王 瑞，王 宇，王一丞，段欣欣，雷 鵬，李 莎，谷益安，孫 良，羅正山，續(xù)曉琪，吳文錦，徐 虹,*

（1.南京工業(yè)大學(xué)食品與輕工學(xué)院，材料化學(xué)工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 211816；2.湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工與核農(nóng)技術(shù)研究所，湖北 武漢 430064）

淡水魚營(yíng)養(yǎng)豐富，附加值高，但因微生物、內(nèi)源酶以及化學(xué)作用極易腐敗變質(zhì)，極大限制了產(chǎn)品的銷售范圍，同時(shí)易引起食品安全重大隱患。近年來(lái)，具有抗菌功能的新型包裝材料引起廣泛關(guān)注?？咕b材料的制備方法主要分為兩種，一種是基于抗菌高分子材料如殼聚糖，對(duì)其進(jìn)行改性成膜；另外一種是在傳統(tǒng)包裝材料成膜過程中添加抗菌劑如納米銀、鋅離子。以上方法一定程度上促進(jìn)了抗菌包裝材料的發(fā)展，但仍然存在膜材料力學(xué)性能不穩(wěn)定、抗菌劑逸出等問題，產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程緩慢。

基于現(xiàn)有包裝材料，對(duì)其表面進(jìn)行抗菌功能化修飾是解決以上問題的有效途徑。目前市售保鮮膜主要成分為聚乙烯（polyethylene，PE）、聚氯乙烯（polyvinylchloride，PVC）、聚丙烯（polypropylene，PP）等，材料表面均表現(xiàn)為高疏水特性，導(dǎo)致表面容易黏附細(xì)菌并形成生物膜，進(jìn)而引發(fā)細(xì)菌感染和食品腐敗。因此，開發(fā)簡(jiǎn)單高效的膜表面抗菌涂層技術(shù)，賦予保鮮膜表面優(yōu)異的抗菌性能，不僅具有重要的科學(xué)意義，而且具有巨大的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

-聚賴氨酸（-polylysine，-PL）是一種含有25～30 個(gè)賴氨酸殘基的新型綠色食品防腐劑，具有廣譜抗菌活性和良好的生物安全性，于2014年經(jīng)衛(wèi)生健康委員會(huì)批準(zhǔn)作為新型食品防腐劑。-PL主要通過破壞細(xì)菌的細(xì)胞膜，從而破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，-PL進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)使DNA受損，從而使細(xì)胞死亡，對(duì)食源性細(xì)菌如大腸桿菌、金黃色葡萄球菌具有較高的抗菌活性。目前我國(guó)已經(jīng)批準(zhǔn)-PL作為食品防腐劑應(yīng)用于焙烤制品、熟肉制品以及果蔬汁生產(chǎn)中。最重要的是，與其他殺菌劑相比，-PL對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞沒有任何副作用。然而，-PL為高親水性聚合物分子，在酸性和中性條件下通過-氨基的質(zhì)子化以聚陽(yáng)離子形式存在，無(wú)法與疏水保鮮膜表面穩(wěn)定附著，難以發(fā)揮抗菌功效，嚴(yán)重限制了其應(yīng)用。

本研究以市售PE保鮮膜為基材，-PL和陰離子表面活性劑雙(2-乙己基)磺基丁二酸鈉（sodium bis(2-ethylhexyl)sulfosuccinate，AOT）為原料，采用一步靜電組裝技術(shù)，制備-PL-AOT復(fù)合物，該復(fù)合物不溶于水，可溶于乙醇，進(jìn)而在保鮮膜表面形成穩(wěn)定抗菌涂層（圖1）。通過對(duì)復(fù)合物分子結(jié)構(gòu)及涂層理化性能進(jìn)行表征，評(píng)價(jià)其穩(wěn)定性；進(jìn)一步以草魚魚片為研究對(duì)象，研究抗菌涂層對(duì)其實(shí)際保鮮效果，旨在為保鮮膜表面抗菌涂層在淡水魚保鮮應(yīng)用提供理論依據(jù)和技術(shù)參考。

圖1 ε-PL-AOT抗菌涂層及抑菌機(jī)理示意圖Fig. 1 Schematic diagram of the preparation of ε-PL-AOT antibacterial film

