唐雨楠，史陳晨，楊 明，盛奎川，張璽銘

（浙江大學(xué)生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 310058）

細(xì)胞培育肉是指利用陸地動(dòng)物（雞、豬、牛、羊等）和海洋動(dòng)物（魚、蝦、蟹、龍蝦等）的細(xì)胞經(jīng)體外增殖、分化用以替代傳統(tǒng)食用肉類的組織（肌肉、脂肪、結(jié)締組織），又被稱為培養(yǎng)肉、培植肉、細(xì)胞肉、體外肉等。由于細(xì)胞培育肉潔凈、安全、營(yíng)養(yǎng)成分可調(diào)控且符合動(dòng)物福利理念，因此又稱清潔肉、定制肉、非動(dòng)物肉、新蛋白肉等。

如今，世界人口持續(xù)增長(zhǎng)、部分國(guó)家人均經(jīng)濟(jì)收入提升刺激肉品消費(fèi)需求上漲。因此，越來越多的研究機(jī)構(gòu)、業(yè)內(nèi)企業(yè)開始關(guān)注細(xì)胞培育肉研究，以期填補(bǔ)傳統(tǒng)屠宰肉品的供應(yīng)缺口。除供需問題外，基于傳統(tǒng)畜牧和漁業(yè)養(yǎng)殖生產(chǎn)肉品存在其他諸多問題與限制，如環(huán)境問題（土地和水體資源占用大、溫室氣體和污水排放多、養(yǎng)殖企業(yè)臭氣排放衍生的鄰避效應(yīng)等問題）、食品安全問題（存在人畜共患病傳染風(fēng)險(xiǎn)，過量使用激素、抗生素等）、生產(chǎn)效率問題（生產(chǎn)周期長(zhǎng)、從飼料到肉品的能量轉(zhuǎn)化率低、肉品占養(yǎng)殖所得個(gè)體體積比例低、生產(chǎn)過程易受動(dòng)物瘟疫影響造成產(chǎn)量不穩(wěn)定等）、食品營(yíng)養(yǎng)風(fēng)味問題（脂肪、膽固醇等比例難以調(diào)控等）、動(dòng)物福利問題（屠宰等過程對(duì)動(dòng)物造成諸多痛苦）。因此，亟需對(duì)細(xì)胞培育肉展開研究，獲得環(huán)境友好、低碳高效、成分營(yíng)養(yǎng)可調(diào)控的新一代蛋白，以實(shí)現(xiàn)對(duì)傳統(tǒng)肉品的替代升級(jí)。

全球和我國(guó)第一塊細(xì)胞培育肉分別在2013年由荷蘭馬斯特里赫特大學(xué)和2019年由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)制得。近年來，細(xì)胞培育肉領(lǐng)域發(fā)展迅猛，初創(chuàng)公司大量涌現(xiàn)，且商業(yè)化生產(chǎn)取得較大突破。世界范圍內(nèi)，美國(guó)Eat Just公司推出的細(xì)胞培養(yǎng)雞塊于2020年12月成為全球首款獲批售賣的細(xì)胞培育肉商品；以色列Future Meat Technologies公司已實(shí)現(xiàn)高密度雞肌肉細(xì)胞懸浮培養(yǎng)。2013年8月Mark Post教授研制出第一塊細(xì)胞培養(yǎng)牛肉，這種牛肉制作的漢堡成本高達(dá)33萬 美元/85 g，而2021年12月以色列Future Meat Technologies公司的細(xì)胞培養(yǎng)雞胸肉造價(jià)僅為15.45 美元/kg（約為同期中國(guó)白條雞售價(jià)的4～5 倍），細(xì)胞培育肉的成本顯著降低，但距離替代傳統(tǒng)畜牧養(yǎng)殖肉的最終目標(biāo)仍有差距。為進(jìn)一步降低細(xì)胞培育肉成本，需從細(xì)胞支架、非動(dòng)物源培養(yǎng)基、生物反應(yīng)器三方面進(jìn)一步攻關(guān)。

細(xì)胞培育肉支架是具有特定結(jié)構(gòu)、模擬細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）的生物材料，可為肌肉、脂肪等細(xì)胞體外培養(yǎng)提供3D生長(zhǎng)空間，同時(shí)促進(jìn)細(xì)胞貼附、生長(zhǎng)、增殖、分化甚至形成具有相應(yīng)紋理和微觀結(jié)構(gòu)的整塊組織。

細(xì)胞培育肉支架的研究至關(guān)重要，其原因在于：1）細(xì)胞培育肉的目標(biāo)細(xì)胞是貼附細(xì)胞，其在體內(nèi)對(duì)ECM、相鄰細(xì)胞構(gòu)成的環(huán)境敏感，在體外對(duì)接觸的基質(zhì)材料、培養(yǎng)基內(nèi)的各種生長(zhǎng)因子等環(huán)境同樣敏感。比如，基質(zhì)材料的部分性質(zhì)（如過高的硬度、疏水性）可能造成細(xì)胞貼附困難、凋亡等。再如，支架的定向結(jié)構(gòu)可誘導(dǎo)肌源細(xì)胞定向分化并獲得肌管組織。因此，需要研究并優(yōu)化支架的物理性質(zhì)和結(jié)構(gòu)，以使細(xì)胞良好、高效生長(zhǎng)，并分化成目標(biāo)組織。2）雖然支架已在組織工程等領(lǐng)域中得到較為成熟的研究與應(yīng)用，但是細(xì)胞培育肉領(lǐng)域需要在支架的可食用性、成本、規(guī)?；a(chǎn)潛力等方面進(jìn)行更多考量，因此研究者需要針對(duì)細(xì)胞培育肉應(yīng)用場(chǎng)景進(jìn)行支架設(shè)計(jì)的優(yōu)化與調(diào)控。

理想的細(xì)胞培育肉支架應(yīng)滿足如下需求：1）可支持細(xì)胞良好貼附、生長(zhǎng)，這是最根本的需求。2）確?？煞蛛x、可降解或者可食用。值得注意的是，可食用支架是最理想選擇，因?yàn)榭墒秤弥Ъ芸珊?jiǎn)化細(xì)胞培育肉的生產(chǎn)工藝，并且可輔助調(diào)控細(xì)胞培育肉產(chǎn)品的質(zhì)構(gòu)與口感。3）可提供一定的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值或膳食功能。4）具有良好的熱穩(wěn)定性，避免細(xì)胞培育肉在烹飪后結(jié)構(gòu)和力學(xué)性能因支架分解而發(fā)生明顯變化。5）可實(shí)現(xiàn)商業(yè)化、大規(guī)模生產(chǎn)，成本可接受。

