田 穩(wěn),宗大鵬,方成剛,王成塵,王健敏,向 萍* (.西南林業(yè)大學生態(tài)與環(huán)境學院,環(huán)境污染與食品安全及人體健康云南省創(chuàng)新團隊,云南 昆明 6504；.通?？h農(nóng)村環(huán)境保護能源工作站,云南 通海 6599；.云南省農(nóng)村科技服務(wù)中心,云南 昆明 6500)

2014年全國土壤污染狀況調(diào)查[1]結(jié)果顯示,我國土壤重金屬鎘(Cd)、砷(As)、鉛(Pb)、鉻(Cr)、銅(Cu)、鋅(Zn)、鎳(Ni)的點位超標率分別為7.0%、2.7%、1.5%、1.1%、2.1%、0.9%和4.8%.蔬菜是人類飲食的重要組成部分,種植區(qū)土壤重金屬污染與蔬菜安全和人體健康密切相關(guān)[2].土壤中的重金屬可以通過直接(經(jīng)口攝入、皮膚接觸、呼吸)或間接(食物鏈)途徑威脅人體健康,越來越多的學者從環(huán)境安全與人體健康的角度對其進行研究[3-4].

目前,美國環(huán)保署(USEPA)建立的非致癌和致癌風險評估模型被廣泛應(yīng)用于土壤重金屬的健康風險評價[5].如 Zeng等[6]研究表明我國農(nóng)田土壤污染對成人的非致癌危險不明顯,但對兒童有輕微的非致癌危險;另一研究發(fā)現(xiàn)農(nóng)業(yè)種植區(qū)土壤對兒童的非致癌風險與致癌風險均較明顯[7].然而,前人的研究絕大部分都是基于重金屬總量進行健康風險評價,重金屬進入人體后并非完全被吸收[8-10].因此,基于總量的評價方法可能高估了其健康風險.近年來,基于生物可給性的評價方法受到了廣泛關(guān)注[11].然而生物可給性研究中缺少生物組分,健康風險與健康危害間的關(guān)系仍然有待深入研究.細胞毒性實驗被廣泛應(yīng)用于重金屬對人體的健康危害研究,本文前期利用腸道細胞驗證了礦區(qū)場地土壤健康風險的評估結(jié)果,證實建立基于生物可給性和毒性效應(yīng)的土壤健康風險精細化評估方法將更為準確[12].研究表明,精細化評估后可以在一定程度上克服現(xiàn)有技術(shù)導則計算土壤污染物修復目標值過于嚴格的問題[13-14].蔬菜種植區(qū)土壤重金屬污染特征與場地土壤差別巨大,健康風險的精細化評估以及生物可給態(tài)重金屬對人體胃腸道細胞的毒性效應(yīng)仍然鮮有報道.

本研究以我國西南典型蔬菜種植區(qū)土壤為研究對象,分析土壤重金屬的污染特征和生物可給性;比較基于土壤重金屬總量和生物可給性的人體健康風險評價結(jié)果;借助人體胃黏膜細胞 GES-1研究生物可給態(tài)重金屬對人體的健康危害,驗證其健康風險的準確性,旨在為土壤重金屬健康風險的精細化評估提供參考.

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

研究區(qū)位于云南省玉溪市通?？h(102°30′E～102°52′E,23°55′N～24°14′N)境內(nèi)(圖1).作為云南省20個“一縣一業(yè)”示范縣之一,該縣聚焦蔬菜優(yōu)勢特色產(chǎn)業(yè)發(fā)展,享有國內(nèi)蔬菜之鄉(xiāng)的美譽.研究區(qū)屬中亞熱帶半濕潤高原涼冬季風氣候,年平均氣溫16.2℃,年平均降雨量 903.7mm,海拔 1350～2443m,全年日照時數(shù) 2234.9h,無霜期 272d.土壤類型以赤紅壤和紅壤為主,2021年全縣蔬菜種植面積233.3hm2,產(chǎn)量達153萬t,產(chǎn)值達25.5億元.

圖1 研究區(qū)土壤采樣點分布示意Fig.1 Sampling locations of soils from Tonghai, southwest of China

1.2 樣品的采集與處理

土壤樣品采集于2021年9～10月.根據(jù)研究區(qū)蔬菜種植的實際狀況,共采集了151份種植白菜(21份)、甘藍(22份)、芹菜(27份)、蒜苗(24份)、萵筍(20份)、香菜(11份)和玉米(25份)的表層(0～20cm)土壤樣品.所有土壤樣品均采用“S”型取樣,四分法取混合土樣約 1.5kg于自封袋,在采樣當天運送到實驗室,去除動植物殘體、石礫、地膜等雜質(zhì)后自然風干,研磨,分別過10目、60目和100目尼龍篩備用.

