田懷香，熊娟涓，于海燕，陳 臣，婁新曼

（上海應(yīng)用技術(shù)大學(xué)香料香精技術(shù)與工程學(xué)院，上海 201418）

未來食品發(fā)展兼具“健康”與“美味”雙導(dǎo)向，果酒風(fēng)味誘人、低酒精度（乙醇體積分?jǐn)?shù)0.5%～15%）和高營養(yǎng)價(jià)值（如維生素、多酚、低聚糖等）等優(yōu)點(diǎn)符合消費(fèi)者口味與健康需求，因此倍受喜愛。根據(jù)中國產(chǎn)業(yè)信息網(wǎng)報(bào)道，2021年我國果酒產(chǎn)量約為205.3萬 kL，市場規(guī)模突破千億元。發(fā)展果酒產(chǎn)業(yè)不僅有利于豐富水果的精深加工產(chǎn)品，還能提高水果資源的高值化利用，具有廣闊的市場前景，而發(fā)酵原料及發(fā)酵工藝的不同也使得果酒中香氣化合物各具特點(diǎn)。

不同微生物在果酒發(fā)酵的各個(gè)階段扮演著相應(yīng)角色，其生長代謝、產(chǎn)酶能力和酶活力及菌種間相互作用都對(duì)果酒風(fēng)味形成具有重要意義。水果中存在大量香氣前體物質(zhì)（如糖、糖苷、氨基酸等），這些物質(zhì)通常不具有香氣屬性，經(jīng)微生物、酶的作用發(fā)生一系列生化反應(yīng)，進(jìn)而轉(zhuǎn)化為香氣化合物。如香葉醇、香茅醇等萜烯類化合物，通常以無味的糖苷結(jié)合態(tài)形式存在，利用微生物發(fā)酵過程分泌的糖苷酶催化糖苷鍵水解，釋放具有香氣的游離糖苷配體，從而對(duì)果酒起到增香作用。生物調(diào)控是形成果酒最佳或理想風(fēng)味的關(guān)鍵手段，深入了解微生物、酶與香氣間的關(guān)系，對(duì)于控制果酒發(fā)酵，提高果酒風(fēng)味品質(zhì)具有重要意義。

本文綜述不同果酒中主要香氣化合物及其生物轉(zhuǎn)化途徑，闡明香氣前體物質(zhì)對(duì)果酒香氣的貢獻(xiàn)；探討微生物和酶對(duì)果酒香氣化合物的生物調(diào)控機(jī)制，并展望未來果酒的研究熱點(diǎn)，為建立以風(fēng)味導(dǎo)向?yàn)榛A(chǔ)的果酒定向調(diào)控方法提供技術(shù)參考。

1 果酒中主要的香氣化合物

香氣是衡量果酒風(fēng)味品質(zhì)的關(guān)鍵指標(biāo)，按香氣化合物結(jié)構(gòu)的不同可分為酯類、醇類、萜烯類等，正是各種香氣成分的協(xié)同相互作用形成了果酒的特征香氣，并隨著發(fā)酵工藝（圖1）的不同而有所差異。

圖1 果酒的發(fā)酵工藝Fig. 1 Fermentation process of fruit wine

酯類物質(zhì)被視為果酒香氣的主體成分，可賦予果酒果香和花香屬性，它們主要來源于酵母的生物合成或在脂肪酶作用下催化酸和醇發(fā)生酯化反應(yīng)生成。高甜甜等發(fā)現(xiàn)辛酸乙酯、庚酸乙酯、乙酸乙酯和月桂酸乙酯為楊梅果酒的主要酯類，且辛酸乙酯和庚酸乙酯為新增發(fā)酵香氣，含量在發(fā)酵過程呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。果酒香氣的形成除了香氣化合物自身閾上濃度貢獻(xiàn)，還存在閾下濃度的協(xié)同增效作用。櫻桃酒中癸酸乙酯和水楊酸甲酯含量雖低于閾值濃度，但在重組模型中二者可以明顯提高果酒的甜香和果香屬性，并降低嗅覺閾值。與25 ℃相比，低溫條件（15 ℃）下發(fā)酵的葡萄酒中檢測(cè)到更多的丁酸乙酯、己酸乙酯、乙酸異戊酯等。這主要與?；D(zhuǎn)移酶有關(guān)，低溫條件下該酶活力更強(qiáng)，更有利于酯類物質(zhì)積累。

高級(jí)醇是具有3 個(gè)及以上碳原子的一元醇總稱，在發(fā)酵過程主要通過降解代謝和合成代謝兩種途徑生成。其中，合成途徑是通過丙酮酸脫羧酶、脫氫酶將葡萄糖代謝產(chǎn)生的酮酸經(jīng)脫羧、脫氫還原成高級(jí)醇；而降解代謝是氨基酸通過轉(zhuǎn)氨作用生成的酮酸，在轉(zhuǎn)氨酶和脫羧酶作用下形成醛，最終轉(zhuǎn)變?yōu)楦呒?jí)醇（圖2）。隨著李子果酒發(fā)酵的進(jìn)行，異戊醇含量先升高后下降，隨后趨于穩(wěn)定，而苯乙醇含量呈明顯上升趨勢(shì)。適量的高級(jí)醇可以增強(qiáng)果酒的果香和花香特征，但濃度過高會(huì)造成口感粗糙苦澀并具有較強(qiáng)的致醉性，因此，果酒發(fā)酵過程應(yīng)嚴(yán)格控制高級(jí)醇的產(chǎn)生。

