徐海軍，楊 洋，董雅琪，李天宇，張婭菲,爨淑楠，鄧 輝，郝經(jīng)文，戴 軍

(1.皖西學(xué)院 生物與制藥工程學(xué)院，安徽 六安 237012；2.安徽省中藥資源保護(hù)與持續(xù)利用工程實驗室，安徽 六安 237012)

霍山石斛(俗稱米斛)是安徽省六安市霍山縣道地名貴中藥材[1]，其形如累米，根粗頂細(xì)，每節(jié)僅米粒長短，成熟后長度不超過10 cm。唐開元年間，道家《道藏》曾將霍山石斛、天山雪蓮、三兩人參、百二十年首烏、花甲之茯苓、蓯蓉、深山靈芝、海底珍珠、冬蟲夏草等列為“中華九大仙草”，而霍山石斛名列其首[2]。《神農(nóng)本草經(jīng)》將霍山石斛列為上品仙草[3]。除了作為藥品使用外，霍山石斛也一直作為保健食品原料來使用。2019年9月《霍山石斛莖(人工種植)》安徽省食品安全地方標(biāo)準(zhǔn)正式發(fā)布，使霍山石斛作為食品原料應(yīng)用有了“合法”身份。多糖是霍山石斛的重要藥效成分，具有抗氧化、抗白內(nèi)障、抗肝損傷和肝纖維化、抗疲勞、調(diào)節(jié)免疫力、抗腫瘤、抗糖基化等藥理作用[4-8]。為了確定某制藥廠霍山石斛經(jīng)無水乙醇和水依次提取一次后剩下藥渣中的多糖含量及其組成特點，本項目提取、純化藥渣中的多糖，并用不同濃度乙醇對提取的多糖進(jìn)行分級沉淀，測定了含量最多的40%醇沉多糖及其鹽酸水解物的分子量分布，以便為充分利用寶貴的霍山石斛資源提供實驗依據(jù)。

1 材料

1.1 試劑

霍山石斛藥渣(由某藥廠提供，霍山石斛干莖依次經(jīng)無水乙醇和水提取一次后剩余的藥渣)；葡萄糖(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；豬胰淀粉酶(酶活≥50 U/mg，合肥博美生物科技有限責(zé)任公司)；氯仿、正丁醇、無水乙醇、丙酮、苯酚、濃硫酸、鹽酸、磷酸、氫氧化鈉、硝酸鈉等均為國產(chǎn)分析純試劑。透析袋(MWCO3500 D，北京索萊寶科技有限公司)；DEAE-32纖維素(粒徑50 um，吸附載量180 mg HSA，北京瑞達(dá)恒輝科技發(fā)展有限公司)。

1.2 儀器

DD5臺式大容量低速離心機(湖南赫西儀器裝備有限公司)、數(shù)顯恒溫水浴鍋(HH-4型，常州國華電器有限公司)、電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(DHG-9140 A型，上海一恒科技有限公司)、電子分析天平(FA1204 B型，上海越平科技儀器有限公司)、旋渦混勻器(HYQ-2121A型，蘇州捷美電子有限公司)、冷凍干燥機(FD-1A-50型，北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司)、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(RE-52 AA型，上海亞榮生化儀器廠)、SHB-Ⅲ循環(huán)水多用真空泵(鄭州長城科工貿(mào)有限公司)、紫外可見分光光度計(TU-1901型，北京普析通用儀器有限公司)、pH計(PHS-3C型，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司)、ELEOS System型凝膠滲透色譜儀(美國Wyatt公司)、色譜柱(Shodex OHpak系列 SB-806串803，日本昭和電工株式會社)。

2 方法

2.1 藥渣中霍山石斛總多糖的提取、脫淀粉和脫蛋白

參照余剛等的方法[8]，將霍山石斛藥渣在65 ℃干燥箱中烘6小時，取出冷卻后用萬能粉碎機粉碎，過40目篩。每次稱取20 g藥渣粉末，裝在三角瓶中，按1∶40體積加入800 mL蒸餾水，85 ℃水浴加熱2小時，其間進(jìn)行多次振搖。水浴加熱結(jié)束后取出，冷卻后將水煮液用4層紗布過濾，取濾液。濾渣擠干后重新加1:40體積蒸餾水再水浴加熱2小時。這樣反復(fù)提取3次。合并3次濾液，4000 rpm離心10 min。取上清，80 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至1050 mL。加入4倍體積無水乙醇，使溶液乙醇終濃度為80%，4 ℃冷藏過夜，使多糖充分析出，再用8層紗布過濾(過濾時可用手?jǐn)D壓以加快過濾速度)，濾渣用95%乙醇洗滌2次，揮干。

