牟思洋，王向群，星宗伯，李偉琪，聶凡皓，于雷

（青島農(nóng)業(yè)大學(xué)海都學(xué)院，山東 煙臺(tái) 265200）

動(dòng)物骨骼標(biāo)本是觀察動(dòng)物體基本結(jié)構(gòu)和形態(tài)架構(gòu)最直接、最簡(jiǎn)單的施教工具之一[1-3]，且在使用過程中具有不受時(shí)間和地點(diǎn)局限的優(yōu)點(diǎn)。動(dòng)物骨骼標(biāo)本的制作一般包括剝皮取肉、脫脂、漂白、拼接、保養(yǎng)等環(huán)節(jié)。由于骨骼的骨骼腔和骨松質(zhì)中含有一定的脂肪成分，且脂肪往往存在于骨骼內(nèi)部或腔隙過小的部位。若處理不當(dāng)，脂肪便會(huì)慢慢溢出，使骨骼發(fā)黃、發(fā)黑，影響美觀，進(jìn)而縮短骨骼標(biāo)本的使用壽命。因此，脫脂是骨骼標(biāo)本制作中至關(guān)重要的環(huán)節(jié)[4]。目前，骨骼標(biāo)本制作使用的脫脂試劑多為氫氧化鈉（NaOH）等堿性試劑，盡管脫脂效果佳，但其具有的腐蝕性對(duì)致密程度較低的骨骼破壞性較大[5]。脂肪酶可水解甘油三酯等油性物質(zhì)，可催化酯水解、酯合成、酯交換等有機(jī)反應(yīng)[6-8]，目前主要應(yīng)用于皮革等物品的脫脂[9-10]，但關(guān)于脂肪酶在骨骼標(biāo)本制作中脫脂的應(yīng)用與研究尚未見報(bào)道。本研究選取了脂肪酶、氫氧化鈉、丙酮、氫氧化鉀等4種試劑對(duì)家兔骨骼進(jìn)行脫脂處理，以了解脂肪酶在骨骼標(biāo)本中的脫脂效果，為骨骼標(biāo)本的制作提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

選擇成年健康家兔4只，購自山東省萊陽市某活雞店，平均體重約2.5 kg，取下四肢，分別記為1、2、3、4號(hào)。

1.2 試驗(yàn)儀器

解剖盤、手術(shù)刀、手術(shù)剪、電磁爐、鐵鍋、電子天平等均由青島農(nóng)業(yè)大學(xué)海都學(xué)院基礎(chǔ)獸醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.3 試驗(yàn)試劑

胰蛋白酶（國(guó)藥集團(tuán)）、脂肪酶（北京鴻潤(rùn)寶順生物科技有限公司）、丙酮溶液（青島農(nóng)業(yè)大學(xué)海都學(xué)院基礎(chǔ)獸醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室）、3%過氧化氫溶液成品（山東利爾康醫(yī)療科技股份有限公司）、10%氫氧化鉀溶液（福州飛凈生物科技有限公司）；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 家兔處死

家兔提前禁食1 d，為最大程度降低家兔骨骼損傷采用空氣栓塞法處死。

1.4.2 剝皮去肉

在避免損傷骨骼的基礎(chǔ)上，分離死亡的家兔四肢與軀干。四肢毛皮環(huán)切剝下，剔除大塊肌肉、組織等附著物。家兔骨骼按照不同兔子的前肢、后肢分組浸泡于胰蛋白酶溶液內(nèi)，浸泡1～2 d后取出，清水洗凈、晾干。其中胰蛋白酶溶液按照胰蛋白酶∶蒸餾水=1∶500的比例配制。

1.4.3 脫脂

4只家兔的四肢依次放入飽和脂肪酶、丙酮、3%氫氧化鈉和3%氫氧化鉀溶液中進(jìn)行脫脂。其中飽和脂肪酶置于37℃恒溫箱中以保持酶的活性，其余試劑在室溫下脫脂。記錄在相同時(shí)間內(nèi)4種脫脂劑的脫脂效果。于脫脂后的8、16和24 h觀察并記錄骨骼色澤、潔白度、骨骼松弛度、殘留附著度及骨骼表面油脂浸出等情況。待觀察記錄完畢后將骨骼洗凈，晾干。

1.4.4 漂白

使用3%過氧化氫對(duì)脫脂后的骨骼進(jìn)行漂白，浸泡24 h觀察并記錄骨骼及韌帶完整性、顏色和光澤度。漂白完成后，重復(fù)清洗2～3次，陰干，觀察記錄最終漂白效果。1.4.5保存