已有細(xì)胞培育肉支架主要包括以下形式：1）多孔支架，即具有開放式孔隙的海綿結(jié)構(gòu)支架；2）纖維支架，是由納米纖維或微纖維構(gòu)成的支架；3）微載體，即內(nèi)部呈多孔狀、纖維狀或?qū)嵭牡那蛑榛虿灰?guī)則薄片，直徑在幾十到幾百微米不等；4）水凝膠，是具有高持水率的、呈凝膠狀的3D生物材料；5）生物墨水，是具有適宜流變特性的、容許細(xì)胞在其中生長(zhǎng)并保護(hù)細(xì)胞免受機(jī)械傷害的、用于3D打印的生物材料。

從原料而言，已有細(xì)胞培育肉支架的材料主要集中在膠原或明膠、大豆蛋白、海藻酸鹽、甲殼素或殼聚糖、瓊脂糖、纖維素、透明質(zhì)酸、去細(xì)胞化植物組織等。其中，膠原或明膠等動(dòng)物蛋白對(duì)細(xì)胞的親和力最佳，但是它們屬于動(dòng)物來源制品，而非動(dòng)物源明膠的制備成本高，不是細(xì)胞培育肉支架原料的最優(yōu)選擇；大豆蛋白等植物蛋白具備優(yōu)良細(xì)胞相容性且屬非動(dòng)物源材料，但是植物蛋白支架往往存在力學(xué)性能缺陷，常需要與其他材料復(fù)合使用；非動(dòng)物源的甲殼素或殼聚糖、瓊脂糖、纖維素、透明質(zhì)酸等多糖類材料力學(xué)強(qiáng)度較大，但是生物相容性不及膠原或明膠等蛋白，通常需要進(jìn)行化學(xué)改性或表面圖案修飾；去細(xì)胞化植物組織從化學(xué)成分角度而言幾乎相當(dāng)于纖維素，但是其保留有植物的復(fù)雜結(jié)構(gòu)，有助于細(xì)胞貼附、增殖或者可誘導(dǎo)細(xì)胞規(guī)則排列、分化。

纖維素作為細(xì)胞培育肉支架原料具有以下關(guān)鍵優(yōu)勢(shì)：1）纖維素豐富易得，是世界上含量最多的天然高分子多糖物質(zhì)，廣泛存在于植物細(xì)胞壁中，亦可通過微生物甚至動(dòng)物獲得；2）纖維素健康可食用，雖然纖維素?zé)o法被人體消化吸收，但是纖維素可以有效促進(jìn)胃腸道蠕動(dòng)，有益身體健康，同時(shí)纖維素屬于美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局認(rèn)證的“公認(rèn)安全”（generally recognized as safe，GRAS）物質(zhì)，在歐盟、中國(guó)、日本等地區(qū)同樣被允許添加到食品中；3）纖維素可實(shí)現(xiàn)規(guī)?；苽?，植物纖維素生產(chǎn)工藝早已在制漿造紙等行業(yè)中形成成熟體系，提供植物纖維素商品的知名公司包括挪威Borregard公司、日本Nippon Paper公司、加拿大Celluforce公司、加拿大Kruger公司、芬蘭Stora Enso公司、美國(guó)American Process公司、芬蘭UPM公司等。細(xì)菌纖維素（bacterial cellulose，BC）在菌株、培養(yǎng)條件、生物反應(yīng)器等影響產(chǎn)量的主要因素上已有眾多篩選與優(yōu)化，并且已成功實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，如中國(guó)海南椰國(guó)食品有限公司、美國(guó)CP Kelco公司，以及日本San-Ei Gen公司、Kusano Sakko公司；4）纖維素顏色為白色或近白色，無味，便于調(diào)色調(diào)味，從而模仿肉類的感官品質(zhì)。

纖維素支架在非細(xì)胞培育肉領(lǐng)域已有研究和應(yīng)用基礎(chǔ)。首先，纖維素在組織工程中已被廣泛研究并作為支架材料。比如，纖維素支架可培養(yǎng)心肌細(xì)胞，生成類心臟結(jié)構(gòu)組織；可培養(yǎng)MG-63骨肉瘤細(xì)胞用于骨組織工程；經(jīng)絲膠蛋白修飾的BC可支持腸神經(jīng)系統(tǒng)和腸道平滑肌細(xì)胞生長(zhǎng)，用于腸道修復(fù)等。其次，已有纖維素支架實(shí)現(xiàn)商業(yè)化生產(chǎn)并應(yīng)用于細(xì)胞體外培養(yǎng)、藥物遞送等。代表性纖維素支架商品包括Cytopore、Cellufine、MT、CelluForce NCC、BioCradle微載體、GrowDex水凝膠和GrowInk生物墨水。同時(shí)，已有初創(chuàng)公司推出專用于細(xì)胞培育肉的纖維素基支架，相關(guān)產(chǎn)品如澳大利亞Cass Materials公司的BC薄板、絮片和抓絨狀微載體。

本文介紹纖維素的結(jié)構(gòu)和基本理化特性，綜述纖維素基生物材料的制備方法，并對(duì)纖維素在細(xì)胞培育肉支架中的應(yīng)用挑戰(zhàn)與應(yīng)對(duì)策略進(jìn)行總結(jié)和展望，旨在為纖維素基生物材料在細(xì)胞培育肉領(lǐng)域的開發(fā)與應(yīng)用提供參考。

1 纖維素基細(xì)胞培育肉支架的原料

纖維素是由--吡喃型葡萄糖在1,4位以-糖苷鍵連結(jié)形成的無支鏈線性高分子物質(zhì)，分子式為(CHO)，優(yōu)勢(shì)構(gòu)象式如圖1所示。纖維素具有結(jié)晶區(qū)和無定形區(qū)，前者占比大、生物可及性低，因此需要破壞結(jié)晶結(jié)構(gòu)使纖維素易于改性。從化學(xué)結(jié)構(gòu)看，纖維素富含羥基。具體而言，纖維素鏈其中一個(gè)末端葡萄糖基的C1位具有苷羥基，這一羥基作為隱性醛基而在一定條件下具有高反應(yīng)活性；中間的每個(gè)葡萄糖基在C2、C3位具有仲醇羥基，C6位具有更易于反應(yīng)的伯醇羥基。纖維素獨(dú)特的化學(xué)結(jié)構(gòu)為其降解、酯化、醚化、接枝共聚等反應(yīng)提供了構(gòu)象基礎(chǔ)。同時(shí)，纖維素表面羥基基團(tuán)帶負(fù)電，并且有條件與其他物質(zhì)形成氫鍵結(jié)合。因此，纖維素有望通過眾多改性方式設(shè)計(jì)成具有多種功能的生物材料。