圖2 香氣化合物代謝的一般途徑Fig. 2 General pathways for the synthesis of aroma compounds

酸類化合物主要來源于果實(shí)本身，適量的酸類物質(zhì)可以為果酒帶來清爽口感，使酒體更加圓潤，也有助于陳釀過程香氣的進(jìn)一步演變。榴蓮果實(shí)中的丙酸、戊酸、庚酸和壬酸在發(fā)酵過程被代謝，含量到微量水平，并生成相應(yīng)的酯類物質(zhì)，如丙酸乙酯和己酸乙酯，而辛酸和癸酸隨著發(fā)酵過程的推進(jìn)含量增加至適當(dāng)水平，從而賦予果酒奶香風(fēng)味。于海燕等通過計(jì)算香氣活力值，確定癸酸、月桂酸等為黃桃果酒的主要酸類物質(zhì)，在發(fā)酵后期酸類化合物含量增長了5～8 倍，賦予果酒溫和的椰子香及果香屬性。

醛酮類化合物是果酒香氣的重要協(xié)調(diào)成分，雖然在果酒中含量低，但其閾值較低，對(duì)果酒香氣具有不可忽視的作用。Dellacassa等發(fā)現(xiàn)菠蘿酒中存在3-羥基-2-丁酮、2-戊酮、苯甲醛等醛酮類化合物，賦予果酒奶香、苦杏仁和香蕉等香氣屬性，這也是醛酮類化合物首次在菠蘿酒中被報(bào)道。在柚子酒發(fā)酵過程中醛、酮類物質(zhì)含量先下降后上升，而檸檬醛等物質(zhì)僅存在于發(fā)酵早期和中期，因此，可根據(jù)其含量判斷果酒的發(fā)酵程度。此外，醛酮類化合物間也可通過協(xié)同作用提高風(fēng)味感知。當(dāng)酸奶中2,3-丁二酮、乙醛和3-羥基-2-丁酮質(zhì)量濃度比為4∶16∶32時(shí)，可以顯著降低各化合物在酸奶中的香氣閾值，使整體香氣強(qiáng)度達(dá)到最佳。

萜烯類化合物主要由香氣前體物質(zhì)經(jīng)水解或酵母發(fā)酵代謝產(chǎn)生，萜烯類糖苷也是最早鑒定出的香氣糖苷。大多數(shù)萜烯類物質(zhì)的形成與非釀酒酵母（如、、sp.等）和釀酒酵母（）的混合發(fā)酵及其分泌的糖苷酶活力有關(guān)。高產(chǎn)葡萄糖苷酶的酵母菌種發(fā)酵的桑葚果酒中香茅醇、香葉醇和橙花醇等萜烯類含量較高，可賦予果酒更多的果香、甜香、青香、鈴蘭和柑橘香氣。研究表明，香葉醇與香茅醇以非競爭方式與人嗅覺受體上足夠多的活性位點(diǎn)作用，隨著二者含量增加，香葉醇與香茅醇與更多的活性位點(diǎn)結(jié)合，香氣強(qiáng)度增大；而當(dāng)二者含量增加到一定水平后，香茅醇會(huì)搶占原本與香葉醇作用的活性位點(diǎn)，使整體香氣強(qiáng)度逐漸減弱。

2 果酒中香氣化合物的生物轉(zhuǎn)化

按照不同工藝階段，果酒香氣可分為品種香、發(fā)酵香和陳釀香，本文主要對(duì)品種香和發(fā)酵香進(jìn)行介紹。品種香直接來源于果實(shí)的香氣物質(zhì)，主要由果實(shí)自身含有的可溶性糖、氨基酸和脂肪酸等香氣前體物質(zhì)水解形成。而果酒的發(fā)酵香則是微生物通過乙醇發(fā)酵或蘋果酸-乳酸發(fā)酵（malolactic fermentation，MLF）將果實(shí)中的香氣前體物質(zhì)轉(zhuǎn)化為高級(jí)醇、乙酯類等物質(zhì)（圖2）。

2.1 香氣前體物質(zhì)對(duì)果酒香氣的貢獻(xiàn)