在常溫和保持通風(fēng)的條件下，漂白后的骨骼于陰涼干燥處避光保存150 d后觀察期保存效果。

2 結(jié)果與分析

2.1 4種試劑處理家兔骨骼的去肉效果（見圖1）

由圖1可知，胰蛋白酶對(duì)于骨骼上的軟組織處理效果較好，除少部分難以消化的筋外，骨骼表面肌肉、角質(zhì)化物質(zhì)柔軟易去，經(jīng)沖洗后均脫落，骨骼縫隙的細(xì)小肉絲也已去除干凈。晾干后，骨體表面開始有油脂浸出，呈黃白色交替，且骨股頭出現(xiàn)黑色骨髓沉積。

圖1 4種試劑處理家兔骨骼的去肉效果Fig.1 Meat removal effect of four kinds of reagents in treating rabbit bones

2.2 4種試劑處理家兔骨骼的脫脂效果（見表1）

由表1可知，脂肪酶在24 h脫脂后可達(dá)到預(yù)期效果，脫脂充分且骨骼未遭到損傷；丙酮在24 h后未達(dá)到預(yù)期效果，骨骼無損傷但脫脂不充分；3%氫氧化鈉溶液和3%氫氧化鉀溶液在24 h后脫脂達(dá)到預(yù)期效果，脫脂充分但骨骼的硬度和質(zhì)地存在一定損傷。

表1 4種試劑處理家兔骨骼的脫脂效果Tab.1 Degreasing effect of four kinds of reagents on rabbit bones

2.3 4種試劑處理家兔骨骼的漂白效果（見圖2、表2）

圖2 漂白后的家兔骨骼Fig.2 Rabbit bones after bleaching

由圖2、表2可知，從骨體完整度角度考慮，經(jīng)脂肪酶、丙酮脫脂后的骨骼再經(jīng)過氧化氫漂白后，骨體堅(jiān)硬無損傷；氫氧化鈉及氫氧化鉀脫脂后的骨骼經(jīng)漂白后均有不同程度的損傷，如裂隙、硬度下降等。從骨骼顏色角度考慮，經(jīng)脂肪酶脫脂的骨骼顏色發(fā)白，光澤發(fā)亮，附著污物少。綜合整體考慮，使用脂肪酶脫脂的骨骼經(jīng)漂白后的骨體完整度和骨骼顏色最優(yōu)。

表2 家兔骨骼漂白后效果比較Tab.2 Comparison of effects of rabbit bones after bleaching

2.4 4種試劑處理家兔骨骼的保存效果（見表3）

由表3可知，由于前期脫脂時(shí)經(jīng)過間較短，仍存在部分油脂滲出情況，但脂肪酶在油脂滲出最少的情況下仍保持著骨質(zhì)完整度高、骨質(zhì)好、骨骼較白的效果。丙酮雖然達(dá)到脫脂目的但完成度不及脂肪酶，且整體泛黃。氫氧化鈉和氫氧化鉀不僅油脂滲出和脂肪殘留較上述兩種試劑多，而且腐蝕痕跡嚴(yán)重。

表3 4種試劑處理家兔骨骼的保存效果Tab.3 Preservation effect of four kinds of reagents in treating rabbit bones

3 討論

3.1 試驗(yàn)動(dòng)物的選取

制作骨骼標(biāo)本前，應(yīng)注意家兔的年齡和體型。家兔年齡過小、過大或體型瘦弱、發(fā)育不良，制作的骨骼易出現(xiàn)形態(tài)結(jié)構(gòu)不明顯或骨質(zhì)脆弱的現(xiàn)象，進(jìn)而導(dǎo)致骨骼標(biāo)本最后價(jià)值受到影響[5]。而家兔體型過于肥胖或年齡過大，附著在骨骼上的脂肪多于正常體型的家兔，將延長(zhǎng)骨骼脫脂的時(shí)間，加大試劑使用劑量，還提高了脫脂不到位的風(fēng)險(xiǎn)。

3.2 腐蝕去肉的方法

骨骼標(biāo)本制作方法中，傳統(tǒng)的蟲噬法、土埋法等制作周期過長(zhǎng)且污物殘留較難清洗干凈[11]，化學(xué)試劑腐蝕法多選用氫氧化鈉溶液。氫氧化鈉溶液雖然可以很大程度地軟化水解蛋白質(zhì)，但經(jīng)過人工剔除的骨骼大部分骨體裸露，氫氧化鈉對(duì)骨骼具有一定的直接腐蝕作用。

本研究中使用胰蛋白酶進(jìn)行腐蝕去肉，胰蛋白酶可催化水解堿性氨基酸所形成的肽鍵，有效去除骨骼附著肌肉及殘留物[12]。與傳統(tǒng)的蟲噬法以及氫氧化鈉浸泡法相比，蛋白酶不會(huì)對(duì)骨骼本身產(chǎn)生不可逆的影響，可最大限度地保留骨骼的完整性，避免了對(duì)骨骼的傷害且縮短了制作周期。胰蛋白酶對(duì)人的傷害性低[13]，對(duì)環(huán)境無污染，無需擔(dān)心廢液排入下水道造成污染的問題。