圖1 纖維素鏈的優(yōu)勢(shì)構(gòu)象Fig. 1 Dominant conformation of cellulose chain

1.1 植物纖維素

纖維素是植物細(xì)胞壁的主要成分，與半纖維素、木質(zhì)素等伴生，共同起到支撐、保護(hù)細(xì)胞等作用。植物纖維素的常見分離方式為酸水解和機(jī)械處理。根據(jù)尺寸形態(tài)，提取的纖維素包括代表性的兩類：纖維素納米晶（cellulose nanocrystals（CNC）或cellulose nanowiskers（CNW）或nanocrystalline cellulose（NCC））和纖維素納米纖維（cellulose nanofibers（CNF），亦稱nanofibrillated cellulose（NFC））。CNC是長(zhǎng)徑比在10～100的棒狀纖維素，主要由酸水解制得，其長(zhǎng)度在50～500 nm，直徑3～20 nm。CNF是長(zhǎng)徑比大于100的絲狀纖維素，主要由機(jī)械處理制得，可輔以化學(xué)或酶預(yù)處理，其長(zhǎng)度為500～10 000 nm，直徑小于100 nm。

受來源植物、分離方式、測(cè)量方法等影響，纖維素的聚合度（degree of polymerization，DP）呈現(xiàn)很大差異，其中農(nóng)業(yè)廢棄物（如蔗渣、麥秸）纖維素的DP約為1 000，木材纖維素的DP約為4 000～5 000，棉花纖維素的DP則在10 000左右。此外，植物纖維素的結(jié)晶度約為40%～60%。

1.2 細(xì)菌纖維素

除植物外，纖維素也可來源于微生物發(fā)酵，即BC。椰果的主要成分即為BC，近年來風(fēng)靡世界多國(guó)，被添加到飲料、糕點(diǎn)中或直接食用。BC具有天然高純度、高結(jié)晶度（70%～80%）、高DP（可達(dá)8 000）、高含水率（99%）、良好的生物相容性和可規(guī)?；a(chǎn)的特性，因而在食品、組織工程等領(lǐng)域受到越來越多的關(guān)注。BC是由特定類型的細(xì)菌發(fā)酵產(chǎn)生的纖維素?？缮a(chǎn)BC的典型菌種是醋酸菌科的木醋桿菌（，曾先后歸于Acetobacter、Gluconacetobacter），木醋桿菌也是研究BC合成的模式菌種?？缮a(chǎn)BC的大部分微生物具有致病性或未應(yīng)用于食品領(lǐng)域，因此在BC商業(yè)化生產(chǎn)中往往選擇醋酸菌科細(xì)菌作為發(fā)酵培養(yǎng)對(duì)象。

靜置培養(yǎng)的BC在培養(yǎng)體系氣-液界面形成片層狀凝膠膜，清洗后呈半透明乳白色。攪拌、振蕩等非靜態(tài)培養(yǎng)條件下，BC可呈現(xiàn)為球狀、橢球狀、星狀、絮狀或不規(guī)則團(tuán)塊狀。電子顯微鏡下，BC具有3D網(wǎng)狀纖維結(jié)構(gòu)，纖維間隙在納米級(jí)（直徑約100～300 nm）。這一間隙對(duì)細(xì)胞而言過小，細(xì)胞無法進(jìn)入材料內(nèi)部并生長(zhǎng)，因此用于細(xì)胞培育肉生物材料的BC必須經(jīng)歷結(jié)構(gòu)調(diào)整。由于BC是微生物在運(yùn)動(dòng)狀態(tài)下分泌的產(chǎn)物，其結(jié)構(gòu)直接與微生物運(yùn)動(dòng)方式相關(guān)，因此可通過限制微生物的運(yùn)動(dòng)空間或運(yùn)動(dòng)方向而得到不同結(jié)構(gòu)的BC，這可通過控制微生物發(fā)酵條件、生物反應(yīng)器構(gòu)造來實(shí)現(xiàn)。比如，用中心或/和外部透氧的管式生物反應(yīng)器可得到形狀類似血管的管狀BC。

2 纖維素基細(xì)胞培育肉支架的制備方法

已有文獻(xiàn)綜述了細(xì)胞肉支架的制備方法，其中用于制備多孔支架的方法有顆粒浸出、熔融成型、冷凍干燥、發(fā)泡等；用于制備纖維支架的方法有濕法紡絲、靜電紡絲、旋轉(zhuǎn)噴射紡絲等；用于制備水凝膠的方法有酶促凝膠化、熱凝膠化、光聚合和離子交聯(lián)凝膠化等；3D打印、去細(xì)胞化、擠出成型等方法也可用于細(xì)胞肉支架制備；用于制備球形結(jié)構(gòu)的方法有乳化、微流控等。上述制備方法中，可適用于纖維素（可能需要其他可食用材料輔助）的方法有冷凍干燥、發(fā)泡、酶促凝膠化、熱凝膠化、光聚合和離子交聯(lián)凝膠化、3D打印、植物去細(xì)胞化，其他方法因可能引入大量不可食用溶劑而不宜使用。以往文獻(xiàn)主要從支架類型的角度進(jìn)行介紹，而支架結(jié)構(gòu)直接影響支架在細(xì)胞培育肉中的應(yīng)用場(chǎng)景。因此，本文以支架的各關(guān)鍵結(jié)構(gòu)為類別，按照多孔結(jié)構(gòu)、球形結(jié)構(gòu)、定向結(jié)構(gòu)、天然精密結(jié)構(gòu)、可定制結(jié)構(gòu)，依次介紹以纖維素為原料的細(xì)胞培育肉支架制備方法。