2.1.1 糖及糖苷

碳水化合物不僅為酵母菌代謝提供主要能量來源，而且果酒的品種香也主要來自于碳水化合物的次生代謝產(chǎn)物。首先，葡萄糖代謝生成丙酮酸，然后經(jīng)脫羧、脫氫作用轉(zhuǎn)化為乙醇，并在脂肪酸酰基輔酶A和?；D(zhuǎn)移酶的催化作用下生成酯類化合物，而脂肪酸?；o酶A在磷酸轉(zhuǎn)移酶的催化作用下生成酸類化合物。發(fā)酵體系中糖的種類、含量以及揮發(fā)性化合物極性和疏水作用均會(huì)影響香氣釋放。葡萄糖的添加會(huì)提高葡萄酒植物香和花香屬性，果糖和蔗糖會(huì)極大改善青草味，而麥芽糖則有助于花香、酯香、果香和甜香的形成。與蔗糖作為碳源進(jìn)行發(fā)酵相比，將糯米作為青梅酒碳源，可提高酒中酯類和醇類含量，且1-己醇和苯甲醛為糯米發(fā)酵特有的代謝產(chǎn)物。Pan Xin等發(fā)現(xiàn)添加5%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）的葡萄糖或果糖后，由于鹽析效應(yīng)，芒果汁中丁酸乙酯濃度顯著增加，而15%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）的添加量分別導(dǎo)致月桂烯含量顯著降低55%和48%（＜0.05），這可能是由于高質(zhì)量分?jǐn)?shù)蔗糖增加了果汁黏度，或增強(qiáng)了香氣化合物與糖的疏水作用，進(jìn)而陰止香氣成分的釋放。

香氣糖苷是以非揮發(fā)性鍵合態(tài)形式存在，香氣物質(zhì)以苷元形式與糖基通過糖苷鍵結(jié)合，可在糖苷酶作用下釋放出游離芳香物質(zhì)。彭邦遠(yuǎn)等采用杏仁葡萄糖苷酶對(duì)刺梨汁中鍵合態(tài)萜烯進(jìn)行酶解，26 種新增香氣成分被釋放。采用葡萄糖苷酶水解‘媚麗’葡萄和葡萄酒中的萜烯類化合物后，芳樟醇含量明顯增多，提高了葡萄酒花香和柑橘香氣屬性，而同時(shí)接種酵母和糖苷酶水解更有利于苯乙基類和酯類物質(zhì)的產(chǎn)生，發(fā)酵香與品種香相互作用，豐富了葡萄酒香氣。一些揮發(fā)性酚也以糖苷形式存在，如丁香酚。在藍(lán)莓酒發(fā)酵過程中釀酒酵母和非釀酒酵母產(chǎn)生的葡萄糖苷酶可選擇性水解酚類糖苷，使丁香酚含量顯著升高。由于酶具有反應(yīng)溫和、專一、高效等特點(diǎn)，可最大限度地提高香氣化合物產(chǎn)量，在改善果酒風(fēng)味方面具有廣泛的應(yīng)用前景。

2.1.2 氨基酸

氨基酸代謝過程主要是支鏈酮酸在脫羧酶的催化下生產(chǎn)醛，然后通過乙醇脫氫酶轉(zhuǎn)化為醇，進(jìn)而與脂肪酸酰基輔酶A在?；D(zhuǎn)移酶的作用下生成酯類物質(zhì)，或是在磷酸轉(zhuǎn)移酶的催化作用下生成酸類物質(zhì)（圖2）。與銨鹽相比，氨基酸作為營養(yǎng)補(bǔ)充劑更有利于乙醇發(fā)酵，如精氨酸、纈氨酸對(duì)的生長和發(fā)酵速率均具有積極作用，并能促進(jìn)異丁醇、苯乙醇和異戊醇的產(chǎn)生。氨基酸的濃度與其衍生的芳香化合物濃度之間存在線性關(guān)系，可通過添加氨基酸的種類來預(yù)測(cè)果酒中香氣化合物組成。Liu Dan等發(fā)現(xiàn)亮氨酸、組氨酸、甘氨酸分別與獼猴桃果酒中醇類、萜烯類和酯類含量呈正相關(guān)，而在發(fā)酵時(shí)添加苯丙氨酸可增加荔枝酒中苯乙醇及酯類化合物含量。以上研究均表明氨基酸對(duì)果酒發(fā)酵香的產(chǎn)生具有重要貢獻(xiàn)。

2.1.3 脂肪酸

脂肪酸主要通過α-/β-氧化和酶促氧化途徑代謝產(chǎn)生直鏈脂肪族酯類、醇類、內(nèi)酯類等香氣化合物，飽和脂肪酸可通過β-氧化進(jìn)行循環(huán)代謝，脂肪酸被氧化成脂肪族乙酰輔酶A后，再與乙酰輔酶A氧化酶反應(yīng)，形成內(nèi)酯類化合物。C～C內(nèi)酯化合物通常具有椰子香和蜜桃香，可利用脂肪酸通過脂氧合酶途徑經(jīng)氧化、裂解、脫氫生成。許多中鏈脂肪酸，如辛酸、癸酸、月桂酸通常在發(fā)酵后期生成，當(dāng)其濃度過高時(shí)往往會(huì)產(chǎn)生不愉快的感官屬性，但它們所對(duì)應(yīng)的乙酯類化合物則為果酒提供宜人的果味、花香和白蘭地香氣。通過模擬葡萄酒發(fā)酵體系發(fā)現(xiàn)辛酸與辛酸乙酯的形成具有顯著相關(guān)性，推測(cè)辛酸可能是合成辛酸乙酯的前體物質(zhì)之一。添加不飽和脂肪酸可以促進(jìn)葡萄酒中揮發(fā)性硫醇和酯類化合物的生成，而飽和脂肪酸的添加使得酒中氨基酸和有機(jī)酸含量提高。此外，在果酒發(fā)酵和陳釀過程中，有機(jī)酸也可與醇類物質(zhì)發(fā)生酯化反應(yīng)生成乙酸乙酯、月桂酸乙酯、乙酸異戊酯等，對(duì)果酒的香氣具有不可忽略的貢獻(xiàn)。

