檀利軍，王敬敬,3，彭知云，李玉鋒，曾巧輝，趙 勇,*

（1.佛山科學技術(shù)學院食品科學與工程學院，廣東 佛山 528000；2.上海海洋大學食品學院，上海 201306；3.華南食品安全研究發(fā)展中心，廣東 佛山 528000；4.安徽工程大學生物與食品工程學院，安徽 蕪湖 241000）

在自然環(huán)境和食品工業(yè)中，大多數(shù)細菌主要是以生物被膜的形式存在。生物被膜是一種復雜三維結(jié)構(gòu)的細菌聚集體，包裹在自產(chǎn)的水合胞外聚合物（extracellular polymeric substance，EPS）中，包括多糖、蛋白質(zhì)、核酸和脂質(zhì)等。由于生物被膜中細胞的生理變化與EPS介導的保護屏障，生物被膜對外界極端環(huán)境壓力的抵抗力比浮游態(tài)細菌高1 000 倍以上。此外，生物被膜能夠黏附在各種生物或非生物表面，從而給食品工業(yè)帶來嚴峻的挑戰(zhàn)。近年來，生物被膜已成為全球性的公共衛(wèi)生問題，每年花費數(shù)10億 美元來解決生物被膜引起的食品污染、設(shè)備損壞和人類疾病等問題。

事實上，包含多種細菌的混合菌生物被膜才是生物被膜的主導形式。然而，現(xiàn)階段大多數(shù)研究都集中在對單菌生物被膜的探索，這些研究并不能準確反映生物被膜的真實情況。與單菌生物被膜相比，混合菌生物被膜中不同細菌之間具有更加復雜的相互作用，影響生物被膜的結(jié)構(gòu)、發(fā)展和功能。因此，明確混合菌生物被膜的形成與種間相互作用有利于制定防控生物被膜污染的新型策略，對保障食品安全與公眾健康具有十分重要的現(xiàn)實意義。

近年來，國內(nèi)外研究開始聚焦混合菌生物被膜新型控制策略的開發(fā)，這些新型策略是消除食品工業(yè)中有害菌污染、維護食品健康可持續(xù)發(fā)展的有力手段，然而卻缺少該方面的系統(tǒng)綜述。因此，本文首先概述了混合菌生物被膜的形成與相互作用，介紹了近年來食品工業(yè)中控制混合菌生物被膜污染的一些新型策略，最后對混合菌生物被膜防控在食品工業(yè)中的發(fā)展進行了展望。旨在為食品工業(yè)中混合菌生物被膜的深入研究與制定有效的生物被膜新型控制策略提供新的見解和思路，以期更好地保障食品安全與公眾健康。

1 食品工業(yè)中混合菌生物被膜的形成

食品工業(yè)中的有害菌能夠在食品或食品接觸表面形成生物被膜，危害食品安全與公眾健康。例如，大腸桿菌O157:H7是一種常見的食源性致病菌，可在蔬菜和莖葉表面形成生物被膜。Silagyi等還發(fā)現(xiàn)大腸桿菌O157:H7能在家禽、肉類和即食熟食表面形成生物被膜。此外，單增李斯特菌、副溶血性弧菌與沙門氏菌也是食品工業(yè)中常見病原菌，已被證明可以在三文魚、牡蠣和金槍魚等海產(chǎn)品表面形成生物被膜。另一方面，腐敗微生物引起的污染也是食品工業(yè)中面臨的重要挑戰(zhàn)。假單胞菌、希瓦氏菌與沙雷氏菌等優(yōu)勢腐敗菌極易在食品或食品接觸表面形成生物被膜。實際上，混合菌生物被膜才是有害菌在自然界和食品工業(yè)中的主要存在形式。因此，了解混合菌生物被膜的形成有利于闡明細菌生物被膜間的相互作用機制，從而更好地應(yīng)對其帶來的潛在風險。

1.1 混合菌生物被膜的形成過程

混合菌生物被膜中緊密聚集在EPS內(nèi)多種細菌間存在復雜關(guān)聯(lián)，其生長發(fā)育過程受到一系列物理、化學和生物過程的調(diào)控。與單菌生物被膜相比，混合菌生物被膜形成的機制與相互作用更為復雜，但其形成過程與單菌生物被膜基本相同，主要經(jīng)歷了3 個連續(xù)過程（圖1）：1）黏附階段；2）成熟階段；3）分散階段。

圖1 混合菌生物被膜的形成過程Fig. 1 Formation process of mixed-species biofilms

在第一個階段，浮游細胞在接觸表面附近移動，通過物理作用力或細菌附著物（例如鞭毛或菌毛）黏附到接觸表面。表面特性、溫度和壓力等不同因素可極大地調(diào)節(jié)細菌的黏附過程。細菌黏附到接觸表面相關(guān)的作用力包括范德華力、空間相互作用和靜電相互作用等。如果接觸表面有利于細菌成熟發(fā)展便會由初級黏附階段轉(zhuǎn)變到次級黏附階段。當吸引力大于排斥力時，一些可逆附著的細胞開始保持固定并變得不可逆附著。據(jù)報道，鞭毛或菌毛等附著物克服細胞和表面間的雙重排斥力，鞏固了細菌與接觸表面之間的相互作用。當細菌黏附在非極性疏水表面時，細胞表面疏水性在生物被膜形成的過程中起到關(guān)鍵性作用。這是因為接觸表面與細菌間的疏水相互作用降低了彼此間的排斥力?？傊?，在生物被膜形成發(fā)展的第一個階段，微生物細胞與接觸表面初步結(jié)合，然后通過相互作用力加強細菌細胞對接觸表面的黏附。