2.1 多孔結(jié)構(gòu)制備方法

為滿足細(xì)胞3D培養(yǎng)，生物材料應(yīng)當(dāng)具有尺寸適宜的連通多孔結(jié)構(gòu)。如果孔隙過小，細(xì)胞將無法遷移至材料內(nèi)部，一些大分子營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)運(yùn)輸也將存在問題；然而，如果孔隙過大，則細(xì)胞生產(chǎn)效率降低。因此，接近但略大于細(xì)胞尺寸的孔隙的制備方法在該領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用，常見方法包括冷凍干燥、發(fā)泡、犧牲材料、鹽析等。

2.1.1 冷凍干燥法

冷凍干燥是材料造孔的常見手段之一，多用于制備多孔支架。其原理是：首先，在水凝固點(diǎn)以下，材料中的水分子凍結(jié)成冰晶，將周圍的分子鏈排斥。然后，在高真空度下，冰晶直接升華為水蒸氣離開體系，此前冰晶膨脹形成的孔洞得以保留。需要注意的是，整個(gè)材料基質(zhì)中孔的尺寸均一性受降溫速率制約，較慢的降溫速率有助于形成均一的等軸晶粒，這將對(duì)無定向排列要求的細(xì)胞（如脂肪細(xì)胞）生長(zhǎng)而言更有利。

Abraham等以水為溶劑，對(duì)乙酰化CNC進(jìn)行冷凍干燥制備多孔支架，支架內(nèi)孔徑為0.1～10.0 μm，纖維素在冰模板的空間擠壓下形成厚度為40～80 nm的相互連通的薄片層。遺憾的是，該研究并未驗(yàn)證生物相容性。

Xing Qi等用凍干法制備了纖維素微纖維-明膠多孔支架，冷凍溫度為-20 ℃。所得支架內(nèi)部孔徑約為70 μm，孔隙率約為70%，楊氏模量在1～3 MPa（對(duì)應(yīng)樣品中纖維素含量50%～75%）。經(jīng)過28 d培養(yǎng)，人間充質(zhì)干細(xì)胞（human mesenchymal stem cells，hMSCs）在支架中增殖活躍，大量表達(dá)F-肌動(dòng)蛋白和細(xì)胞外分子網(wǎng)絡(luò)，并且呈現(xiàn)出沿纖維素纖維排列的趨勢(shì)。隨后進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，支架允許hMSCs細(xì)胞成功分化為成骨細(xì)胞或脂肪細(xì)胞。然而，明膠源自動(dòng)物，且研究中為使明膠交聯(lián)而加入了不可食用的1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺（1-ethyl-3-(3-dimethyl aminopropyl) carbodiimide，EDC）和-羥基琥珀酰亞胺（-hydroxysuccinimide，NHS）。

冷凍干燥法簡(jiǎn)便易行，然而冷凍干燥法能耗大、成本高，如果應(yīng)用到細(xì)胞培育肉生物材料制備中，將為培養(yǎng)肉終產(chǎn)品的造價(jià)額外增加一筆負(fù)擔(dān)。同時(shí)，對(duì)于大體積樣品，冷凍干燥法的效率低，且難以保證材料內(nèi)部造孔均勻度。

2.1.2 發(fā)泡法

發(fā)泡法是向材料中加入在物理或化學(xué)作用下可產(chǎn)生氣泡或釋放氣體的物質(zhì)，從而在材料中造孔的方法?，F(xiàn)有發(fā)泡劑包括物理發(fā)泡劑、化學(xué)發(fā)泡劑、表面活性劑。發(fā)泡法主要優(yōu)點(diǎn)在于能夠制備出清晰的多孔結(jié)構(gòu)。然而其缺點(diǎn)包括：1）孔隙尺寸范圍大，不易調(diào)控；2）易產(chǎn)生閉孔，孔隙連通性有限；3）孔隙分布不均勻。

物理發(fā)泡劑以超臨界CO為代表。Ju Jiajun等利用超臨界CO進(jìn)行兩步減壓制備出具有雙峰開放式孔隙結(jié)構(gòu)的聚丁二酸丁二醇酯-CNC支架，其中含5% CNC的支架由直徑分別為約68.9 μm和約11.0 μm的孔組成，具有較高的開放孔隙率（95.2%）。雖然該研究中的聚丁二酸丁二醇酯不在可食用范疇，但是物理發(fā)泡法本身不影響支架食用性，成本和能耗低，可實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。對(duì)于化學(xué)發(fā)泡劑，其分解溫度應(yīng)低于纖維素及可食用衍生物（如羧甲基纖維素（carboxymethyl cellulose，CMC）、微晶纖維素（microcrystalline cellulose，MCC）、甲基纖維素（methyl cellulose，MC）、羥丙基甲基纖維素（hydroxypropyl methyl cellulose，HPMC））的初始分解溫度（約為230～360 ℃），以保證纖維素生物材料主體的結(jié)構(gòu)和力學(xué)性能完好。此外，考慮到細(xì)胞培育肉生物材料的可食用性，引入的發(fā)泡劑不應(yīng)殘留有毒有害物質(zhì)或令人不快的味道和氣味，本身應(yīng)當(dāng)允許添加到食品中。因此，僅有碳酸氫鈉等少數(shù)發(fā)泡劑可供選擇。同時(shí)，為獲得開放式多孔生物材料，應(yīng)注意發(fā)泡劑的種類選擇、添加量與發(fā)泡工藝。

2.1.3 犧牲材料法

犧牲材料法是將非纖維素材料制成微球，并在纖維素生物材料制備過程中加入，以起到占位作用。待纖維素生物材料成型后，再將犧牲材料去除，從而留下與微球尺寸接近的孔洞。犧牲材料法與前述發(fā)泡法均可劃歸于使用致孔劑，但二者原理存在差異。發(fā)泡法是由致孔劑以物理或化學(xué)方式生成氣體從而造孔，而犧牲材料法是致孔劑固體本身以物理方式占據(jù)空間，隨后被除去從而造孔。犧牲材料法操作較為簡(jiǎn)單，但是通常需要高比例添加犧牲材料方可實(shí)現(xiàn)較高的孔隙率和孔的開放程度，因此如果犧牲材料無法回收并重復(fù)利用則損耗較高，并且犧牲材料成本將直接影響纖維素生物材料的造價(jià)。此外，對(duì)于細(xì)胞相容性欠佳的犧牲材料，應(yīng)進(jìn)行更為徹底的純化操作以避免殘留物影響纖維素生物材料培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)的活性。