1.3 土壤pH值及重金屬含量的測定

土壤pH值采用電位法(HJ 962-2018),使用pH計測定,水土比為2.5:1.土壤重金屬 Cr、As、Cd、Pb、Cu、Zn和Ni的總含量參照Li等[15]的方法使用X熒光重金屬分析儀(XRF, E-max 500)測定.為保證測定質(zhì)量,分析過程中每個土壤樣品均設(shè)置 3個平行,同時以土壤成分分析標準物質(zhì) GBW07405(GSS-5)進行質(zhì)量控制,標準物質(zhì)測定的回收率在±10%之內(nèi).

1.4 基于土壤重金屬總量的人體健康風險評價

采用美國環(huán)境保護署(USEPA)推薦的人體健康風險模型來評價土壤Cr、As、Cd、Pb、Cu、Zn、Ni的致癌風險和Cr、As、Cd、Pb、Ni的非致癌風險.研究表明,經(jīng)口攝入是土壤重金屬直接暴露對人體健康風險貢獻最大的途徑,因此本研究中僅討論經(jīng)口攝入途徑的致癌和非致癌風險[16].采用公式(1)計算人群經(jīng)口攝入重金屬平均每日攝入量;重金屬對人體的致癌和非致癌風險指數(shù)計算如式(2)～(3).

式中:ADI/ADIi為平均每日攝入量,mg/(kg·d);CR 為綜合致癌健康風險指數(shù);HI為綜合非致癌健康風險指數(shù).公式(1)～(3)中所用參數(shù)的含義及取值見表1.

表1 健康風險評價計算參數(shù)[4,17-18]Table 1 Parameters used in the calculation of the health risk index

當 CR＜10-6,致癌風險不明顯;當 10-6＜CR＜10-4時,可能存在一定的致癌風險;當 CR＞10-4時,存在明顯的致癌風險.HI為人體日攝取總量和參考值的比值,當HI＞1時,認為存在非致癌健康風險;當 HI＜1 時,非致癌健康風險不明顯[17].

1.5 生物可給性的測定

基于《土壤環(huán)境質(zhì)量農(nóng)用地土壤污染風險管控標準(試行)》(GB 15618—2018)[19],結(jié)合健康風險

評價結(jié)果,篩選可能存在健康風險的土壤樣品共19份(S1～S19),使用體外胃腸模擬(SBRC)法測定胃階段生物可給性[11].稱取0.25g過60目尼龍篩的土壤樣品于50mL離心管中,加入模擬胃液至25mL,調(diào)節(jié)溶液pH值為1.5,置于振蕩器中以150r/min的速度在37℃下震蕩1h,期間保持pH值不變,震蕩結(jié)束后以4000r/min的速度離心10min,收集上清液即得到胃相模擬液(以下簡稱胃液).所得胃液通過0.45μm 濾膜后,一部分用電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀(ICP-OES)測定重金屬含量;另一部分用于細胞毒性實驗.每個樣品重復測定 3次,并設(shè)置胃液空白對照.

土壤中重金屬的生物可給性由公式(4)計算[20]:

式中:BA為土壤重金屬的生物可給性;Ci為胃液中重金屬的含量,mg/L;Vi為胃液的體積,L;Cs為土壤中重金屬含量,mg/kg;Ms為土壤稱樣質(zhì)量,kg.

1.6 基于生物可給態(tài)重金屬的人體健康風險評價

生物可給態(tài)重金屬的人體健康風險由公式(2)、(3)、(5)[9]計算得出:

式中:BA為重金屬的生物可給性.

1.7 細胞培養(yǎng)、暴露與及活力測定

人胃黏膜細胞GES-1來自美國模式培養(yǎng)物寄存庫(ATCC),將GES-1接種在含完全培養(yǎng)基(DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基+10%胎牛血清+1%青酶素-鏈霉素)的培養(yǎng)瓶中,在37 ℃、5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng).當細胞增殖至 80%時用胰蛋白酶消化傳代[20].1.5中的胃液過0.22μm滅菌濾膜后,與DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基以1:10的比例配制細胞暴露液.將GES-1細胞以10000個/孔/100μL的密度接種于 96孔板中,待細胞生長 24h后,吸棄孔內(nèi)的培養(yǎng)基,向每孔加入 100μL細胞暴露液繼續(xù)培養(yǎng),24h后用倒置顯微鏡(尼康 TS-100)觀察細胞形態(tài)并拍照.隨后,使用 CCK-8細胞增殖檢測試劑盒測定細胞活力的變化,從而分析生物可給態(tài)重金屬對GES-1細胞的毒性[21].