生物被膜形成過程的第二個階段是成熟階段。在這個階段，不同微生物細胞間通過產(chǎn)生自誘導信號分子進行交流，從而啟動生物被膜特異性相關(guān)基因的表達。此外，細菌開始分泌EPS基質(zhì)來構(gòu)建生物被膜的結(jié)構(gòu)網(wǎng)絡(luò)。EPS中的胞外多糖促進細胞間的黏附和吸引，進而形成致密的生物被膜屏障；胞外蛋白可以增強EPS框架的穩(wěn)定性；而胞外DNA則發(fā)揮著細胞之間形成復雜生物被膜網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵連接器與通訊媒介的重要功能。隨后，微菌落的大小與厚度不斷增加，進而提供了生物被膜細胞內(nèi)部發(fā)展的空間與環(huán)境。簡而言之，在這個階段，生物被膜通過操縱其結(jié)構(gòu)、生理和新陳代謝去適應(yīng)外部條件從而形成成熟生物被膜。

最后一個階段是生物被膜的分解。在這個階段，生物被膜細菌群落開始產(chǎn)生多種裂解酶，這些酶靶向破壞EPS并降低其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，從生物被膜內(nèi)部釋放的細菌重新轉(zhuǎn)變?yōu)楦∮螒B(tài)細胞。例如，熒光假單胞菌與銅綠假單胞菌釋放海藻酸鹽裂解酶；大腸桿菌釋放-乙酰肝素多糖裂解酶；馬鏈球菌產(chǎn)生用于分解生物被膜基質(zhì)的透明質(zhì)酸酶。細菌還可以通過上調(diào)鞭毛蛋白基因的表達，增強其自身的泳動性，使得細菌有利于轉(zhuǎn)移到新的黏附位點。此外，生物被膜也可以通過物理機制主動分離，例如脫落和侵蝕?？傊旌暇锉荒さ男纬墒且粋€復雜的連續(xù)過程，理解混合菌生物被膜的形成有助于探究混合菌生物被膜間的相互作用機制，進而為開發(fā)新型控制策略提供新的見解和思路。

1.2 混合菌生物被膜形成的影響因素

混合菌生物被膜的形成受到接觸表面的特性、食品基質(zhì)成分、外在環(huán)境條件與細菌自身特性等多種因素制約。接觸材料表面的特性包括疏水性、接觸角、粗糙度與靜電作用力等，這些參數(shù)往往共同作用并最終決定生物被膜的形成。然而，這些參數(shù)的具體影響在不同的實驗條件下差異很大。例如，Guo Linxia等研究了副溶血性弧菌培養(yǎng)48 h后在不銹鋼、聚苯乙烯與玻璃上生物被膜的形成情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，生物被膜的形成能力依次是玻璃＞聚苯乙烯＞不銹鋼。而Yan Jun等卻發(fā)現(xiàn)腐敗希瓦氏菌在以上3 種黏附表面生物被膜的形成能力依次是聚苯乙烯＞不銹鋼＞玻璃。有研究表明細菌傾向于黏附在粗糙度更大的接觸表面，而有研究卻發(fā)現(xiàn)粗糙度與細菌附著之間并沒有直接關(guān)聯(lián)。同樣地，盡管一些研究證明親水性表面比疏水性表面更容易促進細菌黏附，但一些測試疏水性效果的研究中卻得到完全相反的結(jié)果。此外，食品加工過程中最常見的接觸材料是304不銹鋼，因其具有較好的耐腐蝕、耐高溫、易于清潔且價格低廉的優(yōu)點而被廣泛使用。然而，隨著使用時間的延長，不銹鋼表面容易出現(xiàn)裂縫或裂紋，反而成為細菌生物被膜的“庇護所”。實驗結(jié)論的差異性可能是由于實驗條件和細菌菌株的不同，也可能是多種因素共同制約的結(jié)果。

食品基質(zhì)也是影響生物被膜形成的關(guān)鍵因素之一。例如，鮭魚含有豐富的蛋白質(zhì)、脂肪和碳水化合物，有利于微生物的生長和繁殖，進而促進單增李斯特菌與熒光假單胞菌混合生物被膜在其表面定植。牛奶中的乳糖通過激活LuxS介導的群體感應(yīng)（quorum sensing，QS）系統(tǒng)促進細胞間的黏附，進而增強枯草芽孢桿菌生物被膜的形成。此外，牛奶中較高濃度的Ca與Mg也能促進嗜熱菌屬生物被膜的形成。另一方面，不同食品基質(zhì)中形成混合菌生物被膜的微生物也有所差異。金黃色葡萄球菌也被稱作“嗜肉菌”，極易作為優(yōu)勢菌在高蛋白乳制品與肉制品表面形成混合菌生物被膜；單增李斯特菌與腐敗希瓦氏菌是冷鏈食品加工或貯存過程中最常見的“嗜冷菌”，能夠在設(shè)備或冷藏食品表面形成生物被膜，黏附數(shù)月甚至長達數(shù)年，進而導致交叉污染和食品腐敗變質(zhì)；果蔬加工中的主要污染源是由多種真菌和細菌形成的混合生物被膜。因此，食品基質(zhì)是探究混合菌生物被膜形成必不可少的影響因素。