B?ckdahl等使用石蠟顆粒（直徑90～500 μm）和土豆淀粉顆粒（直徑5～100 μm）作為犧牲材料，將其加入的發(fā)酵體系中，待生成BC后去除犧牲材料顆粒得到多孔BC支架，用于培養(yǎng)平滑肌細(xì)胞。然而該支架純化時(shí)需添加表面活性劑和酶，這將對(duì)支架的可食用性和成本造成不利影響。Yin Na等將瓊脂糖微球作為犧牲材料嵌入逐層生長(zhǎng)的菌膜中，得到多孔BC支架。

2.1.4 鹽析法

鹽析法，即以鹽結(jié)晶（常用氯化鈉）作為犧牲材料進(jìn)行占位造孔的方法。相比于前述的犧牲材料法，鹽析法成本更低，且易于純化（用水即可浸出NaCl），不引入有毒有害的化學(xué)物質(zhì)。Kanimozhi等將殼聚糖-聚乙烯醇-CMC用水復(fù)配，加入200～500 μm的NaCl顆粒后風(fēng)干，再用水去除NaCl并風(fēng)干，得到13.6～15.5 μm的多孔支架，該支架的孔徑、孔隙率、孔開放程度均高于冷凍干燥法的對(duì)照組別。

2.2 球形結(jié)構(gòu)制備方法

纖維素制備微球的常用方式包括乳化、微流控，這些方法在前人綜述中已有充分介紹。Zhang Chunmei等采用油包水乳化結(jié)合冷凍干燥的方法制得聚乙烯醇/CNF多孔微球。該微載體的直徑約為500 μm，孔徑為25 μm，堆積密度為4.7 mg/cm，BET（Brunauer-Emmett-Teller）理論比表面積為44 m/g，孔隙率為99.6%。經(jīng)NIH 3T3細(xì)胞測(cè)試，培養(yǎng)10 d后細(xì)胞在微球表面生長(zhǎng)良好，部分細(xì)胞可遷移至微球內(nèi)部孔隙中。該微載體的主要優(yōu)勢(shì)在于乳化工藝有利于實(shí)現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)。然而，該微載體制備時(shí)使用的戊二醛交聯(lián)劑不可食用，且甲苯油相存在殘留隱患造成不可食用問題。

針對(duì)用于細(xì)胞培育肉的纖維素基球狀生物材料制備，上述方法的主要問題在于需消耗大量溶劑，這些溶劑大多數(shù)無法食用或者去除工藝繁瑣。如有殘留不僅可能危害人體健康，還可能對(duì)材料的親水性、粗糙度、表面電荷和官能團(tuán)的暴露程度等表面性能產(chǎn)生負(fù)面影響，陰礙細(xì)胞在材料上的貼附與生長(zhǎng)。此外，上述方法需結(jié)合其他方法使微球形態(tài)固定化，對(duì)于對(duì)酸、堿、溫度、pH值相對(duì)不敏感的天然纖維素而言，輔助方法多為冷凍干燥。為此，可將上述方法與微生物發(fā)酵原位生成纖維素的方式相結(jié)合，從而避免溶劑問題。如首先通過微流控法或乳化法制得含有產(chǎn)BC細(xì)菌的明膠微球，再以此構(gòu)建出空心微球空間供細(xì)菌生長(zhǎng)，從而形成纖維素微球（圖2）。此外，為規(guī)避有毒及難除溶劑問題，少數(shù)研究制備的纖維素微球可食用，但是顆粒直徑往往偏大，如通過滴液法以NaOH水溶液為溶劑制得的纖維素微球，平均直徑約在0.5～4.0 mm。微球直徑過大將導(dǎo)致實(shí)心微球的比表面積降低，多孔微球的物質(zhì)交換難度提升，不利于細(xì)胞的高效貼附與生長(zhǎng)。

圖2 原位生成纖維素微球[48-49]Fig. 2 In situ formation of cellulose microcarriers[48-49]

2.3 定向結(jié)構(gòu)制備方法

定向冷凍、機(jī)械拉伸等方式均可形成各向異性生物材料。

2.3.1 定向冷凍

定向冷凍又名冷凍鑄造，是在梯度溫度場(chǎng)下水或鹽溶液在固體材料內(nèi)結(jié)成冰晶從而創(chuàng)造平行于溫度梯度方向的定向通道的方法。其所創(chuàng)造的通道直徑主要受冷凍溫度因素影響。

Liaw等將羥基磷灰石與殼聚糖復(fù)合后進(jìn)行定向冷凍，分別在2、5 ℃/min的降溫速率下制備出直徑為10～100、1～50 μm的支架內(nèi)通道。另有研究將膠原蛋白溶液進(jìn)行定向冷凍，降溫速率為5 ℃/min，得到25～270 μm的支架內(nèi)通道。

Dai Rengang等用液氮進(jìn)行定向冷凍，制得各向異性絲素蛋白-CNC支架。隨著CNC質(zhì)量分?jǐn)?shù)上升到0.8%，支架的平均孔徑增大至17 μm?？紤]到絲素蛋白同樣可食用，絲素蛋白-CNC復(fù)合材料可作為細(xì)胞肉支架的原料。

Courtenay等以液氮為冷源，對(duì)陽離子化CNF進(jìn)行定向冷凍，得到具有定向、平滑微通道的支架，通道孔徑約為35 μm，纖維素壁厚約26 nm，楊氏模量可在不交聯(lián)狀態(tài)（0.1 MPa）到10%乙二醛交聯(lián)（50 MPa）范圍調(diào)整。在此基礎(chǔ)上將Pickering乳液與定向冷凍相結(jié)合，可以向支架的纖維素壁層中引入相互連通的孔隙。MG-63細(xì)胞測(cè)試表明，培養(yǎng)7 d后細(xì)胞可在支架上存活。需要注意，雖然陽離子化試劑縮水甘油基三甲基氯化銨有利于細(xì)胞附著、交聯(lián)劑乙二醛可增強(qiáng)支架力學(xué)性能，但是二者均不可食用。此外，該支架還使用其他不可食用有機(jī)物為溶劑，上述成分不應(yīng)添加于細(xì)胞肉支架中。

與冷凍干燥法相類似，定向冷凍法以冰為犧牲模板，在支架內(nèi)部創(chuàng)建定向通道，該方法簡(jiǎn)單、高效。但是隨著樣品體積增大（尤其是沿溫度梯度方向的長(zhǎng)度增加），確保樣品內(nèi)溫度梯度的一致性將更加困難，造成通道孔徑更加不均一（近冷源端樣品局部溫度梯度大，通道孔徑?。?，從而導(dǎo)致良好的通道長(zhǎng)度和通道孔徑均勻度無法兼得。這一問題削弱了定向冷凍法大規(guī)模生產(chǎn)定向支架（尤其是用于整塊肉的大尺寸支架）的潛力。