2.2 發(fā)酵過程果酒香氣化合物的形成

在發(fā)酵過程中果酒香氣特征呈現(xiàn)動(dòng)態(tài)變化（圖3）。發(fā)酵初始的石榴汁中共檢測(cè)出25 種香氣化合物，在發(fā)酵第8天香氣化合物種類增至67 種，其中，萜烯類化合物種類增加最為顯著。這也與葡萄酒、藍(lán)莓酒及桑葚酒發(fā)酵過程中萜烯類物質(zhì)的變化趨勢(shì)一致。在發(fā)酵初期，丁酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯和3-羥基丁酸乙酯為梨酒的關(guān)鍵香氣成分，而乙酸乙酯、松油醇、檸檬烯在發(fā)酵后期的貢獻(xiàn)更大。通過發(fā)酵作用，越桔果酒中乙酸乙酯、3-甲基-1-丁醇、2-甲基-1-丙醇含量急劇上升，且超過了它們的感官閾值。隨著發(fā)酵過程的推進(jìn)，最初存在于榴蓮中的酯類化合物，如2-甲基丁酸甲酯、2-丁烯酸乙酯和2-甲基丁酸丙酯逐漸被降解，而乙酸乙酯、乙酸異戊酯和琥珀酸二乙酯含量升高，這些酯類化合物的產(chǎn)生與它們的酸類前體物質(zhì)代謝有關(guān)。Wattanakul等在芒果酒中檢測(cè)到7 種萜烯類物質(zhì)，但各物質(zhì)在發(fā)酵過程中呈現(xiàn)不同的變化趨勢(shì)：香葉醇含量逐漸下降，可能被轉(zhuǎn)化為香茅醇等其他萜醇類化合物，而香茅醇、反紫羅蘭酮等化合物含量顯著增加，這可能是由于酵母分泌的乙酰輔酶A促進(jìn)了相關(guān)前體物質(zhì)合成。由于微生物發(fā)酵誘導(dǎo)游離萜烯苷元釋放，藍(lán)莓果酒在發(fā)酵第6天后萜烯總含量迅速積累。由此可見，發(fā)酵階段是果汁到果酒香氣變化的主要階段，而微生物在這個(gè)階段中扮演著關(guān)鍵角色。隨著全基因組測(cè)序技術(shù)的迅猛發(fā)展，包括基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、代謝組學(xué)在內(nèi)的食品組學(xué)技術(shù)被廣泛應(yīng)用于果酒風(fēng)味的改善。通過基因工程手段將非釀酒酵母中具有編碼香葉醇合成酶的基因?qū)胫羞M(jìn)行表達(dá)，發(fā)現(xiàn)其用于發(fā)酵時(shí)更有利于白葡萄酒中萜烯類化合物的生成。釀酒酵母中和是影響橙花叔醇和苯乙醇合成的關(guān)鍵基因，而乙酸乙酯的合成主要涉及和基因的表達(dá)，基因在釀酒酵母中過度表達(dá)后使得葡萄酒中4-巰基-4-甲基-2-戊酮的釋放增加。揭示香氣化合物與微生物代謝的關(guān)系有助于進(jìn)一步靶向篩選發(fā)酵菌株及優(yōu)化發(fā)酵工藝參數(shù)促進(jìn)香氣化合物的定向內(nèi)源積累。

圖3 果酒發(fā)酵前后香氣化合物變化Fig. 3 Change of aroma compounds before and after the fermentation of fruit wine

不同菌種和發(fā)酵工藝下各種果酒的主要香氣化合物組成如表1所示。

表1 不同果酒中主要香氣化合物組成Table 1 Major aroma compounds in various fruit wine

3 果酒香氣化合物的生物調(diào)控機(jī)制

3.1 發(fā)酵菌種相互作用對(duì)果酒香氣的影響

果酒特色香氣與微生物之間存在必然聯(lián)系，菌種間的相互作用對(duì)果酒香氣化合物的形成以及最終產(chǎn)品的風(fēng)味品質(zhì)具有決定性作用。研究表明，自然發(fā)酵更有利于果酒中菌群多樣性的形成，包括短乳桿菌（）、明串珠菌（）、有孢漢遜酵母（）、膠紅酵母（）等。但自然發(fā)酵耗時(shí)較長，且整個(gè)發(fā)酵過程的調(diào)控度低，合成的特征香氣強(qiáng)度弱，因此，通過人工調(diào)控方式將關(guān)鍵菌株進(jìn)行混合接種，調(diào)節(jié)釀造微生態(tài)，以實(shí)現(xiàn)香氣化合物的內(nèi)源積累（圖4）。

圖4 香氣與微生物發(fā)酵間的關(guān)系Fig. 4 between aroma compounds and microorganisms during wine fermentation