外在環(huán)境條件包括溫度、pH值、營養(yǎng)條件與氧氣等也在生物被膜的形成過程中發(fā)揮著重要作用。Pang Xinyi等研究發(fā)現(xiàn)與4 ℃相比，15 ℃下單增李斯特菌與鮭魚表面土著菌形成的混合菌生物被膜更致密，另外該團隊還發(fā)現(xiàn)混合菌生物被膜在鮭魚汁中的形成能力顯著強于胰蛋白酶大豆肉湯培養(yǎng)基。最近有研究探究了環(huán)境條件和營養(yǎng)條件（pH值、溫度、營養(yǎng)物）對單菌和混合菌生物被膜生長的影響，結(jié)果表明，混合菌生物被膜生長的最佳pH值為7，酸性或堿性條件都會顯著抑制其生長。此外，生物被膜最佳生長溫度在25～35 ℃之間，營養(yǎng)物濃度升高反而導致生物被膜形成減少。

細菌自身特性也是影響生物被膜形成的主要因素之一。不同種屬類型的細菌，甚至是同種細菌之間生物被膜的形成能力差異很大。因為不同微生物之間具有菌株異質(zhì)性，例如細胞疏水性、細菌附屬物（菌毛與鞭毛）、細胞膜成分（脂多糖與蛋白質(zhì)）以及分泌EPS的能力。Liu Xing等發(fā)現(xiàn)與無鞭毛的硫還原地桿菌相比，有鞭毛的菌株能夠增加生物被膜內(nèi)的電子擴散速率，進而增強生物被膜的形成能力。Tan Lijun等研究了副溶血性弧菌與腐敗希瓦氏菌單菌和雙菌生物被膜的動態(tài)形成過程，結(jié)果發(fā)現(xiàn)腐敗希瓦氏菌具有更多的呼吸代謝系統(tǒng)，能夠產(chǎn)生大量的EPS進而促進生物被膜生物量的增加。不同血清型和基因型菌株之間生物被膜形成能力也具有顯著差異，這表明遺傳背景也是影響生物被膜形成的重要因素之一。此外，在混合菌生物被膜中，不同細菌群落間往往伴隨著復雜的相互作用，進而影響彼此生物被膜的形成。總之，混合菌生物被膜的形成不是某種單一因素作用的結(jié)果，而是受到多種因素的共同調(diào)控。明確混合菌生物被膜形成的影響因素有助于從源頭陰斷生物被膜形成，從而降低其在食品工業(yè)中帶來的風險。

2 混合菌生物被膜間的相互作用

混合菌生物被膜中不同微生物群落間往往伴隨著復雜強烈的相互作用，進而影響生物被膜的結(jié)構(gòu)、發(fā)展和功能。這些相互作用可以是競爭或者協(xié)同的。探究混合菌生物被膜間的相互作用有助于靶向制定更有效的抗菌策略來控制生物被膜的形成。

2.1 競爭性相互作用

競爭性相互作用是指混合菌生物被膜中不同的微生物群落對有限的養(yǎng)料、生存空間和重要的代謝分子（如螯合劑、表面黏附素、多糖、信號分子和消化酶）等公共資源進行爭奪或者通過分泌抑制其他群落生長的化合物的一種作用方式。在混合菌生物被膜中，一些細菌群落之間具有相同或相似的代謝需求，其中競爭性細菌通過積極消耗公共資源或產(chǎn)生抑菌物（細菌素、酶、過氧化氫和有機酸等）來降低其他菌株的適應(yīng)性。例如，Pang Xinyi等研究發(fā)現(xiàn)，新鮮鮭魚肉湯中的土著微生物與單增李斯特菌爭奪混合生物被膜中的營養(yǎng)物質(zhì)導致單增李斯特菌的細胞數(shù)量顯著減少。假交替單胞菌屬常是混合菌生物被膜中的優(yōu)勢競爭者，因為它能夠產(chǎn)生一種抗菌蛋白（AlpP）殺滅競爭者中的敏感菌株。細菌黏附是另外一種競爭方式，有利于細菌細胞與非黏附細胞競爭。據(jù)報道，霍亂弧菌的EPS產(chǎn)生細胞具有高黏附性，在混合菌生物被膜中形成團簇并強制去除非EPS產(chǎn)生細胞。運動性也是混合菌生物被膜中重要的競爭手段，它通?？梢栽鰪娂毦鷮︷B(yǎng)分的利用率，幫助破壞其他細菌形成的生物被膜。許多細菌通過VI型分泌系統(tǒng)（T6SS）競爭排除其他細菌群落。與單菌生物被膜相比，銅綠假單胞菌的T6SS和Psl胞外多糖在18 種菌株的生物被膜群落中被高度誘導，使其在混合菌生物被膜中比其他細菌更具有生長和適應(yīng)性優(yōu)勢。細菌獲得競爭優(yōu)勢的另一個重要策略是通過快速占據(jù)可用的黏附位點來避免其他菌株的定植黏附，稱為“表面覆蓋”。Chen Ping等通過熒光原位雜交技術(shù)對副溶血性弧菌與單增李斯特菌混合生物被膜的空間分布進行定位，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在混合生物被膜空間中單增李斯特菌位于副溶血性弧菌的下方，并占據(jù)了大部分的接觸表面，這導致副溶血性弧菌的生物量與代謝活力顯著下降。此外，銅綠假單胞菌迅速蔓延到接觸表面并通過聚集和運動來防止根癌農(nóng)桿菌的黏附，而銅綠假單胞菌運動缺陷基因突變體則無法在混合菌生物被膜形成中排除根癌農(nóng)桿菌。

