20<0.000 1??B49.88<0.000 1??328.33<0.000 1??C76.22<0.000 1?7.740.014 7?D3.240.093 22 498.86<0.000 1??AB42.44<0.000 1??276 4.96<0.000 1??AC72.17<0.000 1??17 975.45<0.000 1??AD13.910.002 2?790 7.28<0.000 1??BC3.270.091 9508 4.19<0.000 1??BD55.10<0.000 1??5 484.37<0.000 1??CD58.70<0.000 1??173 9.59<0.000 1??A234.39<0.000 1??231 0.74<0.000 1??B2272.02<0.000 1??9 540.82<0.000 1??C2371.37<0.000 1??3.900.068 3D27.230.017 7?634.78<0.000 1??失擬項(xiàng)0.200.982 80.820.640 5R20.986 50.998 9R2Adj0.973 10.999 5信噪比28.287220.951

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的殘差和響應(yīng)面設(shè)計(jì)如圖2a所示，圖2b為不同水平條件MB-RS4·Se(Ⅳ)響應(yīng)值的殘差正態(tài)分布概率圖， 29組響應(yīng)值較為合理地分布于一條直線兩側(cè)，且其方差無(wú)偏差顯示，本實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)值與預(yù)測(cè)值非常接近，表明本實(shí)驗(yàn)所建立的模型成功地加強(qiáng)了4個(gè)變量參數(shù)與響應(yīng)之間的關(guān)系。通過建模擬合，對(duì)內(nèi)部殘差與29組實(shí)驗(yàn)運(yùn)行數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，如圖2c所示，所有數(shù)據(jù)點(diǎn)都位于極值之間，所有杠桿點(diǎn)都小于2，處于樣本空間中心，表明實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭袥]有有效誤差存在，如圖2d所示，相反，由圖2e知，Cook’D的值在確定的范圍內(nèi)，說明29組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)中沒有影響模型的觀察值，通過回歸診斷分析，說明本實(shí)驗(yàn)建立的MB-RS4·Se(Ⅳ)改性工藝模型準(zhǔn)確性較高，可以用于綠豆酯化淀粉的硒化改性制備。

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的殘差和響應(yīng)面設(shè)計(jì)如圖3所示，圖3a為不同水平條件MB-RS4·Se(Ⅳ)響應(yīng)值的殘差正態(tài)分布概率圖， 29組響應(yīng)值較為合理地分布于一條直線兩側(cè)，且其方差無(wú)偏差顯示，本實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)值與預(yù)測(cè)值非常接近，如圖3b所示，表明本實(shí)驗(yàn)所建立的模型成功地加強(qiáng)了4個(gè)變量參數(shù)與響應(yīng)之間的關(guān)系。通過建模擬合，對(duì)內(nèi)部殘差與29組實(shí)驗(yàn)運(yùn)行數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，如圖3c所示，所有數(shù)據(jù)點(diǎn)都位于極值之間，所有杠桿點(diǎn)都小于2，處于樣本空間中心，表明實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭袥]有有效誤差存在，如圖3d所示，相反，由圖3e知，Cook’D的值在確定的范圍內(nèi)，說明29組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)中沒有影響模型的觀察值，通過回歸診斷分析，說明本實(shí)驗(yàn)建立的MB-RS4·Se(Ⅳ)改性工藝模型準(zhǔn)確性較高，可以用于MB-RS4的硒化改性制備。

2.2.5 最優(yōu)條件確定和驗(yàn)證

應(yīng)用響應(yīng)面最優(yōu)分析方法對(duì)回歸模型分析，確定最優(yōu)工藝條件為：HNO3體積分?jǐn)?shù)0.46%，物料比1∶0.98，反應(yīng)溫度66.56 ℃，反應(yīng)時(shí)間3.5 h，Se含量為2.22 mg/g，MB-RS4Se(Ⅳ)得率為26.293 5%。為適應(yīng)實(shí)際生產(chǎn)需求對(duì)工藝參數(shù)優(yōu)化，在HNO3體積分?jǐn)?shù)0.5%，物料比1∶1，反應(yīng)溫度66 ℃，反應(yīng)時(shí)間3.5 h下進(jìn)行反應(yīng)，經(jīng)3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)得到Se含量為2.21 mg/g，MB-RS4Se(Ⅳ)得率為26.450 6%。