將揮干的霍山石斛粗多糖用蒸餾水溶解，配成1%濃度。參照李婭等的方法(略加修改)脫淀粉[9]，即在1%霍山石斛粗多糖溶液中加入胰淀粉酶(終濃度為15 IU/mL)，40 ℃水解80 min。水解結(jié)束后沸水浴加熱5 min滅活淀粉酶，冷卻至室溫后，用Sevage法脫蛋白(重復(fù)5次)[8]，再用80%乙醇沉淀，沉淀分別用95%乙醇和丙酮洗2次，揮干后得霍山石斛精制總多糖，稱重，計算多糖提取率。

2.2 霍山石斛多糖乙醇分級沉淀

將上述制備的霍山石斛總多糖用蒸餾水配成1%溶液。參照文獻(xiàn)[10]和[11]方法(略加修改)進(jìn)行乙醇分級沉淀。先加入無水乙醇使多糖溶液的乙醇終濃度為30%，輕搖混勻后4 ℃冷藏過夜，8000 rpm 4 ℃離心10 min，取上清。在上清中加入無水乙醇使多糖溶液的乙醇終濃度為40%，輕搖混勻后4 ℃冷藏過夜，8000 rpm 4℃離心10 min，取沉淀，得40%醇沉霍山石斛多糖，將其切成小塊攤在保鮮膜上20 ℃揮干。同法依次制備50%、60%、70%、80%醇沉霍山石斛多糖。根據(jù)分級沉淀結(jié)果，選取所占比例最高的40%醇沉多糖進(jìn)行進(jìn)一步純化。

2.3 40%醇沉霍山石斛多糖DEAE32層析、透析純化

將40%醇沉霍山石斛多糖配成2%濃度。用DEAE32柱進(jìn)行層析，每次上樣體積為2 mL。用蒸餾水進(jìn)行洗脫。流速為2.5 mL/min。每管收集10 mL洗脫液，用苯酚-硫酸法定性監(jiān)測每管洗脫液中多糖含量，即從每管洗脫液中取100 uL樣品，加入200 uL 5%苯酚，再加入1 mL濃硫酸，肉眼觀察洗脫液顏色變化，如果溶液呈黃色則表明其中含有多糖。對含有多糖的洗脫液收集管，進(jìn)一步用苯酚-硫酸法[12]測定多糖含量(以O(shè)D490值表示)，繪制洗脫曲線。

將含有多糖的洗脫液合并，80 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至有一定黏度后，用截留分子量為3400 Da的透析袋透析。先用自來水流動透析24小時；然后換成蒸餾水靜止透析12小時，再換一次蒸餾水，繼續(xù)透析12小時。透析結(jié)束后，將透析液裝在干凈的培養(yǎng)皿內(nèi)，冷凍后用真空冷凍干燥機凍干。

2.4 40%醇沉霍山石斛多糖中淀粉含量定性鑒定、蛋白含量和多糖含量測定

2.4.1 40%醇沉霍山石斛多糖中淀粉含量定性鑒定

參照李婭等的方法(略作修改)[9]，稱取適量40%醇沉霍山石斛多糖溶于蒸餾水中，配成1 mg/mL濃度的多糖溶液。取50 μL樣品溶液，滴在干凈的培養(yǎng)皿中，再滴入 200 μL碘試劑(含 0.02%碘的0.2%碘化鉀溶液)，觀察顏色變化，用0.1%可溶性淀粉溶液作陽性對照。

2.4.2 40%醇沉霍山石斛多糖中蛋白含量測定

參照喬德亮[13]的方法，稱取100 mg 考馬斯亮藍(lán) G-250，溶于50 mL 95%乙醇，加入 100 mL 85%的磷酸，蒸餾水定容至 1 L，備用。精確配制 0.1 mg/mL 牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別取 0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 的標(biāo)準(zhǔn)液，用蒸餾水補充至 1 mL，加入 5 mL 考馬斯亮藍(lán) G-250，混勻，放置 10 min。595 nm 波長下測吸光度，根據(jù)測定結(jié)果制作標(biāo)準(zhǔn)曲線及回歸方程。