3.1.1 釀酒酵母與非釀酒酵母

目前果酒的工業(yè)生產(chǎn)通常采用商業(yè)釀酒酵母，以單菌發(fā)酵為主。雖然單菌發(fā)酵可以使酵母菌充分利用原料的營養(yǎng)物質(zhì)，提高乙醇生產(chǎn)率，但生產(chǎn)出的果酒往往口感單一，揮發(fā)性香氣化合物種類和含量較少。乙醇含量過高會(huì)抑制果酒中其他香氣成分的揮發(fā)特性，10%左右乙醇更有利于香氣的釋放與積累，而非釀酒酵母的乙醇生產(chǎn)率低，且可以代謝多種風(fēng)味酶，促進(jìn)香氣成分的釋放?；诖耍劸平湍概c非釀酒酵母的混合發(fā)酵方式，已逐漸應(yīng)用于低酒精度、高風(fēng)味品質(zhì)的果酒生產(chǎn)。

常見的非釀酒酵母菌株包括、、、畢赤酵母（sp.）、假絲酵母屬（sp.）、克勒克酵母（）、、德巴利漢生酵母（）、美極梅奇酵母（）、耐熱克魯維酵母（）等。將4 種不同的非釀酒酵母分別與混合發(fā)酵黃桃果酒，混合組中乙酸乙酯含量最高，和分別有利于苯乙醇和山梨醇的生成，則有利于高級(jí)醇和脂肪酸的代謝合成。在葡萄酒、火龍果酒和越桔果酒中均有類似結(jié)論，更有利于葡萄酒和火龍果酒中乙酸苯乙酯、乙酸異戊酯和萜烯類化合物的生成，而可以使越桔果酒產(chǎn)生更多的乙醛、丙酮酸和2,3-丁二醇。蘋果酒混合發(fā)酵過程中，3-甲基丁醇和3-甲基乙酸丁酯的高效合成主要源于克魯維畢赤酵母（）基因組重復(fù)編碼的高水平表達(dá)，提高對(duì)香氣底物亮氨酸的利用。與非釀酒酵母的接種比例及接種方式均對(duì)果酒香氣有顯著影響。高比例的發(fā)酵畢赤酵母（）會(huì)對(duì)的生長產(chǎn)生抑制作用，當(dāng)二者以1∶1的比例接種會(huì)促進(jìn)果酒中乙酸異戊酯、C～C脂肪酸、異戊醇及苯乙醇等香氣物質(zhì)的形成。Li Yueqi等發(fā)現(xiàn)順序接種與可提高葡萄酒中乙酸乙酯含量，而同時(shí)接種更有利于中鏈脂肪酸乙酯生成。此外，不同類型的非釀酒酵母的發(fā)酵特性也存在差異。在混合發(fā)酵中，對(duì)乙醇的耐受性較弱，而卻具有較高的存活率。因此，利用混合發(fā)酵改善果酒香氣時(shí)也應(yīng)對(duì)非釀酒酵母的特性進(jìn)行考察，進(jìn)而篩選出高穩(wěn)定性、高產(chǎn)香能力菌株。

3.1.2 酵母與乳酸菌

乙醇發(fā)酵結(jié)束后，往往采用MLF降低果酒酸度，豐富果酒香氣。但乙醇發(fā)酵后，果酒pH值較低、營養(yǎng)物質(zhì)缺乏，且果酒中存在的SO、乙醇等均對(duì)乳酸菌活性具有抑制作用。因此，通常采用酵母菌和乳酸菌同時(shí)接種來提高乳酸菌的存活率及產(chǎn)香能力。常用于果酒發(fā)酵的乳酸菌主要有、、和片球菌屬（）等，這些乳酸菌具有應(yīng)激反應(yīng)基因，如、、和，可以克服相對(duì)惡劣的發(fā)酵環(huán)境。Chen Dai等發(fā)現(xiàn)與同時(shí)接種發(fā)酵的荔枝果酒中乳酸乙酯、乙酸異戊酯、中鏈脂肪酸等化合物增多，高級(jí)醇含量降低，且同時(shí)發(fā)酵提高了果酒pH值，使得乳酸菌代謝的糖苷酶活力增強(qiáng)。26、和同時(shí)接種發(fā)酵葡萄酒時(shí)，更有利于乙酸酯和脂肪酸乙酯的產(chǎn)生，且可以提高26細(xì)胞的存活率，進(jìn)而增強(qiáng)葡萄糖苷酶活力，使芳樟醇、香茅醇等萜烯類化合物的含量增加。Hsp20蛋白是應(yīng)激狀態(tài)的標(biāo)志物，轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果表明，非釀酒酵母（和）可降低中Hsp20蛋白的水平，從而表明非釀酒酵母對(duì)其具有保護(hù)作用。Markkinen等利用核磁共振研究MLF對(duì)沙棘汁代謝譜的影響發(fā)現(xiàn)，蘋果酸、必需氨基酸和核苷在發(fā)酵早期被代謝，而糖類物質(zhì)的消耗一般發(fā)生在發(fā)酵中后期。綜上，在果酒釀造過程中同時(shí)接種和乳酸菌誘導(dǎo)乙醇發(fā)酵和MLF同時(shí)進(jìn)行，可以克服順序發(fā)酵缺點(diǎn)，縮短整體發(fā)酵時(shí)間，提升果酒風(fēng)味。