3.3 不同脫脂劑的本身特性及脫脂效果

不同脫脂試劑的選擇均以最大程度析出骨體內(nèi)的油脂成分，且盡可能不損傷骨骼本身為標(biāo)準(zhǔn)。吳坤成等[14]的研究表明，工業(yè)環(huán)己酮、工業(yè)乙酸乙酯、工業(yè)丙酮、天那水等試劑具備較好的脫脂效果，但均存在易燃、刺激性強(qiáng)等問題，且工業(yè)環(huán)己酮為3類致癌物，存在致癌的風(fēng)險(xiǎn)。

本研究選用4種脫脂試劑：脂肪酶、丙酮、氫氧化鈉、氫氧化鉀，在不同的時(shí)間段觀察其對(duì)骨骼的影響，作用效果也不同。有機(jī)溶劑丙酮是一種易溶于水且溶解度高的試劑，制作時(shí)利用丙酮對(duì)脂肪萃取的作用可實(shí)現(xiàn)分離骨組織與脂肪的目的[15]。由于丙酮對(duì)骨骼自身無影響，經(jīng)浸泡脫脂后的骨骼完整性、硬度均無較大變化，油脂析出量符合脫脂標(biāo)準(zhǔn)，但丙酮存在刺激性強(qiáng)、氣味重的缺點(diǎn)。

氫氧化鈉與氫氧化鉀屬于強(qiáng)堿類物質(zhì)，可與甘油三酯等油脂類物質(zhì)發(fā)生皂化反應(yīng)，使油脂水解脫出，但易腐蝕骨骼，損傷其完整性。經(jīng)浸泡脫脂后雖油脂析出量符合標(biāo)準(zhǔn)，但骨骼本身完整度與硬度明顯下降。

脂肪酶是一種羥基酯水解酶類物質(zhì)，脂肪酶所具有油-水界面的親和力，能夠在油-水界面上高速率地催化水解不溶于水的脂類物質(zhì)。本研究表明，脂肪酶具有與丙酮脫脂相似的優(yōu)點(diǎn)，即浸泡脫脂后的骨骼完整性、硬度均無較大變化，同時(shí)脂肪酶還具備丙酮不具備的安全綠色的優(yōu)點(diǎn)。近年來，也有研究表明，十二烷基苯磺酸鈉（C18H29NaO3S，簡(jiǎn)稱LAS）對(duì)犬骨骼的脫脂效果良好[4]，是一種高效、低毒環(huán)保的優(yōu)質(zhì)脫脂劑。但與本研究使用的脂肪酶相比，LAS對(duì)皮膚具有一定的刺激性[16]。

3.4 脫脂試劑安全性分析

本研究中選用的丙酮屬于有毒且易燃的危險(xiǎn)品。在漂白過程中，選擇過氧化氫作為漂白劑時(shí)，若清洗不到位，殘留的漂白劑極易與丙酮發(fā)生爆炸反應(yīng)。氫氧化鈉、氫氧化鉀均屬于強(qiáng)堿類物質(zhì)，具有強(qiáng)腐蝕性，易對(duì)骨骼產(chǎn)生不同程度的影響。因此，堿性試劑的使用的濃度和浸泡時(shí)間均要求嚴(yán)格控制。本研究中選用的脂肪酶兼具脫脂效果較好、實(shí)惠易得、安全系數(shù)高等優(yōu)點(diǎn)。

3.5 環(huán)境等外界因素對(duì)結(jié)果的影響

本試驗(yàn)時(shí)間為冬季，導(dǎo)致溶劑作用時(shí)間變緩，且制作溶液時(shí)較為不便。此外，溶液的作用效果也受到光照、空氣流通等因素的影響。丙酮等試劑極易揮發(fā)，影響試驗(yàn)效果。脂肪酶的脫脂程度也會(huì)受到溫度的影響，在不適的溫度下無法最大程度上發(fā)揮脂肪酶的脫脂效果。因此，在使用脫脂酶的過程中應(yīng)注意環(huán)境的溫度，避免由此導(dǎo)致脫脂的效果不佳。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)結(jié)果表明，脂肪酶脫脂的骨骼經(jīng)漂白后在骨骼硬度、完整度、潔白度等方面均優(yōu)于其他脫脂試劑。此外，脂肪酶還具有安全穩(wěn)定、無污染等特點(diǎn)，是一種安全性、實(shí)用性、經(jīng)濟(jì)性俱佳的骨骼脫脂劑。