2.3 MB-RS4和MB-RS4Se(Ⅳ)光學(xué)特征及抗氧化分析

2.3.1 光學(xué)特征分析

由圖4可知，綠豆淀粉中交替存在結(jié)晶區(qū)和非結(jié)晶區(qū)，偏光十字出現(xiàn)“馬耳他十字”。綠豆淀粉顆粒大部分呈現(xiàn)橢圓形，少數(shù)為球形，表面光滑，有典型的偏光十字[30，31]。通過檸檬酸酯化處理綠豆淀粉后，綠豆淀粉分子鏈在酸熱運(yùn)動(dòng)下，分子中心晃動(dòng)，原子尺寸數(shù)量級(jí)的空穴增多并伴隨著顆粒結(jié)構(gòu)坍塌[29]，通過光學(xué)顯微鏡和掃描電鏡觀察可以發(fā)現(xiàn)MB-RS4出現(xiàn)了不同程度的交聯(lián)、抱團(tuán)現(xiàn)象，形成了形狀不規(guī)則、結(jié)晶結(jié)構(gòu)破壞和偏光十字逐漸消失的MB-RS4。在此基礎(chǔ)上對(duì)MB-RS4進(jìn)行硒化改性得到MB-RS4·Se(Ⅳ)，MB-RS4·Se(Ⅳ)顆粒結(jié)構(gòu)破碎，呈現(xiàn)不規(guī)則的碎片狀態(tài)，偏光十字完全消失，是由于引入Se4+時(shí)MB-RS4斷鏈發(fā)生降解，導(dǎo)致MB-RS4形態(tài)碎片化嚴(yán)重。

圖2 MB-RS4Se(Ⅳ)得率準(zhǔn)確性分析

圖3 MB-RS4Se(Ⅳ)硒含量準(zhǔn)確性分析

注：光學(xué)顯微鏡放大倍數(shù)為目鏡10×；物鏡20×。圖4 MBS (1)、MB-RS4 (2)、MB-RS4Se(Ⅳ)(3) 光學(xué)顯微鏡(a)、偏光十字顯微鏡(b)、掃描電鏡(c)

2.3.2 抗氧化活性及相關(guān)性分析

硒化前后MB-RS4和VC的還原能力如圖5d所示，硒化前的吸光度保持在0.1～0.2，硒化后吸光度隨質(zhì)量濃度升高而增加，當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到10mg/mL時(shí)，吸光度值接近陽(yáng)性對(duì)照VC。說明MB-RS4的還原能力幾乎沒有，硒化后的MB-RS4還原能力大幅度增加。

圖5 MB-RS4、MB-RS4Se(Ⅳ)和VC對(duì) ABTS+·清除能力及總還原能力

表4 MB-RS4、MB-RS4Se(Ⅳ)和VC IC50值及其相關(guān)性

表4 MB-RS4、MB-RS4Se(Ⅳ)和VC IC50值及其相關(guān)性

樣品分類羥自由基/mg/mL超氧陰離子自由基/mg/mLABTS自由基/mg/mLFe2+還原能力(Abs)MB-RS4線性方程Y=39.381x+2.682Y=32.006x+2.063Y=-16.664x+6.887Y=0.095x+0.005R20.9210.9730.8670.854IC50/mg/mL2.441±0.760?8.390±1.290?4.046±1.040?-MB-RS4·Se(Ⅳ)線性方程Y=36.138x+5.347Y=47.141x+1.302Y=-15.492x+6.915Y=0.836x+0.118 6R20.930.9130.8790.893IC50/mg/mL1.621±0.450??1.434±0.190??0.226±0.260??-VC線性方程Y=97.981x+0.021Y=97.511x+0.265Y=-13.619x+6.717Y=2.66x+0.021R20.9160.9140.8680.907IC50/mg/mL0.002±0.0010.024±0.0130.088±0.020-

注：IC50值表示自由基清除率為50%的有效質(zhì)量濃度，*為顯著，**為極顯著。

2.3.3 抗氧化能力表型分析

注：*為P≤0.05，**為P≤0.01。

3 結(jié)論