目前，果酒發(fā)酵香氣的形成主要集中在與非釀酒酵母、與乳酸菌間的相互作用，關(guān)于與霉菌的相互作用主要用于白酒和黃酒發(fā)酵，今后關(guān)于霉菌對(duì)果酒風(fēng)味的提高作用也應(yīng)進(jìn)一步探索。

3.2 工藝參數(shù)對(duì)果酒發(fā)酵菌株產(chǎn)香能力的影響

發(fā)酵工藝會(huì)影響菌株的代謝活性，進(jìn)而導(dǎo)致菌株的初級(jí)和次級(jí)代謝有所區(qū)別，除了原料、發(fā)酵菌種外，預(yù)處理方式、發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度等參數(shù)均對(duì)果酒的風(fēng)味品質(zhì)產(chǎn)生重要影響。與25 ℃相比，在13 ℃發(fā)酵時(shí)，基因表達(dá)較低，更有利于葡萄酒中乙醇的積累。不飽和脂肪酸的添加使過表達(dá)基因酵母（T73::）發(fā)酵葡萄酒中乙酸乙酯、乙酸異戊酯和乙酸苯乙酯等物質(zhì)含量顯著增加，并且影響了葡萄酒中高級(jí)醇、中鏈脂肪酸水平及其相關(guān)基因（、、、、和）表達(dá)，而低添加量的不飽和脂肪酸促進(jìn)了過表達(dá)基因酵母（T73::）對(duì)辛酸乙酯和癸酸乙酯的合成，且和基因的表達(dá)與發(fā)酵溫度呈正相關(guān)。以纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸作為氮源，可以增加葡萄酒中揮發(fā)性香氣化合物含量，且與未添加上述3 種氨基酸的對(duì)照組相比，發(fā)酵過程25 個(gè)基因的表達(dá)存在差異，其中參與香氣化合物生物合成的、、、和基因的表達(dá)顯著上調(diào)，改善了酵母的發(fā)酵活性，增加了高級(jí)醇（82%）、中鏈脂肪酸（34%）及相應(yīng)酯類的含量（49%）。Heit等觀察到利用葡萄原汁發(fā)酵的葡萄酒其乙酸含量高于稀釋后發(fā)酵的6 倍，而稀釋處理使乙酸乙酯含量增加2.4 倍，且與稀釋處理相比，原汁發(fā)酵過程中和基因表達(dá)水平分別下調(diào)至原來的1/19和1/11.2，而基因上調(diào)了14.6 倍，因此，、和的差異表達(dá)是導(dǎo)致不同滲透壓條件下乙酸和乙酸乙酯含量不同的原因。綜上，合理添加香氣前體物質(zhì)，并優(yōu)化發(fā)酵工藝是調(diào)控果酒風(fēng)味品質(zhì)的重要手段。

目前，關(guān)于果酒發(fā)酵條件的優(yōu)化已積累了大量研究，為果酒工業(yè)化生產(chǎn)提供了充分的技術(shù)保障。通過優(yōu)化發(fā)酵工藝可以豐富果酒中香氣化合物種類和含量。Yuan Lu等利用響應(yīng)面分析對(duì)青棗酒發(fā)酵工藝進(jìn)行優(yōu)化，當(dāng)SO質(zhì)量濃度80 mg/L、還原糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)24%、酵母添加量0.3%、發(fā)酵時(shí)間8 d時(shí)，更有利于苯乙醇、4-羥基苯乙醇、3-甲基-1-丁醇、異戊醇和琥珀酸二乙酯的合成。當(dāng)發(fā)酵溫度為20 ℃、料液比1∶2（/）、還原糖質(zhì)量濃度180 g/L時(shí)所發(fā)酵的青梅酒中揮發(fā)性香氣物質(zhì)種類（53 種）顯著高于市售樣品（30 種）。當(dāng)初始糖度為20 °Brix、pH 4.0、發(fā)酵溫度28 ℃、發(fā)酵時(shí)間96 h，柚子酒中香氣物質(zhì)種類最豐富，柚子的特征香氣化合物檸檬烯含量最高。由于發(fā)酵溫度過高會(huì)導(dǎo)致發(fā)酵菌種活力下降、參與生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)的酶失活，導(dǎo)致發(fā)酵不完全、乙醇產(chǎn)量不足，嚴(yán)重影響果酒風(fēng)味，目前低溫發(fā)酵成為果酒生產(chǎn)的趨勢(shì)。在低溫條件下，發(fā)酵菌種的代謝和酶活力較低使發(fā)酵時(shí)間延長，更多的小分子香氣化合物得以保留。在20 ℃發(fā)酵的葡萄酒中香氣化合物總含量最高，主要為辛酸乙酯和癸酸乙酯，而10 ℃發(fā)酵更利于石竹烯的生成。這說明低溫發(fā)酵對(duì)葡萄糖苷酶釋放萜烯苷元和發(fā)酵菌株代謝合成萜烯物質(zhì)能力均有積極作用。