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

活體草魚購(gòu)于南京水產(chǎn)批發(fā)市場(chǎng)。

菌株：金黃色葡萄球菌（ATCC 6538）、大腸桿菌（ATCC 25922）由南京工業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)微生物實(shí)驗(yàn)室提供。

LB培養(yǎng)基：將10 g胰蛋白胨、5 g酵母粉、10 g NaCl、1 000 mL蒸餾水混合均勻，于121 ℃滅菌15 min，得到LB液體培養(yǎng)基，備用；LB固體培養(yǎng)基在LB液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加入培養(yǎng)基質(zhì)量1.5%的瓊脂。

-PL（食品級(jí)，純度＞99%） 南京軒凱生物科技有限公司；AOT 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；乙醇天津市富宇精細(xì)化工有限公司；蒸餾水 湖南科爾頓水務(wù)有限公司；鹽酸 揚(yáng)州滬寶化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

85-1型磁力攪拌器 金壇區(qū)白塔新寶儀器廠；XFP01-B型注射泵 蘇州訊飛科學(xué)儀器有限公司；FD-1A-50型真空冷凍干燥機(jī) 德國(guó)Marin Christ公司；TGL-16型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) 四川蜀科儀器有限公司；SK6210HP型超聲波清洗器 上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司；LRH-150型生化培養(yǎng)箱 上海一恒科技有限公司；SW-CJ-2FD雙人超凈工作臺(tái) 蘇州凈化設(shè)備有限公司；AV 400型核磁共振波譜（nuclear magnetic resonance，NMR）儀 德國(guó)布魯克公司；Nicolet iS5型傅里葉變換紅外光譜儀 美國(guó)賽默飛世爾科技公司；ESCALAB MKII型X-射線光電子能譜（X-ray photoelectron spectroscopy，XPS）儀 英國(guó)VG公司；HLD數(shù)顯拉力計(jì) 樂清市艾德堡儀器有限公司；DSA100接觸角測(cè)試儀 德國(guó)克呂士公司；CH-1-S千分手式薄膜測(cè)厚儀 上海六菱儀器廠。

1.3 方法

1.3.1-PL-AOT復(fù)合物的合成與結(jié)構(gòu)表征

將-PL溶于pH 2的鹽酸溶液中至-PL完全溶解，質(zhì)量濃度為1.5 g/100 mL；同時(shí)將AOT溶于體積分?jǐn)?shù)40%的乙醇溶液中至AOT完全溶解，質(zhì)量濃度為3 g/100 mL。隨后，將AOT的乙醇溶液滴加至-PL溶液中，并攪拌反應(yīng)，反應(yīng)30 min，離心（10 000 r/min、15 min）并用超純水洗3 次，冷凍干燥12 h得到-PL-AOT復(fù)合物。利用H NMR對(duì)其分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒定，D-二甲基亞砜（(CD)SO）作為溶劑。

1.3.2 保鮮膜表面抗菌涂層構(gòu)建

以普通市售保鮮膜為基材（PE保鮮膜，5 cm×5 cm），先在體積分?jǐn)?shù)75%乙醇溶液中超聲清洗20 min，再用超純水洗10 min，室溫干燥備用。將-PL-AOT復(fù)合物溶解在無(wú)水乙醇中，得到2%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同）的-PL-AOT乙醇溶液，將該溶液噴涂于備用的PE保鮮膜表面，隨后取出常溫風(fēng)干，乙醇揮發(fā)后即形成-PL-AOT復(fù)合物抗菌涂層（樣品記為PE/-PL-AOT）。同時(shí)，將2%的-PL乙醇溶液及AOT乙醇溶液分別噴涂到PE保鮮膜上，以其及PE保鮮膜作為對(duì)照樣（樣品分別記為PE/-PL、PE/AOT、PE）。