40%醇沉霍山石斛多糖中蛋白質(zhì)含量測定：取3支試管，分別加入1mL 1mg/mL 多糖樣品溶液，再加入 5mL 考馬斯亮藍(lán) G-250，混勻，放置 10 min。595nm 波長下測吸光度。根據(jù)回歸方程計算出蛋白含量，取三管平行測定的平均值。

2.4.3 40%醇沉霍山石斛多糖中多糖含量測定

采用苯酚-硫酸法測定多糖含量[12]。準(zhǔn)確稱取0.1 g烘干至恒重的葡萄糖，用蒸餾水定容至100 mL，得1 mg/mL葡萄糖溶液；用10 mL吸管從中取10 mL，定容至100 mL，得0.1 mg/mL 葡萄糖溶液，分別取 0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 的標(biāo)準(zhǔn)液加到10 mL塑料有蓋離心管中，用蒸餾水補至 1 mL，加入1 mL 5%苯酚溶液，再加入5 mL 濃硫酸，立即蓋上蓋子，渦旋混勻，靜置20 min，在冷水中冷卻，用空白管調(diào)零，490 nm 波長測吸光度。根據(jù)測定結(jié)果制作標(biāo)準(zhǔn)曲線及回歸方程。取3支試管，分別加入1 mL 0.1 mg/mL 多糖樣品溶液，參照上述方法測定多糖含量。根據(jù)回歸方程計算出樣品多糖含量，取三管平行測定的平均值。

2.5 40%醇沉霍山石斛多糖及其水解物分子量測定

參照李凡的方法[14]，將50 mL 40%醇沉霍山石斛多糖溶液(40 mg/mL)加到2 L 0.1 mol/L鹽酸溶液中，調(diào)pH至1.0，多糖終濃度為1 mg/mL，37 ℃水解 1 h 后，用氫氧化鈉調(diào) pH 至中性，透析除鹽后真空冷凍干燥獲得40%醇沉霍山石斛多糖水解物。

將40%醇沉霍山石斛多糖及其水解物樣品分別用超純水配成0.1 mg/mL濃度，用0.22 uL濾膜過濾后上樣檢測。色譜條件：檢測器：激光檢測器(LS)和示差檢測器(DRI)；流動相：水+0.02% NaN3；流速：1 mL/min；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣量：500 uL。

3 結(jié)果

3.1 霍山石斛藥渣中多糖提取率

經(jīng)測定，霍山石斛藥渣多糖的提取率為12%。表明僅經(jīng)無水乙醇和水依次提取1次的霍山石斛藥渣中仍含有較多的多糖。

3.2 霍山石斛多糖分級醇沉結(jié)果

霍山石斛多糖用不同濃度乙醇分級沉淀后得到各組分多糖占總多糖的比例見表1。從表1可見，40%醇沉的多糖所占總多糖的比例最大，達(dá)到51.5%；其次為50%乙醇沉淀的多糖，達(dá)到24.9%。乙醇濃度超過60%后沉淀的多糖所占比例均較小。因此，后續(xù)主要對占比最大的40%醇沉多糖進(jìn)行研究。

3.3 40%醇沉霍山石斛多糖DEAE-32層析時蒸餾水洗脫曲線

1%濃度40%醇沉霍山石斛多糖溶液經(jīng)DEAE-32層析，以蒸餾水為洗脫劑，每管收集洗脫液10 mL，前9管收集液用苯酚-硫酸法監(jiān)測多糖時沒有顏色變化，第10管時出現(xiàn)黃色，然后顏色逐漸變深，第16管時顏色變淺，第17管顏色又變深，第18管后顏色漸漸變淺，第23管時基本無色。獲得的洗脫曲線見圖1。從圖1可見，40%醇沉霍山石斛多糖用DEAE-32層析、蒸餾水洗脫時可出現(xiàn)一個主要的洗脫峰，峰頂略有波折。純化的40%醇沉霍山石斛多糖冷凍干燥后呈疏松潔白海綿狀物(見圖2)。在用蒸餾水洗脫后，換用0.1～1 mol/L NaCl溶液洗脫時，基本未檢測到多糖，說明40%醇沉霍山石斛多糖絕大部分為中性多糖。