3.3 微生物代謝酶對(duì)果酒香氣化合物的影響

果酒發(fā)酵過程涉及多種生化反應(yīng)，在此過程微生物會(huì)代謝產(chǎn)生各種風(fēng)味酶，如果膠酶、糖苷酶和?；D(zhuǎn)移酶等，這些酶可以破壞細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)、水解結(jié)合態(tài)香氣前體物質(zhì)，或參與香氣化合物的代謝合成，從而促進(jìn)香氣化合物的釋放，增加果酒香氣的復(fù)雜度和豐富度。因此，對(duì)關(guān)鍵酶活力的監(jiān)測(cè)和調(diào)控也是提高果酒風(fēng)味的關(guān)鍵步驟。

3.3.1 果膠酶

果膠是一類以半乳糖醛酸為主，由1,4-糖苷鍵連接組成的酸性雜多糖，是植物細(xì)胞壁的一部分，除了陰礙果汁提取和澄清，在果酒發(fā)酵過程中對(duì)芳香成分的釋放也具有一定的抑制作用。在原料浸漬過程添加果膠酶可促進(jìn)葡萄酒發(fā)酵過程產(chǎn)生更多的苯乙醇和萜烯類化合物。同樣，經(jīng)果膠酶處理后的火龍果酒中乙酸乙酯、長葉烯等化合物含量顯著提高。研究發(fā)現(xiàn)，維克氏酵母（）、sp.等可通過自身產(chǎn)生的果膠酶、纖維素酶酶解葡萄果皮細(xì)胞壁，在提高果汁得率和澄清度的同時(shí)促進(jìn)香氣化合物的釋放。Rollero等從葡萄汁中分離出一株具有分泌高活力果膠酶的，與對(duì)照組相比，此菌株釀造的葡萄酒中苯乙醇和苯乙酸乙酯的含量增加，果香屬性顯著提高。Maturano等發(fā)現(xiàn)，乙醇對(duì)果膠酶活力具有一定的抑制作用，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長和乙醇濃度的升高，果膠酶活力逐漸降低，進(jìn)而陰礙了胞內(nèi)香氣物質(zhì)的釋放。

3.3.2 糖苷酶

糖苷酶可以使糖苷鍵斷裂，釋放糖苷類香氣前體物質(zhì)，主要包括萜烯類和部分酚類糖苷化合物（圖5）。糖苷酶在酵母細(xì)胞中的存在方式包括胞內(nèi)、胞外和細(xì)胞壁3 種，以胞外酶最為常見，、、、sp.等非釀酒酵母均能分泌高活力胞外糖苷酶。不同酵母菌分泌的糖苷酶活力及其產(chǎn)香能力有所差別。胞外液中葡萄糖苷酶、鼠李糖苷酶、木糖苷酶活力更高，而胞外液中阿拉伯糖苷酶活力更高，前者促進(jìn)了萜烯類和苯乙基類化合物積累，而后者更有利于脂肪酸乙酯合成。Ovalle等發(fā)現(xiàn)分泌的葡萄糖苷酶對(duì)C-降異戊二烯化合物的特異性較為突出，能夠提高果酒中4-氧代-7,8-二氫紫羅蘭醇、3-氧代紫羅蘭醇和吐葉醇等物質(zhì)的合成，豐富了果味、甜味、蜂蜜等香氣屬性。研究發(fā)現(xiàn)，酵母產(chǎn)生糖苷酶的能力和酶活力與和基因密切相關(guān)，相對(duì)于兩個(gè)基因都缺失或僅含有基因的酵母菌，含有基因的酵母菌能分泌高活力的葡萄糖苷酶，且在發(fā)酵過中酶活力也維持在較高的水平。此外，部分乳酸菌也會(huì)分泌高活力葡萄糖苷酶。Zhang Jie等從中提取了一種新型葡萄糖苷酶BGL0224用于赤霞珠葡萄酒的增香，結(jié)果發(fā)現(xiàn)新增了包括4-萜品醇、蒎烯和乳酸乙酯在內(nèi)的15 種以上香氣化合物，與對(duì)照組相比，癸酸乙酯、辛酸乙酯和棕櫚酸乙酯等中、長鏈脂肪酸乙酯含量顯著增加，萜烯類化合物含量提高了2 倍。不同微生物分泌的糖苷酶對(duì)果酒的增香效果也存在差異。與商業(yè)糖苷酶相比，從非釀酒酵母中提取的胞外糖苷酶更有助于葡萄酒香氣的形成，而分泌的糖苷酶活力是酵母菌的3.4 倍，提高了櫻桃酒中游離態(tài)萜烯和苯甲酸苷元含量。

圖5 β-葡萄糖苷酶催化釋放香氣物質(zhì)作用示意圖Fig. 5 Release of aroma compounds catalyzed by β-glucosidase