1.8 數(shù)據(jù)處理

本研究所有數(shù)據(jù)均采用平均值和標準差進行匯總,使用 Microsoft Excel 2010、GraphPad Prism 8.0等軟件對數(shù)據(jù)進行整理、分析.

2 結(jié)果與討論

2.1 土壤重金屬污染特征

如表2所示,研究區(qū)土壤 pH值平均值為7.56(5.54～8.43),其中92%的土壤pH＞7,總體呈堿性,極個別土壤呈弱酸性,沐嬋等[22]研究也表明土壤總體呈堿性(pH=7.57).此外,pH 值變異系數(shù)為6.05%,產(chǎn)生這一變異的原因可能是不同的土地利用和田間管理方式,以及灌溉水質(zhì)鹽堿含量和施肥品種的差異[4].從表2 中可以看出,土壤中 Cr、As、Cd、Pb、Cu、Zn和Ni的平均含量分別為108.04, 13.14, 1.17,32.64, 45.04, 146.08 和 37.30mg/kg,其中,Cr、Cd 和Zn的平均含量超出了云南省土壤背景值[23-24],說明這3種重金屬在研究區(qū)部分土壤中已經(jīng)存在一定程度的積累,而As、Pb、Cu、Ni平均含量則未超出云南省背景值,這與Bai等[25]研究結(jié)果一致.

表2 研究區(qū)土壤pH值及重金屬含量統(tǒng)計特征(n=151)Table 2 Statistics of pH value and the heavy metals’ concentration in soils from study area

與《土壤環(huán)境質(zhì)量農(nóng)用地土壤污染風險管控標準(試行)》(GB 15618—2018)[19]中的風險篩選值 (以下簡稱篩選值)相比,除 Cd的平均含量超過了篩選值外,其他 6種重金屬的平均值均低于篩選值,說明除 Cd外,研究區(qū)土壤 Cr、As、Pb、Cu、Zn和 Ni總體處于清潔水平,董達誠等[26]對云南陸良縣菜地土壤重金屬的研究也得到了類似的結(jié)果.以篩選值為評價標準,在所有的土壤樣品中,Cd的超標率最高,為87.88%;Cr、As、Cu和 Zn的超標率分別為13.80%、1.14%、2.61%和3.07%;Pb和Ni的含量未超出標準.7種重金屬的變異系數(shù) Cd(72.73%)＞Cr(61.60%)＞Cu(50.33%)＞Ni(47.78%)＞Zn(37.23%)＞Pb(37.13%)＞As(32.35%),Cd變異系數(shù)最大,說明研究區(qū)土壤 Cd污染受人類活動影響較大.研究表明,Cd是農(nóng)業(yè)來源的標記金屬,因為其積累主要來源于化肥和農(nóng)藥施用[27].此外,Cd也是南方蔬菜地土壤重金屬污染最嚴重的元素[28].地質(zhì)背景、高強度種植、化肥的施用、地膜覆蓋可能是研究區(qū)土壤 Cd污染的主要原因[29-30].

2.2 土壤重金屬的生物可給性

如圖2所示,各重金屬的生物可給性順序為:Cd(35.31% ± 23.21%) ＞ As(29.44% ± 12.25%) ＞ Zn(8.11% ± 5.46%) ＞ Pb(3.11% ± 1.40%) ＞ Cu(2.20% ±1.25%) ＞ Ni(1.56% ± 0.69%) ＞ Cr(0.71% ± 0.40%).不同重金屬的生物可給性差異較大,平均生物可給性最高的Cd (35.31%)是最低的Cr (0.71%)的約50倍,這一結(jié)果與林承齊等[9]研究結(jié)果相似.此外,對于As(14.12%～53.73%)和Cd(5.87%～85.89%),不同土壤樣品的生物可給性差異也很大,其中,土壤S1和S15中Cd的生物可給性高達69.87%和85.89%,而土壤S18中Cd的生物可給性僅有5.87%.這一結(jié)果說明重金屬進入人體后能被吸收的比例不同,這可能與土壤類型、重金屬的種類、重金屬的賦存形態(tài)、土壤理化性質(zhì)(如土壤pH值、有機碳含量、粘土礦物和金屬氧化物含量)等有關(guān)[31].