2.3.2 機(jī)械拉伸

機(jī)械拉伸法是對(duì)材料沿部分方向施加拉力，從而使材料沿拉伸方向具有更高取向性的方法。其定向效果受材料的力學(xué)性能（如彈塑性）、天然結(jié)構(gòu)、拉伸方式等因素影響。該法的最大優(yōu)點(diǎn)在于操作簡(jiǎn)單、快速，易于規(guī)?；?。Wang Sha等對(duì)BC膜施加40%應(yīng)力的濕拉伸，然后在60 ℃下熱壓以固定結(jié)構(gòu)，從而獲得高度定向排列的纖維結(jié)構(gòu)（圖3）。Mredha等在對(duì)單層材料進(jìn)行線性機(jī)械拉伸的基礎(chǔ)上，將多層已拉伸材料進(jìn)行平行層疊、正交層疊、軸向卷疊、同心卷疊，獲得4 種形式的具有各向異性結(jié)構(gòu)與力學(xué)性能的3D材料。這可用于制備各向異性的纖維素細(xì)胞培育肉支架，進(jìn)而生產(chǎn)可調(diào)控的、擁有多種紋理方向和多層次咀嚼感的全切肉。

圖3 經(jīng)40%應(yīng)力濕拉伸的BC薄膜側(cè)視圖[60]Fig. 3 Side view of 40% wet-drawn bacterial cellulose film[60]

2.3.3 針對(duì)BC的定向方法

除上述方法外，對(duì)于BC可采取以下特定方式獲得高取向性結(jié)構(gòu)：在產(chǎn)BC微生物的發(fā)酵培養(yǎng)過程中，通過引入條紋溝槽狀模板的方式將微生物的運(yùn)動(dòng)路徑限制在單向通道內(nèi)（模板法），或通過施加靜電場(chǎng)的方式誘導(dǎo)微生物沿電場(chǎng)力方向運(yùn)動(dòng)（電場(chǎng)法），或通過使用外壁透氧的圓柱形攪拌式生物反應(yīng)器（旋轉(zhuǎn)攪拌法），均可原位生成定向的BC支架。將帶有針狀陣列的模具放入微生物培養(yǎng)體系中靜態(tài)發(fā)酵（模具法），則可得到帶有定向孔道的BC。

2.4 天然精細(xì)結(jié)構(gòu)獲取——植物去細(xì)胞化

去細(xì)胞法是指將細(xì)胞生物組織或器官中的細(xì)胞內(nèi)容物去除以獲取ECM的方法，近年來在組織工程與再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域內(nèi)得到持續(xù)關(guān)注。這種方法是直接獲取而非模擬ECM，因此可獲得其他生物材料難以比擬的生物相容性，并且其原料往往廣泛易得。然而，如何完全去除DNA、RNA等可能引起免疫反應(yīng)的異體乃至異種物質(zhì)，同時(shí)盡可能多地保留ECM且不改變其結(jié)構(gòu)原貌，有待更多研究。此外，去細(xì)胞化試劑多數(shù)不可食用，殘留在用于細(xì)胞培育肉的生物材料中可能帶來食品安全隱患。目前，去細(xì)胞化的主要研究對(duì)象是動(dòng)植物而非微生物。從動(dòng)物福利、生產(chǎn)成本、去細(xì)胞化操作難度等方面考慮，應(yīng)用于細(xì)胞培育肉的去細(xì)胞化生物材料優(yōu)先以植物為原料。

植物的根、莖、葉作為營(yíng)養(yǎng)器官，具有可運(yùn)輸水和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的天然通道（直徑范圍大，可滿足生物材料的多種孔隙需求），而原有的薄壁細(xì)胞等細(xì)胞排列整齊。上述天然結(jié)構(gòu)在去除細(xì)胞內(nèi)含物后可通過遺留的細(xì)胞壁而維持，利于用作支架，輔助整塊細(xì)胞培育肉生產(chǎn)。細(xì)胞壁中的主要化學(xué)成分為天然纖維素，具有親水性、耐久性、生物相容性和可食用性。

對(duì)于植物原料，根、莖、葉、果實(shí)均已被研究用于制備去細(xì)胞化生物材料。其中，蔬菜、水果的莖、葉、果實(shí)在已有研究中更為常見。去細(xì)胞化可保留導(dǎo)管、維管束等特定組織的結(jié)構(gòu)，這些結(jié)構(gòu)將利于被接種細(xì)胞的附著、排列、遷移、分化，以及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)交換，因此該方法目前成為生物醫(yī)學(xué)工程的熱點(diǎn)話題（如替代器官），并且已在細(xì)胞培育肉領(lǐng)域用于制備支架。Allan等對(duì)觀賞草進(jìn)行去細(xì)胞化并用C2C12細(xì)胞測(cè)試細(xì)胞生長(zhǎng)效果，發(fā)現(xiàn)觀賞草的天然溝槽結(jié)構(gòu)使其具有優(yōu)越的誘導(dǎo)細(xì)胞定向能力（與草葉溝槽夾角＜10°的細(xì)胞占50%，夾角＜20°的細(xì)胞占70%）。Jones等用富含維管網(wǎng)絡(luò)的去細(xì)胞化菠菜葉培養(yǎng)初級(jí)牛衛(wèi)星細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)該支架上的細(xì)胞可以較長(zhǎng)時(shí)間（14 d）保持高細(xì)胞活性（99%）。對(duì)于植物去細(xì)胞化常用植物種類與部位、方法與試劑等內(nèi)容細(xì)節(jié)，可參考已有綜述，此處不再贅述。

去細(xì)胞化用于生物醫(yī)學(xué)材料的優(yōu)點(diǎn)包括：1）與體內(nèi)ECM高度近似，具有良好的細(xì)胞相容性；2）該過程脫除細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)等細(xì)胞器，從而去除大多數(shù)免疫活性成分、DNA等物質(zhì)，因此具有低排異性或副作用。