表1 霍山石斛多糖分級醇沉結(jié)果

圖1 40%醇沉霍山石斛多糖DEAE-32層析蒸餾水洗脫曲線

圖2 冷凍干燥的40%醇沉霍山石斛多糖樣品

3.4 40%醇沉霍山石斛多糖樣品中淀粉含量定性鑒定結(jié)果

采用碘試劑法定性鑒定40%醇沉霍山石斛多糖中的淀粉含量，結(jié)果表明1%濃度的40%醇沉霍山石斛多糖遇碘試劑后不顯紫紅色，而1%可溶性淀粉溶液(陽性對照)遇碘試劑后呈紫紅色，表明純化的40%醇沉霍山石斛多糖基本不含淀粉(見圖3)。

圖3 40%醇沉霍山石斛多糖樣品中淀粉含量定性鑒定結(jié)果注：圖中A和B分別為陽性對照和樣品。

3.5 40%醇沉霍山石斛多糖中蛋白含量測定結(jié)果

采用考馬斯亮藍(lán)法獲得的蛋白含量測定標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=194.33x+1.6765(R2=0.9944)。根據(jù)回歸方程計算得到40%醇沉霍山石斛多糖樣品中蛋白含量為0.78%。

3.6 40%醇沉霍山石斛多糖中多糖含量測定結(jié)果

采用苯酚-硫酸法測定40%醇沉霍山石斛多糖樣品中多糖含量，獲得的葡萄糖濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=106.66x，R2=0.9998。根據(jù)回歸方程計算得到樣品中多糖含量約為90.61%。

3.7 40%醇沉霍山石斛多糖分子量測量結(jié)果

40%醇沉霍山石斛多糖重均分子量(Mw)為6萬，數(shù)均分子量(Mn)為5.3萬。Mw/Mn=1.136，說明40%醇沉霍山石斛多糖分子大小相對較均一。分子量分布結(jié)果(見表2)表明49%的多糖分子量在4萬～4.8萬，47.2%的多糖分子量在4.8萬～13萬，另有3.8%的多糖分子量在13萬～22萬。說明40%醇沉霍山石斛多糖的分子量總體上相對較小。

表2 40%醇沉霍山石斛多糖分子量分布

40%醇沉霍山石斛多糖水解物重均分子量(Mw)為2.4萬，數(shù)均分子量(Mn)為0.59萬。Mw/Mn=4.1，說明水解物中的多糖分子大小很不均一。40%醇沉霍山石斛多糖水解物分子量分布情況見表3。從表3可知，40%醇沉霍山石斛多糖經(jīng)鹽酸適度水解后，其分子量急劇降低，其63.9%的多糖分子量在0.13萬～0.8萬，30.2%的多糖分子量在0.8萬～7.8萬，分子量超過7.8萬的多糖只有5.9%。

表3 40%醇沉霍山石斛多糖水解物分子量分布

4 討論

霍山石斛中的多糖含量一般為17%～28%左右[6]。本研究發(fā)現(xiàn)霍山石斛藥渣中殘留有較為可觀的多糖，其含量達(dá)到12%。但這些多糖的分子量相對較小，例如所占比例最高的40%醇沉霍山石斛多糖重均分子量(Mw)只有6萬。鄧輝報道霍山石斛多糖中有52.34%的多糖重均分子量小于1萬[15]，21.83%的多糖重均分子量在1萬～5萬，重均分子量在5萬～20萬的多糖占16.38%，重均分子量在20萬～50萬的多糖占6.31%，重均分子量大于50萬的多糖占3.14%。秦丹陽等研究發(fā)現(xiàn)[16]，霍山石斛多糖在1—4月及10—12月主要由兩個組分構(gòu)成，組分1的分子量在9.6萬～53.8萬，組分2的分子量在2.7萬～9.97萬，而在5—9月份(夏季)只存在高分子量的組分1，低分子量的組分2基本消失。郝杰等測得霍山石斛總多糖的重均分子量(Mw)為25.2萬[17]，用40%、50%、60%和80%的乙醇對霍山石斛總多糖分級沉淀，分別獲得重均分子量(Mw)為47.9萬、31.6萬、30.7萬和8.59萬的多糖。李明智等發(fā)現(xiàn)鐵皮石斛純多糖及其分級組分均主要為中性糖[18]，并且純多糖和30%、40%、50%乙醇分級沉淀獲得的多糖分子量分別為26.2萬、31.5萬、24.8萬、20.3萬，50%乙醇沉淀上清中的多糖分子量為13.6萬，且各組分均一性良好。這些研究結(jié)果表明不同濃度乙醇能沉淀多大分子量的多糖似乎沒有特定數(shù)值限定，可能還同時受到多糖分子量大小以外的其他因素(例如多糖的空間結(jié)構(gòu)、極性大小等)的影響。鑒于乙醇分級沉淀在分離不同分子量大小多糖中具有成本低、效率高、便于產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用的優(yōu)勢，仍有必要深入研究完善該技術(shù)在制備高生物活性多糖中的應(yīng)用。