圖2 土壤重金屬的生物可給性Fig.2 The bioaccessibility of heavy metals in soils

2.3 基于土壤重金屬總量的健康風險評價

如圖3所示,只考慮單一元素時,Cr、As和 Ni的致癌風險指數(shù)分別 2.96×10-5、3.47×10-5和 1.08×10-5,介于10-4～10-6之間;Cd和Pb的致癌風險指數(shù)小于10-6,說明Cr、As和Ni可能存在致癌風險,而Cd和Pb的致癌風險不明顯.考慮多元素的致癌風險時,重金屬的綜合致癌風險指數(shù)(CR)為7.92×10-5,說明研究區(qū)土壤很可能存在由重金屬引起的綜合致癌風險,與林承奇等[9]研究結(jié)果一致.此外,Cr、As、Pb、Cu、Zn和Ni的非致癌風險和綜合非致癌風險(HI)均遠小于1,說明7種重金屬的非致癌風險和綜合非致癌風險均不明顯,Varol等[16]研究也表明通過攝入途徑在研究區(qū)暴露于土壤重金屬的成人和兒童不存在非致癌健康風險.研究區(qū)土壤樣品重金屬的綜合致癌風險指數(shù)和綜合非致癌風險指數(shù)分布情況見圖4.所有土壤樣品的綜合非致癌風險指數(shù)均小于1;但值得注意的是,有 25.83%的研究區(qū)土壤樣品的綜合致癌風險指數(shù)大于 10-4,說明這些土壤樣品的致癌風險明顯,其健康風險不可忽視.

圖3 研究區(qū)土壤重金屬的健康風險評價Fig.3 Health risk assessment of heavy metals in soils from study areas

圖4 研究區(qū)土壤重金屬綜合致癌和非致癌風險指數(shù)分布Fig.4 Distribution of comprehensive carcinogenic and non-carcinogenic risk indexes of heavy metals in soils

以上結(jié)果表明經(jīng)口攝入研究區(qū)土壤 Cr、As和Ni可能對人群(成人)存在健康風險,Liu等[32]的研究也得到了類似的結(jié)果,研究發(fā)現(xiàn)Cr和Ni對健康風險的貢獻相對較高.研究表明,人體長期暴露于Cr和As會產(chǎn)生毒性作用,導致各種類型的癌癥和畸形[33-34],Ni的暴露可能會導致過敏、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、心血管和腎臟疾病、肺纖維化、肺癌和鼻癌等[35],由這 3種重金屬經(jīng)口攝入造成的成人健康風險應(yīng)該引起關(guān)注.值得注意是,在本研究中,Cd對土壤污染水平貢獻最大,然而對健康風險貢獻并不是最大的,這可能是因為有害重金屬本身性質(zhì)的差異[17,26].

2.4 基于重金屬總量和生物可給性健康風險評價的比較

如表3所示,基于土壤重金屬總量和生物可給性的非致癌風險指數(shù)分別為:Cr(1.00×10-1)、As(7.72×10-2)、Cd(2.84×10-3)、Pb(1.69×10-2)、Ni(4.74×10-3)、Cu(2.98×10-3)、Zn(1.03×10-3) 和Cr(6.00×10-4)、As(2.04×10-2)、Cd(1.25×10-3)、Pb(4.95×10-4)、Ni(7.31×10-5)、Cu(7.42×10-5)、Zn(9.55×10-5).綜合非致癌風險指數(shù)(HI)分別為2.06×10-1和 2.29×10-2.相比之下,基于生物可給性的非致癌風險指數(shù)和綜合非致癌風險指數(shù)均小于基于總量的評價結(jié)果,且它們的綜合非致癌風險指數(shù)均小于 1,說明非致癌風險均不明顯.基于土壤重金屬總量和生物可給性的致癌風險指數(shù)和非致癌風險指數(shù)有類似的趨勢,即基于生物可給性的致癌風險指數(shù)和綜合致癌風險指數(shù)小于基于總量的評價結(jié)果.值得注意的是,基于總量的致癌風險指數(shù)(1.25×10-4)＞10-4,存在明顯的致癌風險,而基于生物可給性的致癌風險指數(shù)(6.92×10-6)為10-4～10-6,可能存在一定的致癌風險.