去細(xì)胞化用于細(xì)胞培育肉支架材料的優(yōu)點(diǎn)則在于以下4 個(gè)方面：1）去細(xì)胞化可充分利用植物去除原有細(xì)胞后留下的天然3D多孔結(jié)構(gòu)，有效簡(jiǎn)化支架制備過程，并且可為目標(biāo)細(xì)胞提供尺寸合適的生長(zhǎng)空間和真實(shí)的細(xì)胞外環(huán)境；進(jìn)一步地，去細(xì)胞化有助于構(gòu)建一些常規(guī)手段難以獲得的精密、復(fù)雜的微觀支架結(jié)構(gòu)，如導(dǎo)管、維管束等，這些定向結(jié)構(gòu)可以誘導(dǎo)細(xì)胞定向排列并實(shí)現(xiàn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)輸送，利于整塊細(xì)胞培育肉組織形成。2）若采用常見蔬果的莖、葉、果實(shí)進(jìn)行去細(xì)胞化，則原料來源廣泛、綠色天然、可再生、成本相對(duì)低廉、可食用，并可實(shí)現(xiàn)部分農(nóng)林廢棄物的高值化利用。3）一些去細(xì)胞化試劑（如乙醇、乙酸、氯化鈉、次氯酸鈉）和去細(xì)胞化方法（如物理低溫凍融，或化學(xué)浸漬）成本低，并且易獲得、易實(shí)現(xiàn)，這有助于規(guī)?；a(chǎn)。4）一些去細(xì)胞化植物支架可以實(shí)現(xiàn)約95%及以上的高細(xì)胞活性。

但是同時(shí)，去細(xì)胞化用于細(xì)胞培育肉主要存在如下缺點(diǎn)或問題：1）目前主流的洗滌劑去細(xì)胞化方法所需處理時(shí)間較長(zhǎng)，不利于商品化，如十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）處理的菠菜葉從預(yù)處理到凍干結(jié)束，累計(jì)需要超過10 d。2）去細(xì)胞化支架的可食用性存疑。雖然目前研究中的原料優(yōu)選可食用的蔬果（如蘋果、菠菜、芹菜、蔥等），但是使用化學(xué)試劑法去細(xì)胞化會(huì)存在不可食用物質(zhì)殘留的風(fēng)險(xiǎn)（如表面活性劑SDS），因此應(yīng)關(guān)注化學(xué)試劑殘留量并與有關(guān)食品標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行比對(duì)。一些學(xué)者提到了有毒有害試劑的安全替代品（如用聚山梨酯60替代Triton X-100），但相關(guān)替代品的去細(xì)胞化效果有待進(jìn)一步證實(shí)。同時(shí)，一些化學(xué)試劑處理可能在支架中進(jìn)而在細(xì)胞培育肉產(chǎn)品中引入異味（如次氯酸鈉、乙酸）。此外，支架的營(yíng)養(yǎng)評(píng)定與感官評(píng)價(jià)需要被進(jìn)一步研究。3）同一種類原料的不同個(gè)體、同一個(gè)體的不同位置均會(huì)不可避免地存在變異性，造成不同批次支架差異，不利于商品標(biāo)準(zhǔn)化。4）對(duì)于表現(xiàn)出良好細(xì)胞活性的去細(xì)胞化植物支架，其成功因素主要被歸結(jié)于良好的孔隙結(jié)構(gòu)或定向微圖案，不具備這些物理優(yōu)勢(shì)的去細(xì)胞化植物支架的表現(xiàn)并不令人滿意。雖然后者可能仍與非結(jié)構(gòu)的物理特性有關(guān)（如表面親水性、彈性模量），但這似乎也再次印證了支架主要化學(xué)成分天然纖維素本身在細(xì)胞黏附性方面的不足。

2.5 定制化結(jié)構(gòu)獲取——3D打印

3D打印也被稱為增材制造、快速成型，是從計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)中獲取信息并在3D打印機(jī)上建立連續(xù)的材料層從而創(chuàng)建固體物體的技術(shù)。3D打印技術(shù)可分為7 種，其中食品領(lǐng)域較為接受的是熱熔/室溫?cái)D出、選擇性激光燒結(jié)/熱空氣燒結(jié)、黏結(jié)劑噴射、噴墨打印4 種。3D打印可減少原料損耗，并且可通過同一套設(shè)備制造具有多種復(fù)雜結(jié)構(gòu)的產(chǎn)品，這一“可自由定制”特性對(duì)用于細(xì)胞培育肉領(lǐng)域的生物材料目前所處的初期發(fā)展階段而言尤為重要，可幫助研究人員廣泛嘗試并篩選出適合的生物材料構(gòu)造。在生物醫(yī)學(xué)工程中，3D打印的應(yīng)用不斷擴(kuò)展，小到藥物遞送系統(tǒng)、微血管，大到人工器官乃至解剖模型（以輔助外科手術(shù)）。

如圖4所示，Erkoc等有研究者采用明膠-纖維素-海藻酸鹽復(fù)合配制生物墨水以兼顧墨水流變性、擠出成型后材料的力學(xué)性能、細(xì)胞相容性，然后通過擠出式3D打印制得多層三維填充的和空心的圓柱結(jié)構(gòu)、錐形結(jié)構(gòu)、帶有圓柱形和方形孔的網(wǎng)格結(jié)構(gòu)、解剖學(xué)仿人工耳4 種結(jié)構(gòu)的水凝膠。

圖4 擠出式3D打印獲得的不同結(jié)構(gòu)的明膠-纖維素-海藻酸鹽水凝膠[77]Fig. 4 Gelatin-cellulose-alginate hydrogels with different structures obtained by extrusion-based 3D printing[77]

如圖5所示，Mohan等僅選用纖維素及其衍生物（CMC、CNF）為原料，以水為溶劑制成墨水，利用3D打印、冷凍干燥和脫水熱處理方法制得物理交聯(lián)的、具有200～800 μm可調(diào)大孔網(wǎng)格結(jié)構(gòu)的支架。

圖5 孔徑可調(diào)控的3D打印CMC-CNF支架[78]Fig. 5 3D printed CMC-CNF scaffolds with adjustable pore size[78]

3 纖維素在細(xì)胞培育肉支架中的挑戰(zhàn)與潛在解決方案

3.1 細(xì)胞黏附性

天然纖維素表面的非特異蛋白吸附量低（即不含有RGD等細(xì)胞錨點(diǎn)），不利于哺乳動(dòng)物細(xì)胞黏附。這是纖維素作為細(xì)胞培育肉支架原料的最大挑戰(zhàn)。