1.3.3 抗菌涂層的表征分析

采用傅里葉變換紅外光譜儀測(cè)定涂層成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)，掃描范圍為400～4 000 cm；利用XPS儀對(duì)涂層表面元素組成進(jìn)行分析，檢測(cè)條件為：40 kV、50 mA、CuKα輻射、步寬0.02°、掃描范圍4°～70°；采用接觸角測(cè)試儀對(duì)涂層表面靜態(tài)水接觸角進(jìn)行測(cè)定，設(shè)置滴加去離子水液體的體積為2 μL，通過CCD軟件記錄液滴形狀，并獲取所測(cè)得的接觸角；將膜進(jìn)行裁剪成長(zhǎng)方形（4 mm×25 mm），剪裁后用薄膜測(cè)厚儀測(cè)定裁好的膜中間處3 點(diǎn)的膜厚，取平均值即為膜厚；采用數(shù)顯拉力計(jì)進(jìn)行膜拉伸實(shí)驗(yàn)，拉伸速度為50 mm/min，觀察實(shí)驗(yàn)曲線并記錄實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，在室溫下測(cè)定本系列樣品膜的斷裂伸長(zhǎng)率、拉伸強(qiáng)度，平行樣共3 個(gè)，結(jié)果取平均值。

1.3.4 涂層表面抗菌性能實(shí)驗(yàn)

菌液制備：將大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的單菌落接種至LB液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)12 h得到細(xì)菌菌液，離心（3 000 r/min、10 min）去除上清液，用滅菌好的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）（0.01 mol/L、pH 7.2～7.4，下同）懸浮細(xì)菌濃度至1×10CFU/mL，隨后再用LB液體培養(yǎng)基將細(xì)胞稀釋到1×10CFU/mL。

抗菌定量實(shí)驗(yàn)：采用JIS Z 2801標(biāo)準(zhǔn)對(duì)樣品中的活菌數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。首先制備2 種保鮮膜基材（PE和PE/-PLAOT，5 cm×5 cm），并分別置于6 孔板中，在膜樣品表面中心區(qū)域，滴加20 μL上述細(xì)菌懸浮液，用PE保鮮膜和PE/-PL-AOT抗菌膜覆蓋，使得菌液均勻鋪展開。將帶有不同樣品的孔在37 ℃條件下孵化24 h，隨后將樣品取出，加入3 mL無(wú)菌PBS超聲2 min，使得黏附于樣品膜表面的細(xì)菌脫落，然后將其按照一定的倍數(shù)稀釋后，涂布平板。37 ℃過夜培養(yǎng)后，對(duì)表面形成的細(xì)菌菌落進(jìn)行計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)。

1.3.5 淡水魚肉保鮮效果評(píng)價(jià)

取新鮮活體草魚，敲擊致暈，宰殺后去頭、去內(nèi)臟，取魚體兩側(cè)魚片。用預(yù)冷的無(wú)菌蒸餾水清洗后瀝干其體表水分，將魚背部白肉切成約4 cm×3 cm×1.5 cm魚塊。將其平均分成3 組，分別用PE保鮮膜和PE/-PL-AOT抗菌膜包裹，將處理后的樣品在37 ℃恒溫箱中放置24 h后，參考GB 4789.2—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測(cè)定》中的平板涂布法對(duì)魚肉表面的菌落總數(shù)進(jìn)行測(cè)定。

1.4 數(shù)據(jù)處理和分析

實(shí)驗(yàn)均平行測(cè)定3 次，采用SPSS Statistic 17.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，＜0.05表示差異顯著，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用Origin 8.0軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 ε-PL-AOT復(fù)合物核磁氫譜結(jié)果

-PL與AOT兩者通過靜電相互作用及疏水相互作用可快速形成白色沉淀，該-PL-AOT復(fù)合物可溶解在乙醇溶液中，而不溶于水中。由圖2可知，在8.024處的峰是連接在氨基C上的質(zhì)子峰（D，—C—NH）。在2.936處的峰則是連接C和N的亞甲基上的質(zhì)子峰（B，C—CH—N）。另外，在0.858處的尖形分裂峰分別對(duì)應(yīng)著AOT主鏈上甲基質(zhì)子和支碳鏈上的甲基質(zhì)子（H，C—CH）。各質(zhì)子數(shù)目基本與預(yù)測(cè)結(jié)構(gòu)符合，此外，通過各質(zhì)子峰的面積之比，如AOT主鏈碳次甲基質(zhì)子峰面積（2.301）約為-PL伯胺質(zhì)子峰面積（1.000）的2 倍，可以看出-PL-AOT復(fù)合物是等物質(zhì)的量反應(yīng)形成的。