2.2 協(xié)同性相互作用

當混合菌生物被膜體系中所有微生物群落因其他微生物存在而以某種方式受益時，細菌間的作用方式稱之為協(xié)同性相互作用（也稱共生性相互作用）。協(xié)同性相互作用在混合菌生物被膜中非常普遍，通常會導致生物被膜形成的增加。Tan Lijun等發(fā)現(xiàn)副溶血性弧菌與腐敗希瓦氏菌共培養(yǎng)時，混合生物被膜的生物量、活菌數(shù)與細胞活力顯著高于單菌生物被膜。Chen Xiaoxue等也報道了在生肉加工環(huán)境中，金黃色葡萄球菌與產(chǎn)酸克雷伯菌雙菌生物被膜的形成能力較單菌顯著增強。甚至有一些細菌在單獨培養(yǎng)時不會形成生物被膜，但與其他種類的細菌共培養(yǎng)后卻開始形成生物被膜?；旌暇锉荒f(xié)同作用的一種方式是細菌群落共同抵抗外界極端環(huán)境壓力。Piccardi等通過使用數(shù)學模型等工具揭示了4 種細菌的混合生物被膜能夠降解金屬加工液、工業(yè)冷卻劑和潤滑劑等有毒化合物的機制，認為每種菌株的解毒作用促進自身生存同時使其他菌株受益，從而協(xié)同促進菌株彼此更好地生長和降解有毒化合物。另一種協(xié)同作用方式是一種或幾種細菌分泌EPS基質(zhì)并被其他細菌群落積極利用。細菌生物被膜中的EPS提供穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)和群落生存的動態(tài)微環(huán)境，是抵御外界環(huán)境刺激的庇護所。EPS賦予微生物群落間發(fā)生協(xié)同相互作用的基礎(chǔ)，包括物理（黏附力、機械穩(wěn)定性、保護性）、化學（pH值、氧氣、無機離子、代謝物、信號分子）和毒力特性（抵抗殺菌劑和增加致病力）。據(jù)報道，在銅綠假單胞菌與肺炎克雷伯菌形成的混合菌生物被膜中，通過分泌3 種胞外多糖（海藻酸鹽、Psl和Pel）增強整個群落對外界環(huán)境應(yīng)激的響應(yīng)能力。類似地，EPS中通過產(chǎn)生某些酶類（如-內(nèi)酰胺酶）或抗性質(zhì)?？梢员Ｗo整個混合菌生物被膜群落免受抗生素的侵害。此外，營養(yǎng)代謝物的相互利用也是一種協(xié)同作用方式，簡單來說就是混合菌生物被膜群落中一種或幾種細菌的代謝產(chǎn)物可以被其他細菌正向利用從而促進生物被膜的生長。Henson等在體外建立了多形擬桿菌、大腸桿菌與普拉梭菌3 種致病菌的混合生物被膜模型。乙酸鹽由大腸桿菌和多形擬桿菌產(chǎn)生并由普拉梭菌所利用；二氧化碳由多形擬桿菌和普拉梭菌產(chǎn)生并被大腸桿菌與普拉梭菌消耗；乙醇由大腸桿菌產(chǎn)生被多形擬桿菌所利用。混合菌生物被膜群落間的代謝交叉利用成為了整個細菌群落間發(fā)生協(xié)同作用的驅(qū)動力。總之，混合菌生物被膜間的相互作用受到多種因素的綜合影響，這些因素取決于微生物自身和環(huán)境，進而影響著生物被膜的形成、結(jié)構(gòu)與功能。探究混合菌生物被膜相互作用機制，有助于靶向設(shè)計開發(fā)新型抗菌策略，從而徹底根除混合菌生物被膜在食品工業(yè)中的污染。

3 混合菌生物被膜的新型控制策略

混合菌生物被膜是食品安全相關(guān)的一個重大問題，因此廣大學者對減少混合菌生物被膜在食品工業(yè)環(huán)境中的污染進行了廣泛的研究?？刂苹旌暇锉荒鹘y(tǒng)的方法主要是熱殺菌（高壓蒸汽滅菌、微波加熱等）與化學消毒（氯、過氧化氫、過氧乙酸和抗生素等）。然而熱殺菌或化學消毒具有很大的弊端：破壞或改變食品原有品質(zhì)、對食品加工設(shè)備有腐蝕作用、使細菌產(chǎn)生耐藥性以及化學殘留，容易對人體健康造成嚴重危害等。因此，開發(fā)混合菌生物被膜新型控制策略顯得尤為重要。以下總結(jié)了一些近年來針對混合菌生物被膜的物理、化學和生物的綠色新型控制策略（圖2）。