3.3.3 其他風(fēng)味相關(guān)酶

蛋白酶可以水解蛋白質(zhì)，不僅有利于果酒的穩(wěn)定性，更有利于果酒香氣提升。經(jīng)蛋白酶處理的棗酒，可同化氮含量增多，同時(shí)，香氣強(qiáng)度和復(fù)雜性顯著提高。在葡萄酒發(fā)酵過程添加IWBT Y1123菌株分泌的蛋白酶后，葡萄酒中異丁醇和異戊醇濃度顯著升高。曾朝珍等利用和單獨(dú)和混合發(fā)酵蘋果酒，發(fā)現(xiàn)前3 d蛋白酶活力較高，隨后呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，在混合發(fā)酵中對(duì)酸性蛋白酶活力的貢獻(xiàn)多于。而微生物分泌蛋白酶的能力取決于溫度和培養(yǎng)基組成，當(dāng)溫度處于20 ℃且培養(yǎng)基中含有20 g/L葡萄糖和10 g/L酪蛋白胨時(shí)，最適宜酵母生長，蛋白酶活力可達(dá)到最大。

微生物可以分泌具有催化酯類物質(zhì)合成的相關(guān)酶，以酯酶和脂肪酶為代表，為酯類化合物合成提供了綠色途徑。發(fā)酵過程中調(diào)節(jié)酯酶編碼基因的表達(dá)會(huì)影響酯類化合物含量，發(fā)酵第5天酒中乙酸乙酯、乙酸異戊酯和乙酸異丁酯的質(zhì)量濃度分別為468.94、99.86、7.69 mg/L，其中乙酸乙酯的質(zhì)量濃度高于對(duì)照組22 倍。酵母菌株CS31（CS31）經(jīng)誘變育種所分泌的酯酶整體活力升高，其中C2酯酶的活力較誘變前提升了24.64%，所釀造的菠蘿蜜果酒中酯類化合物提高了60.67%。通過優(yōu)化培養(yǎng)基成分，Y-1所產(chǎn)酯酶活力提高了4.3 倍。Bu?ková等發(fā)現(xiàn)、和等酵母菌株具有較高的產(chǎn)酯酶能力，可以嘗試?yán)眠@些微生物進(jìn)行果酒發(fā)酵，提高酯類化合物含量。目前，有關(guān)菌株產(chǎn)酯酶的研究主要集中在白酒、黃酒、醬油等發(fā)酵食品，果酒領(lǐng)域還需繼續(xù)開展相關(guān)研究。

醇脫氫酶、丙酮酸脫羧酶等內(nèi)源酶參與了香氣前體物質(zhì)的代謝，與果酒風(fēng)味形成息息相關(guān)。經(jīng)400 MPa處理后脂氧合酶、?；D(zhuǎn)移酶及磷脂酶A2被激活，哈密瓜汁中醛類、醇類物質(zhì)含量得到提升，其中庚醛、()-6-壬烯醛、丁酸乙酯等含量與脂肪酸代謝有關(guān)，而乙酸己酯、乙酸庚酯等與氨基酸含量變化密切相關(guān)。葡萄酒在發(fā)酵初期，酵母醇脫氫酶和丙酮酸脫羧酶的活力普遍較高，相對(duì)于e和球擬假絲酵母（）混合發(fā)酵，e單獨(dú)發(fā)酵更有利于維持丙酮酸脫羧酶活力，而醇脫氫酶活力不受發(fā)酵方式影響。因此，可通過控制發(fā)酵pH值、溫度等因素調(diào)節(jié)醇脫氫酶、丙酮酸脫羧酶等關(guān)鍵酶活力，獲得酶的最適反應(yīng)條件，實(shí)現(xiàn)果酒發(fā)酵過程香氣化合物的靶向合成。

4 結(jié) 語

風(fēng)味是決定果酒品質(zhì)的關(guān)鍵指標(biāo)，也是影響消費(fèi)者購買意向的重要屬性。但由于原料的多樣性和釀造工藝的復(fù)雜性，發(fā)酵過程往往會(huì)造成香氣損失，影響果酒風(fēng)味品質(zhì)，因此，亟需建立以風(fēng)味導(dǎo)向?yàn)榛A(chǔ)的果酒定向調(diào)控手段。本文從生物調(diào)控角度出發(fā)，綜述了常見果酒中香氣成分的種類、發(fā)酵過程中的香氣成分變化規(guī)律及形成機(jī)制；重點(diǎn)解析了近年來果酒釀造過程中發(fā)酵菌種的相互作用和微生物代謝酶等因素對(duì)果酒香氣化合物形成的影響。

目前對(duì)于果酒風(fēng)味的研究主要集中于發(fā)酵菌種的篩選、工藝參數(shù)的優(yōu)化和香氣成分的鑒定，對(duì)于果酒香氣化合物間的協(xié)同相互作用及香氣與味覺特征的感知相互作用，果酒釀造微生態(tài)機(jī)理解析，香氣成分與微生物對(duì)應(yīng)關(guān)系的建立等方面研究仍不完善。此外，果酒在發(fā)酵后期的催陳調(diào)控也是提高果酒風(fēng)味的重要手段，對(duì)于新技術(shù)在果酒催陳方面的應(yīng)用仍需不斷探索。因此，加強(qiáng)以上方面的研究更有助于果酒風(fēng)味品質(zhì)的提升，對(duì)我國果酒市場的轉(zhuǎn)型升級(jí)具有重要意義。