表3 基于重金屬總量和生物可給性健康風險評價Table 3 Health risk assessment based on total and bioaccessible heavy metals

2.5 基于生物可給性健康風險的細胞毒性驗證

本文前期研究發(fā)現(xiàn),污染場地土壤生物可給態(tài)重金屬對人結(jié)腸上皮細胞Caco-2產(chǎn)生了細胞毒性,建立基于體外胃腸模擬結(jié)合人體腸道細胞(Caco-2)模型的體外方法可以準確評估其健康風險[20,36];基于生物可給性數(shù)據(jù)評定有健康風險的蔬菜并不會對人胃上皮細胞(SGC-7901)產(chǎn)生毒性效應(yīng)[21].細胞形態(tài)及活力的變化可以準確地評估外源污染物對人體造成的健康危害,也是反映重金屬造成細胞毒性的重要指標[37].

為了更加準確的評估生物可給態(tài)重金屬對人體造成的健康風險,本文分析了存在致癌風險土壤的生物可給態(tài)胃相提取液(胃液)對人體胃黏膜細胞(GES-1)產(chǎn)生的毒性效應(yīng).胃液暴露24h后,GES-1細胞的形態(tài)及活力見圖5.本研究中,細胞形態(tài)的變化與細胞活力變化一致,與對照組(CK)相比,19個土壤樣品胃液暴露 GES-1細胞后均造成了毒性效應(yīng),即細胞形態(tài)發(fā)生了明顯的變化,呈現(xiàn)出松散和不規(guī)則的形態(tài),且漂浮和圓形細胞增多,表明細胞發(fā)生了死亡[38],細胞活力也顯著下降(P＜0.05),介于 67.04%～90.38%之間.值得注意的是,土壤 S1和 S15暴露后,GES-1細胞形態(tài)發(fā)生了非常明顯的改變,細胞活力也分別降低到了 67.04%和 69.56%,這與土壤 S1和S15中Cd的生物可給性較高的結(jié)果一致(圖2).然而,雖然土壤S15中Cd生物可給性高于土壤S1,但細胞活力也比土壤S1高,推測各重金屬元素的共同暴露的毒性效應(yīng)可能是重要的原因之一[38].

圖5 不同土壤胃提取液暴露24h后GES-1細胞形態(tài)及活力Fig.5 Alterations of GES-1cell viability and morphology after being exposed to the extracts of soils for 24h

3 結(jié)論

3.1 除Cd外,研究區(qū)土壤Cr、As、Pb、Cu、Zn和Ni的平均含量均低于農(nóng)用地土壤污染風險篩選值(GB 15618-2018),Cr、Cd和Zn的平均含量超出了云南省土壤背景值.Cd、Cr、As、Cu和 Zn在部分區(qū)域(分別占比87.88%、13.80%、1.14%、2.61%和3.07%)高于篩選值,可能存在污染風險.7種元素中,Cd污染受人類活動影響最大.

3.2 土壤中重金屬的生物可給性:Cd(35.31%)＞As(29.44%)＞Zn(8.11%)＞Pb(3.11%)＞Cu(2.20%)＞Ni(1.56%)＞Cr(0.71%).

3.3 基于總量的健康風險評價結(jié)果表明,研究區(qū)Cr、As、Pb、Cu、Zn和Ni的非致癌風險和綜合非致癌風險HI均遠小于1,7種重金屬的非致癌風險不明顯.此外,研究區(qū)可能存在由重金屬引起的致癌風險,Cr、As和 Ni是致癌風險的主要貢獻元素;同時,部分土壤樣品(25.83%)的綜合致癌風險指數(shù) CR大于10-4,其致癌風險不可忽略.

3.4 基于生物可給性的CR和HI均小于基于總量的評價結(jié)果,基于總量的 CR (1.25×10-4)＞10-4,存在明顯的致癌風險,而基于生物可給性的 CR(6.92×10-6)介于10-4～10-6之間,可能存在一定的致癌風險.

3.5 存在致癌風險的土壤胃模擬液對胃黏膜細胞GES-1造成了毒性效應(yīng).即細胞形態(tài)發(fā)生了變化,細胞活力也顯著下降(P＜0.05).其中,土壤S1和S15胃模擬液暴露GES-1后,細胞形態(tài)發(fā)生了明顯的改變,細胞活力也分別降低到了67.04%和69.56%,造成了較明顯的毒性效應(yīng).