圖2 混合菌生物被膜的新型控制策略Fig. 2 Novel control strategies for mixed-species biofilms

3.1 物理方法

3.1.1 光動力技術(shù)

光動力技術(shù)（photodynamic technology，PDT）是近年來從臨床醫(yī)學領(lǐng)域應(yīng)用到食品工業(yè)上的新興抗菌策略。在氧氣存在的條件下，光敏劑被特定波長的光照射后其分子激發(fā)到高能量狀態(tài)，在返回基態(tài)的過程中與鄰近分子發(fā)生碰撞，產(chǎn)生高能量分子活性氧（reactive oxygen species，ROS）。ROS能破壞脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和核酸等大分子結(jié)構(gòu)進而導致細胞死亡。

本課題組近年來對PDT滅活多種食源性致病菌與腐敗菌進行了廣泛深入的研究。目前已證明PDT對副溶血性弧菌、單增李斯特菌、沙門氏菌、腐敗希瓦氏菌等多種有害菌的浮游菌和生物被膜均具有顯著的滅活效果。此外，多位研究者也證實了PDT清除混合菌生物被膜的高效性。例如，Banerjee等發(fā)現(xiàn)核黃素介導的PDT對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌混合生物被膜有顯著抗菌作用。Tan Lijun等開發(fā)了一種PDT耦合弱堿性電解水高效清除混合菌生物被膜的新技術(shù)，在150 μmol/L光敏劑和4.56 J/cm能量照射下，PDT結(jié)合弱堿性電解水使混合菌生物被膜的生物量、活菌數(shù)和細胞活力分別顯著降低72.4%、3.51（lg（CFU/mL））和85.7%，此外，還發(fā)現(xiàn)該技術(shù)同樣能高效清除食品（魚鱗）或食品接觸表面（不銹鋼）上形成的混合菌生物被膜。PDT優(yōu)良的抗生物被膜功效使得其在食品保鮮、食品包裝、水體消毒等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用。此外，PDT還具有裝置簡單、成本低、效率高等優(yōu)點，更重要的是這種非熱殺菌技術(shù)不會導致細菌產(chǎn)生耐藥性。然而，由于食品和食品加工環(huán)境的多樣性，PDT在實際應(yīng)用時其抗菌或保鮮功效可能會受到影響。因此，未來對PDT的研究應(yīng)該聚焦于開發(fā)或篩選更加高效的新型光敏劑以及進一步探究PDT對食品品質(zhì)與營養(yǎng)特性的影響，以便于PDT在食品工業(yè)中大規(guī)模應(yīng)用。

3.1.2 冷大氣等離子體

等離子體是自然界中物質(zhì)的4 種基本狀態(tài)之一，主要包括分子、中性原子、帶電粒子、亞穩(wěn)態(tài)自由基和光子等活性成分。冷大氣等離子體（cold atmospheric plasma，CAP）被認為是一種快速、環(huán)保、節(jié)能和多功能的抗菌技術(shù)，其中的活性成分能協(xié)同滅活多種微生物并破壞生物被膜中的EPS基質(zhì)。近年來，CAP在食品工業(yè)等領(lǐng)域得到了廣泛的研究。

CAP也已被證明是控制混合菌生物被膜的新型策略之一。Patange等表明，用高壓CAP處理非生物表面上單增李斯特菌和熒光假單胞菌混合生物被膜，僅120 s后便無法檢測到存活細菌；而處理生菜上的混合菌生物被膜需要更長的時間，在封閉處理120 s后，單增李斯特菌與熒光假單胞菌數(shù)分別減少了2.2（lg（CFU/mL））與4.2（lg（CFU/mL））。Govaert等報道了CAP處理單增李斯特菌和鼠傷寒沙門氏菌混合生物被膜后，活菌數(shù)降低了1.5～2.5（lg（CFU/mL））。CAP目前在食品領(lǐng)域的應(yīng)用大多是在實驗室條件下對食品或食品接觸表面的抗菌研究，這主要與其過高的成本和對食品品質(zhì)容易產(chǎn)生不利的影響有關(guān)。因此，未來的研究應(yīng)不斷優(yōu)化CAP抗生物被膜的工藝與降低成本，這將有助于CAP在食品工業(yè)上的進一步應(yīng)用。

3.1.3 抗生物被膜材料

食品接觸表面的性質(zhì)決定了食品加工環(huán)境中生物被膜的形成與陰力。因此，通過改變接觸表面的理化性質(zhì)或?qū)佑|表面進行改性可以從源頭解決生物被膜形成的污染?？股锉荒げ牧鲜侵竿ㄟ^改變材料表面理化性質(zhì)或在表面涂層加入抗菌劑來抑制生物被膜生長的一種新型功能性材料。