圖2 ε-PL-AOT的1H NMR圖譜Fig. 2 1H NMR spectrum of ε-PL-AOT

2.2 ε-PL-AOT涂層功能化抗菌保鮮膜

-PL-AOT為水不溶性復(fù)合物，因此利用乙醇溶解后噴涂于PE保鮮膜表面，隨后常溫風(fēng)干，乙醇揮發(fā)后在保鮮膜表面形成復(fù)合物涂層。如圖3所示，-PL-AOT涂層處理的保鮮膜表面出現(xiàn)白色沉積物，但不影響保鮮膜本身的透明度，透光性較好。

圖3 抗菌膜的實(shí)體圖Fig. 3 Photograph of antibacterial film

2.3 ε-PL-AOT涂層紅外光譜結(jié)果

為了驗(yàn)證-PL-AOT在保鮮膜表面形成了穩(wěn)定涂層，采用紅外光譜對(duì)其表面分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征。AOT磺酸根（—SO

）基團(tuán)中S＝O鍵的對(duì)稱伸縮振動(dòng)峰在1 051 cm左右，不對(duì)稱伸縮振動(dòng)峰在1 300～1 100 cm左右。如圖4所示，PE/-PL-AOT樣品在1 046 cm處出現(xiàn)特征峰，為AOT中S＝O鍵的對(duì)稱伸縮振動(dòng)，說明磺酸根與-PL氨根離子之間的電荷作用會(huì)使S＝O鍵的對(duì)稱伸縮振動(dòng)峰發(fā)生藍(lán)移，該結(jié)果證實(shí)-PL-AOT在保鮮膜表面形成了穩(wěn)定的涂層。

圖4 ε-PL-AOT復(fù)合物及其對(duì)照樣品涂層紅外光譜Fig. 4 Infrared spectra of ε-PL-AOT coating and control samples

2.4 ε-PL-AOT涂層元素分析結(jié)果

如表1所示，與PE保鮮膜相比，-PL-AOT涂層處理的保鮮膜表面N和S元素所占百分比明顯增加，-PL-AOT復(fù)合物通過與PE之間的疏水作用力在保鮮膜表面形成穩(wěn)定涂層，因此結(jié)構(gòu)中含有大量的N和S，證實(shí)PE膜表面-PL-AOT涂層的構(gòu)建成功。PE保鮮膜、PE/-PL和PE/AOT表面以C元素為主，這是因?yàn)镻E保鮮膜為聚乙烯組成，主要元素組成為C元素，-PL和AOT為水溶性，無(wú)法在保鮮膜表面形成穩(wěn)定涂層。PE/-PL-AOT及其對(duì)照涂層表面元素組成的XPS譜如圖5所示。

表1 ε-PL-AOT及其對(duì)照組涂層的元素相對(duì)含量Table 1 Element contents of ε-PL-AOT coating and control samples

圖5 PE/ε-PL-AOT及其對(duì)照樣品的XPS譜圖Fig. 5 XPS spectra and high resolution XPS N 1s and S 2p spectra of ε-PL-AOT coating and control samples

2.5 ε-PL-AOT涂層表面親水性

涂層表面的親水性是判斷-PL-AOT涂層成功的另外一個(gè)關(guān)鍵指標(biāo)。如圖6所示，因PE保鮮膜本身為疏水材料，表面接觸角為113.7°，PE/AOT和PE/-PL的接觸角與PE保鮮膜無(wú)明顯差異，證明涂層在水洗過程被洗掉，無(wú)法與膜表面穩(wěn)定結(jié)合。而-PL-AOT涂層接觸角降至39.91°，親水性明顯增加，主要原因在于-PL-AOT通過疏水作用力與PE疏水表面相互作用形成穩(wěn)定涂層，AOT的疏水烷烴鏈與PE分子形成穩(wěn)定鍵合，-PL親水分子暴露在涂層上端，表現(xiàn)出高度的親水性。

圖6 ε-PL-AOT涂層及其對(duì)照樣接觸角測(cè)試Fig. 6 Contact angle of ε-PL-AOT coating and control samples

2.6 ε-PL-AOT涂層抗菌保鮮膜的力學(xué)性能分析結(jié)果

如表2所示，加入-PL-AOT對(duì)抗菌保鮮膜的厚度、拉伸強(qiáng)度和斷裂伸長(zhǎng)率基本沒有影響，其中，相比較PE保鮮膜，抗菌保鮮膜的厚度沒有發(fā)生變化；而拉伸強(qiáng)度和斷裂伸長(zhǎng)率雖稍有降低，但總體變化較小，對(duì)抗菌保鮮膜的力學(xué)性能影響較小?？傮w而言，在PE保鮮膜中加入-PL-AOT后，該涂層抗菌保鮮膜仍具有良好的力學(xué)性能。