分子量大小是影響多糖藥理活性的重要因素之一[19-22]。因為分子量越大的多糖其分子體積也越大，以致不利于跨膜進(jìn)入生物體內(nèi)，而影響其生物活性的發(fā)揮，相反，多糖的分子量越小則容易與活性位點結(jié)合，但是如果分子量過小又不利于形成聚合結(jié)構(gòu)[23]。研究表明分子量在5萬～20萬的多糖可能具有顯著的抗腫瘤活性[24，25]。因此，本研究中40%醇沉霍山石斛多糖的重均分子量(Mw=6萬)仍在此范圍內(nèi)，理論上依然具有較好的藥理活性。

對于大分子多糖，采取適當(dāng)方法降低其分子量，可以提高其生物活性[26]。江曙等研究表明黃蜀葵莖葉多糖的自由基降解產(chǎn)物可提高免疫活性[27]。江曙等還報道原本無明顯免疫調(diào)節(jié)活性的黃蜀葵莖葉多糖經(jīng)鹽酸適度水解后[28]，可生成有顯著免疫調(diào)節(jié)活性的多糖。李凡報道霍山石斛多糖DHP-2A經(jīng)鹽酸水解后可生成穩(wěn)定的可吸收多糖片段[14]。本研究表明40%醇沉霍山石斛多糖用鹽酸水解后調(diào)pH至中性，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后多糖溶液呈乳白色，并在透析時在透析袋底部析出白色沉淀，而上清保持澄清。推測該白色沉淀為多糖中的蛋白質(zhì)遇鹽酸發(fā)生變性，然后在透析過程中因為溶液中鹽的濃度漸漸降低，導(dǎo)致對變性蛋白顆粒的浮力效應(yīng)喪失而使變性蛋白發(fā)生沉淀。李凡在制備鹽酸水解石斛多糖時[14]，用的是純化的霍山石斛多糖DHP-2A，其中不含有蛋白，所以未發(fā)生蛋白遇強酸變性和透析時析出沉淀的現(xiàn)象。有趣的是，40%醇沉多糖的分子量分布范圍為4萬～22萬，但40%醇沉多糖水解物的分子量分布范圍為0.26萬～64.5萬，后者的最大分子量反而顯著增加。其原因尚不清楚。有可能是部分變性的糖蛋白纏繞在一起使多糖分子量增加。關(guān)于利用鹽酸水解高分子量石斛多糖來提高其生物活性的適宜方法(例如適宜pH值、水解時間、水解溫度等)還需更多的研究。

本研究制備的40%醇沉霍山石斛多糖樣品中含有0.78%的蛋白質(zhì)。這些微量的蛋白質(zhì)可能屬于糖蛋白，在用Sevage法脫蛋白時不易全部被去掉。然而，有研究表明霍山石斛中的糖蛋白對肝癌細(xì)胞的細(xì)胞毒活性強于純的多糖[29]。這似乎提示霍山石斛多糖中保留一部分蛋白質(zhì)對于增強其生物活性是有益的。因此在制備霍山石斛多糖時，不必苛求盡量脫除蛋白。

5 結(jié)論

霍山石斛藥渣中殘留有較高含量(12%)的多糖，但其分子量明顯低于未提取前的霍山石斛?；羯绞幵?0%醇沉多糖占總多糖的比例最高，達(dá)到51.5%，其重均分子量為6萬，尚屬于活性高的多糖分子量范圍。用鹽酸水解后可使大部分40%醇沉霍山石斛多糖分子量急劇降低，但有少量多糖分子量反而明顯增加，具體原因還有待進(jìn)一步研究。本研究結(jié)果為進(jìn)一步開發(fā)利用霍山石斛藥渣中的多糖資源提供了初步實驗依據(jù)。