食品工業(yè)中常見的接觸材料包括食品加工器械/管道、食品包裝等。類金剛石碳涂層由于其高硬度、低摩擦、化學惰性、高耐磨性和防污性能，已成為食品工業(yè)中不銹鋼的替代品。有研究表明，類金剛石涂層對大腸桿菌與成團泛菌混合生物被膜形成具有良好的抑制效果。此外，牛奶板式換熱器會導致蛋白質(zhì)變性，進而形成污垢，同時也加速了細菌在表面的黏附，并最終導致生物被膜的形成。Jindal等比較了常規(guī)不銹鋼板式換熱器與改良表面的板式換熱器在牛奶殺菌過程中生物被膜的形成情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)改良板式換熱器表面的生物被膜活菌顯著低于不銹鋼表面。生物表面活性劑在接觸表面可以改變其疏水性，進而影響生物被膜的形成。例如，線性低密度聚乙烯中加入的聚((叔丁基氨基)-甲基-苯乙烯)后，不僅能完全抑制單增李斯特菌生物被膜的形成，還顯著延遲了金黃色葡萄球菌與大腸桿菌混合生物被膜的定植。抗生物被膜材料能夠從源頭降低混合菌生物被膜的污染，因此，未來應(yīng)進一步開發(fā)安全、高效、價格低廉的抗生物被膜復合材料，以更好地應(yīng)用到食品加工器械/管道與食品包裝等領(lǐng)域。

3.2 化學方法

3.2.1 天然產(chǎn)物

許多植物來源的天然產(chǎn)物因為具有特殊的化學結(jié)構(gòu)而表現(xiàn)出一定的抗菌和抗生物被膜活性。天然產(chǎn)物的抗生物被膜作用主要依靠抑制細胞的黏附和附著、陰斷EPS的形成以及減少毒力因子的產(chǎn)生，從而陰斷QS網(wǎng)絡(luò)和生物被膜的發(fā)展。

這些天然產(chǎn)物包括精油、姜黃素、酚酸和多酚化合物等。精油是一種天然化合物，可替代消毒劑用于控制混合菌生物被膜。Kerekes等報道了馬郁蘭精油對多種食源性致病菌與腐敗菌混合生物被膜形成具有良好的抑制效果。同樣地，在低濃度香芹酚的持續(xù)影響下，金黃色葡萄球菌和沙門氏菌形成的混合生物被膜未能發(fā)展為成熟的生物被膜，并且在高濃度香芹酚下完全無法形成生物被膜。因為香芹酚能干擾細菌生物被膜，導致細胞內(nèi)ATP和鉀離子泄漏，最終導致細胞死亡。值得注意的是，精油在實際應(yīng)用中可能會揮發(fā)出強烈的氣味，并且在消毒后難以沖洗干凈。然而，有研究者報道了一種名為“Satureja thymbra”的精油水溶膠對致病菌與腐敗菌混合生物被膜具有良好的抗菌作用。這種精油水溶膠在使用后很容易清洗干凈并且沒有刺鼻的氣味。其他植物來源的天然產(chǎn)物也具有抗生物被膜的功效。例如，在酚酸（阿魏酸和水楊酸）存在的情況下，蠟樣芽孢桿菌和熒光假單胞菌雙菌生物被膜的復原力和對外界環(huán)境刺激的抵抗力會降低，這可能是由于酚酸干擾了混合菌生物被膜形成時的相互作用。以上研究結(jié)果表明，不同植物來源的天然產(chǎn)物對多種有害菌混合生物被膜具有顯著抑制作用。現(xiàn)階段，從天然產(chǎn)物中提取有效抗菌成分作為食品防腐劑是各國的研究熱點。因此，未來的研究應(yīng)進一步評估天然產(chǎn)物作為食品防腐劑的安全性以及開發(fā)高效廉價的天然產(chǎn)物抗菌劑，旨在深入挖掘天然產(chǎn)物在食品工業(yè)中的真正潛力。

3.2.2 酸性電解水

電解水因成本低、對環(huán)境友好和應(yīng)用方便而被廣泛應(yīng)用于食品領(lǐng)域。大量研究表明，酸性電解水（acid electrolyzed water，AEW）對多種有害菌生物被膜及混合菌生物被膜具有優(yōu)良的抑制活性。AEW殺菌的主要機制是低pH值、高氧化還原電位（oxidation-reduction potential，ORP）與有效氯的協(xié)同作用。低pH值使細胞內(nèi)環(huán)境失衡更容易受到有效氯的影響，導致更多的次氯酸分子穿過細胞膜進入細胞破壞內(nèi)部關(guān)鍵結(jié)構(gòu)；而高ORP的氧化作用會損傷細胞膜或改變細胞的正常電子流，從而造成細胞損傷或死亡。