表2 ε-PL-AOT涂層抗菌保鮮膜的力學(xué)性能Table 2 Mechanical properties of antibacterial film coated with ε-PL-AOT

2.7 ε-PL-AOT抗菌效果評(píng)價(jià)

2.7.1-PL-AOT抗菌涂層的抑菌效果

為驗(yàn)證-PL-AOT抗菌涂層的抑菌效果，以大腸桿菌和金黃色葡萄球菌為研究對(duì)象，對(duì)其抑菌率進(jìn)行評(píng)價(jià)。如圖7所示，肉眼可直觀觀察到PE膜處理樣品和PE/-PL-AOT膜處理樣品的菌落數(shù)量具有明顯差異。由于PE膜無(wú)抗菌功能，24 h后表面大腸桿菌和金黃色葡萄球菌菌落數(shù)分別為6.78（lg（CFU/g））和6.87（lg（CFU/g））；而-PL-AOT抗菌膜表面細(xì)菌數(shù)量遠(yuǎn)低于對(duì)照組，分別為2.94（lg（CFU/g））和2.73（lg（CFU/g）），證明了該涂層具有廣譜抗菌功能。其主要?dú)⒕鷻C(jī)制為接觸殺菌，涂層表面-PL分子接觸細(xì)菌時(shí)可以破壞細(xì)菌細(xì)胞膜的完整性，導(dǎo)致細(xì)胞膜通透性改變，細(xì)菌內(nèi)容物泄漏，進(jìn)而裂解死亡。

圖7 ε-PL-AOT抗菌涂層對(duì)大腸桿菌（A）和金黃色葡萄球菌（B）的抑制效果Fig. 7 Inhibitory effect of ε-PL-AOT antibacterial coating on Escherichia coli (A) and Staphylococcus aureus (B)

2.7.2-PL-AOT抗菌涂層對(duì)淡水魚保鮮效果

肉品腐敗變質(zhì)的主要原因是微生物大量生長(zhǎng)代謝導(dǎo)致蛋白質(zhì)分解。如圖8所示，肉眼可直接觀察到3 種處理方式樣品的菌落數(shù)量有明顯差異，空白對(duì)照組（無(wú)保鮮膜）和PE保鮮膜處理組的細(xì)菌菌落總數(shù)均高于1×10CFU/g，根據(jù)GB 4789.2—2016，肉制品一級(jí)鮮度的菌落總數(shù)低于1×10CFU/g，其為變質(zhì)肉。PE/-PL-AOT抗菌膜處理組表現(xiàn)出明顯保鮮效果，在平板上肉眼無(wú)可視菌落，菌落總數(shù)低于1×10CFU/g，滿足GB 4789.2—2016中肉制品一級(jí)鮮度標(biāo)準(zhǔn)，以上結(jié)果表明-PL-AOT抗菌涂層在淡水魚常溫保鮮領(lǐng)域具有很好的應(yīng)用前景。

圖8 ε-PL-AOT抗菌涂層對(duì)魚肉保鮮效果Fig. 8 Effect of ε-PL-AOT antibacterial coating on total bacterial count of grass carp fillets

3 結(jié) 論

本研究以天然抗菌高分子材料-PL和表面活性劑AOT為原料，創(chuàng)新采用一步靜電組裝技術(shù)，制備穩(wěn)定的保鮮膜涂層。該涂層對(duì)以大腸桿菌和金黃色葡萄球菌為代表的細(xì)菌具有顯著的抗菌性能，同時(shí)在以草魚魚肉為代表的淡水魚魚肉類保鮮中，也顯示出較好的延長(zhǎng)貨架期性能。該技術(shù)解決了水溶性抗菌材料在疏水保鮮膜表面難以穩(wěn)定附著的難題，對(duì)其他抗菌高分子材料如殼聚糖等的抗菌包裝材料開發(fā)具有指導(dǎo)意義；同時(shí)具有工藝簡(jiǎn)單、抗菌功效顯著的優(yōu)勢(shì)，在食品包裝領(lǐng)域具有廣闊的開發(fā)和應(yīng)用前景。