有研究表明，AEW對熒光假單胞菌屬生物被膜具有高效的抗菌活性，此外還發(fā)現(xiàn)AEW增加了細菌細胞膜的通透性，降低了膜電位、細胞內(nèi)ATP濃度與pH值，同時也破壞了EPS基質(zhì)并最終清除生物被膜。Hu Haijing等發(fā)現(xiàn)AEW隨著處理時間的延長對不銹鋼上腸炎沙門氏菌與熒光假單胞菌混合生物被膜的殺菌效果逐漸增強。由于AEW抗菌的高效性和自身特殊的性質(zhì)，使得其在食品工業(yè)中常被用于食品加工設(shè)備表面消毒與果蔬保鮮，包括抑制有害菌的生長、維持營養(yǎng)或化合物生物活性和去除農(nóng)藥殘留。然而，AEW因其低pH值與高有效氯濃度容易改變食品原有品質(zhì)。因此，降低AEW對食品品質(zhì)的影響以及推廣大型AEW生產(chǎn)設(shè)備的普及有利于擴大其在食品工業(yè)領(lǐng)域的應(yīng)用范圍。

3.3 生物方法

3.3.1 抗生物被膜酶

生物被膜的本質(zhì)是由EPS包裹的微生物聚集體，因此使用生物方法對抗生物被膜是一種“以子之矛，攻子之盾”的最佳策略之一。EPS基質(zhì)為嵌入生物被膜的細菌提供了“保護傘”，而使用抗生物被膜酶這種綠色抗菌劑可有效破壞EPS中的多糖、蛋白、脂質(zhì)和核酸，從而靶向根除生物被膜。抗生物被膜酶多與殺菌劑相結(jié)合，能夠瓦解EPS網(wǎng)絡(luò)，促進消毒劑與抗菌劑的滲透，中斷控制生物被膜形成和維持的細胞間通訊信號，也有助于減少化學試劑的使用、水消耗和能源成本。

目前用于去除生物被膜的酶主要包括蛋白水解酶、多糖降解酶、氧化還原酶和抗QS酶4 大類。蛋白水解酶主要用于水解EPS基質(zhì)中的各種蛋白質(zhì)或使細菌黏附在接觸面的一些黏附蛋白；多糖降解酶包括溶菌酶、纖維素酶和淀粉酶等，主要降解生物被膜中的多糖結(jié)構(gòu)；氧化還原酶可以靶向攻擊EPS中的eDNA，陰礙生物被膜的形成、成熟、擴散以及細胞間的連接；抗QS酶通過中斷生物被膜內(nèi)細胞間通訊，導致細胞群落代謝紊亂。由于酶特異性以及生物被膜基質(zhì)的復雜性，因此往往需要多種酶聯(lián)合使用才能高效去除混合菌生物被膜。然而，現(xiàn)階段抗生物被膜酶的高成本和低商業(yè)普及性限制了其在食品工業(yè)上的應(yīng)用。此外，食品工業(yè)中環(huán)境的復雜性，如溫度、pH值、食物殘渣、加工表面多樣性也是影響酶發(fā)揮功效的關(guān)鍵因素?？股锉荒っ甘且环N富有前景但又充滿挑戰(zhàn)的綠色新型抗菌策略，未來研究應(yīng)繼續(xù)優(yōu)化生產(chǎn)工藝，降低生產(chǎn)成本，并繼續(xù)深入探究其對生物被膜的作用機制及其與其他抗菌手段的協(xié)同抗菌作用，如結(jié)合光熱催化反應(yīng)、納米催化和金屬離子等協(xié)同抗菌策略，進而提高抗菌效力和特異性。

3.3.2 QS抑制劑

QS通過介導生物被膜細胞間的通訊，是調(diào)控生物被膜形成的重要因素。而QS抑制劑是中斷/陰礙QS系統(tǒng)的一類物質(zhì)，主要包括降解自誘導物的酶（如內(nèi)脂酶、酰胺酶、細胞色素氧化酶等）、一些天然化合物（如吲哚類及其衍生物、黃酮類、生物堿、有機硫化物等）與QS合成類似物（?；?高絲氨酸內(nèi)酯類似物）。

例如，已發(fā)現(xiàn)香蘭素（一種從植物中提取的天然化合物）是一種很有前景的QS抑制劑。在質(zhì)量濃度0.05、0.15 mg/mL和0.30 mg/mL香蘭素存在的條件下培養(yǎng)24 h后，混合菌生物被膜的生物量分別減少9%、25%和52%。進一步研究發(fā)現(xiàn)，香蘭素能夠顯著減少生物被膜中胞外多糖（17%）和胞外蛋白（28%）的產(chǎn)生。類似地，抗菌肽LL-37能夠使銅綠假單胞菌中QS失調(diào)，并抑制金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌混合生物被膜形成?，F(xiàn)階段，QS抑制劑主要應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖病害防控、食品保藏（如肉制品和果蔬制品）等。然而，QS抑制劑較強的特異性以及過高的成本導致其普適性和應(yīng)用性降低。此外，混合菌生物被膜內(nèi)部不同細菌之間的QS信號十分復雜，對QS抑制劑發(fā)揮作用產(chǎn)生很大的干擾。因此，未來需要進一步解析QS互作網(wǎng)絡(luò)調(diào)控機制，并開發(fā)新型高效的QS抑制劑，尤其是天然產(chǎn)物QS抑制劑，從而為靶向設(shè)計新型抗菌劑提供新的途徑。

3.3.3 噬菌體

噬菌體是一種在自然環(huán)境中存在的病毒，只感染細菌而不會對食品或人體等造成風險，是名副其實的細菌“捕食者”。噬菌體能夠攻擊生物被膜中的細菌，可以和宿主共存，將遺傳物質(zhì)整合到細菌基因組中，隨后噬菌體在細菌體內(nèi)復制，并最終裂解細菌并釋放出能夠感染更多細菌的噬菌體。因此，噬菌體是一種天然、高特異性和無毒的混合菌生物被膜新型控制策略。

當噬菌體與生物被膜接觸時，會進一步發(fā)生相互作用，結(jié)果取決于生物被膜細胞對噬菌體的敏感性和受體位點的可及性，因為致密的EPS屏障可能會隱藏這些受體位點。然而一些噬菌體能編碼EPS基質(zhì)降解酶，使其自身能夠滲透進入生物被膜進而與內(nèi)部細菌細胞相結(jié)合，并最終裂解細菌。一般情況下，多種噬菌體聯(lián)合使用往往顯示出更好地控制效果。Montso等評估了牛肉上多重耐藥的大腸桿菌生物被膜分別對8 種噬菌體和6 種噬菌體混合物的敏感性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，單個噬菌體和噬菌體混合物均能抑制大腸桿菌生物被膜的形成，噬菌體混合物則顯示出更高的抑制效率。目前噬菌體在食品工業(yè)中的具體應(yīng)用主要有鮮切食品的保鮮、水產(chǎn)養(yǎng)殖中的病害防控治療、畜禽產(chǎn)品的抑菌等。然而噬菌體控制混合菌生物被膜也會存在一定的局限性，因為噬菌體具有高度的特異性，在使用前往往需要對目標菌株進行鑒定。因此，需使用噬菌體混合物、工程噬菌體、酶類以及其他抗菌劑組合來克服這一障礙。此外，噬菌體控制生物被膜的效率容易受到外界環(huán)境因素（溫度、生長階段與噬菌體濃度等）的影響?？偠灾?，噬菌體抗菌技術(shù)將會是今后食品工業(yè)中防控混合菌生物被膜污染的重要手段之一，未來的研究需要進一步明確噬菌體在不同食品加工環(huán)境中與病原菌的相互作用、抗性等問題，以此來提高噬菌體抗菌的應(yīng)用效率。此外，闡明混合菌生物被膜如何影響噬菌體敏感性相關(guān)成分有助于提高其有效性和安全性。

4 結(jié) 語

混合菌生物被膜是食品工業(yè)中最常見的污染形式，然而現(xiàn)階段絕大多數(shù)研究都是基于單菌生物被膜。由于混合菌生物被膜形成的結(jié)構(gòu)與彼此間的相互作用極其復雜，因此，探究混合菌生物被膜形成和相互作用有利于更好地靶向制定生物被膜污染的防控策略。近年來，越來越多的研究開始聚焦于發(fā)展控制混合菌生物被膜的新策略以期應(yīng)對其帶來的潛在風險，進而促進食品安全可持續(xù)發(fā)展。本文基于食品工業(yè)中混合菌生物被膜的研究現(xiàn)狀，對未來混合菌生物被膜的研究方向提出以下幾點展望，旨在為制定混合菌生物被膜新型控制策略、徹底消除食品工業(yè)中混合菌生物被膜的污染提供新的見解和思路，從而更好地保障食品安全與公眾健康。

4.1 進一步揭示混合菌生物被膜間的相互作用

現(xiàn)階段對混合菌生物被膜相互作用的理解仍非常有限，進一步解析混合菌生物被膜群落間的相互作用對在食品工業(yè)中制定有效的生物被膜污染防控策略至關(guān)重要。因此，需要進一步了解混合菌生物被膜在食品及食品接觸表面的持久性、開發(fā)檢測混合菌生物被膜的新方法或工具來揭示混合菌生物被膜間的相互作用，從而建立更加高效的新型控制策略。

4.2 聯(lián)合多種新型控制策略根除混合菌生物被膜

雖然目前已有有效的混合菌生物被膜新型控制策略，但仍然無法徹底解決混合菌生物被膜在食品工業(yè)中的污染問題。因此，聯(lián)合兩種或兩種以上的方法來控制混合菌生物被膜的污染往往更加高效，不同的抗菌策略相互取長補短，進而發(fā)揮協(xié)同抗菌的功效。

4.3 推動混合菌生物被膜新型控制策略在食品工業(yè)中的應(yīng)用

上述控制策略在實驗室條件下都表現(xiàn)出良好的應(yīng)用潛力。然而，食品工業(yè)中生物被膜的真實情況往往比實驗室研究復雜得多，這些新興的控制策略可能在食品工業(yè)中應(yīng)用時會遭遇陰礙。首先，必須保證這些混合菌生物被膜新型控制策略是安全的；其次，必須保證這些方法與技術(shù)不會明顯改變或破壞食品原有的品質(zhì)；最后，必須保證它們在食品工業(yè)中的應(yīng)用性，包括可接受的成本、在各種食品加工環(huán)境下的可操作性等。推動混合菌生物被膜新型控制策略在食品工業(yè)中的應(yīng)用應(yīng)從以上3 個方面努力實現(xiàn)，從而提高食品質(zhì)量與安全，并最終保障公眾健康。