引入RGD三肽（Arg-Gly-Asp）可增強(qiáng)纖維素的細(xì)胞黏附性。RGD是在ECM中發(fā)現(xiàn)的具有生物活性的細(xì)胞黏附序列，可以與細(xì)胞表面的整合素（介導(dǎo)細(xì)胞與ECM或與其他細(xì)胞的識(shí)別和黏附）特異性結(jié)合。因此，可以在纖維素表面修飾RGD肽或者含RGD的蛋白，如纖連蛋白、層黏連蛋白、玻連蛋白、膠原或明膠等。然而，RGD與纖維素等非蛋白物質(zhì)的吸附作用有限，為此可引入纖維素結(jié)合模塊（cellulose-binding module，CBM）（CBM既有對(duì)纖維素表面的高親和性與特異性，又有對(duì)幾乎任何生物活性蛋白的結(jié)合能力）作為橋梁，從而實(shí)現(xiàn)纖維素-RGD的牢固連接。

表面電荷改性可增強(qiáng)纖維素的細(xì)胞黏附性。一種方式是化學(xué)官能團(tuán)改性，如陽離子化（如引入季銨基團(tuán)）和強(qiáng)陰離子化（如引入-SO）。商業(yè)化支架中已有化學(xué)改性調(diào)節(jié)纖維素表面電荷的實(shí)例，如Cytopore微載體的主要成分是帶正電荷的二乙氨基乙基（diethylaminoethyl，DEAE）纖維素，而GrowDex-T水凝膠則是帶負(fù)電纖維素，二者細(xì)胞黏附性均獲得提升。采用該方法時(shí)需要注意，修飾的官能團(tuán)是否會(huì)損害纖維素可食用性。如季銨鹽雖然是提供陽離子、提升纖維素細(xì)胞黏附性的代表性物質(zhì)，但是季銨鹽通常不可食用，對(duì)應(yīng)改性纖維素不在批準(zhǔn)的食品添加劑范圍內(nèi)；而羧甲基基團(tuán)修飾的纖維素則可食用，且細(xì)胞黏附性獲得提升。除化學(xué)官能團(tuán)修飾外，另一種方式是將纖維素與其他陽離子物質(zhì)復(fù)合以改變表面電荷，如天然陽離子多糖——甲殼素或殼聚糖。這種復(fù)合可以是物理共混也可以是化學(xué)交聯(lián)，并且可以在纖維素獲取時(shí)（如加入BC培養(yǎng)體系）、纖維素原料預(yù)處理時(shí)（如與已獲取的纖維素共混制備支架）、纖維素支架制備后（如將支架浸泡）等多個(gè)環(huán)節(jié)之一進(jìn)行。

3.2 原料成本降低與規(guī)?；a(chǎn)

對(duì)于細(xì)胞培育肉行業(yè)，組織工程等領(lǐng)域的研究已經(jīng)為其提供了堅(jiān)實(shí)的技術(shù)基礎(chǔ)，因此目前更為迫切的問題是如何降低成本、擴(kuò)大規(guī)模。纖維素作為細(xì)胞培育肉支架的潛在材料，同樣需要思考這一問題。纖維素原料的成本可大致分為前期的生產(chǎn)成本和后期的純化成本。

對(duì)于植物纖維素，其資源豐富、廣泛、易得，商業(yè)化植物纖維素來源主要為木材、棉花，因此前端生產(chǎn)成本低廉。棉花中纖維素含量高達(dá)90%，但是木材中纖維素占比約40%～47%，纖維素所在的細(xì)胞壁中還含有半纖維素、木質(zhì)素、果膠等成分，因此需要進(jìn)行一系列提取純化操作以達(dá)到可食用支架所需原料的高純度和均一的特定纖維形態(tài)。目前，植物纖維素已形成成熟、低廉的提純工藝（主要為酸水解、機(jī)械處理兩種）。據(jù)有關(guān)研究顯示，植物納米纖維素（CNF、CNC）在世界范圍內(nèi)已實(shí)現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)且產(chǎn)量仍不斷擴(kuò)大，代表性企業(yè)的納米纖維素產(chǎn)量從20 kg/d（荷蘭SAPPI公司）到5 000 kg/d（加拿大Kruger公司）不等，預(yù)計(jì)納米纖維素全球產(chǎn)量為33×10t/年。但是為避免纖維素出現(xiàn)不可逆聚集或角質(zhì)化，需要將纖維素保存在水溶液中，這一方面增加了運(yùn)輸成本，另一方面容易導(dǎo)致微生物污染，增加損耗成本。對(duì)此，可先將纖維素失水干燥，運(yùn)抵后進(jìn)行再分散。在烘箱干燥、冷凍干燥、噴霧干燥、超臨界干燥方法中，冷凍干燥與超臨界干燥可以較好地避免團(tuán)聚，實(shí)現(xiàn)再分散，但是冷凍干燥的成本更可接受。

對(duì)于BC，其纖維素純度遠(yuǎn)高于植物纖維素，這大幅降低了提純工藝的繁瑣程度。但是上游的BC生產(chǎn)工藝（即傳統(tǒng)的微生物靜態(tài)發(fā)酵工藝）存在生產(chǎn)狀態(tài)不連續(xù)、單批次生產(chǎn)時(shí)間長(zhǎng)、占用空間大、需要的勞動(dòng)力多、產(chǎn)率低等問題，導(dǎo)致BC綜合成本高（是植物纖維素的80 倍）。對(duì)此，可從菌株、培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件、生物反應(yīng)器方面著手。菌株方面，可進(jìn)行自然突變株篩選以獲得BC高產(chǎn)菌株，同時(shí)，基因修飾獲得高產(chǎn)菌株或許是可以接受的，因?yàn)檗D(zhuǎn)基因成分理論上不存在于BC中，并且BC經(jīng)歷的純化過程（如1 mol/L NaOH煮沸1 h）會(huì)去除攜帶轉(zhuǎn)基因的細(xì)菌。培養(yǎng)基方面，合成培養(yǎng)基是造成BC生產(chǎn)成本高昂的一大主要因素?？砷_發(fā)廢棄物作為培養(yǎng)基成分（主要是碳源），如生物柴油生產(chǎn)和葡萄渣中剩余的甘油、無法食用的腐爛香蕉、酒糟水、干酪乳清、甜菜糖蜜等。與人工合成的典型HS（Hestrin and Schramm）培養(yǎng)基相比，上述培養(yǎng)基可降低成本，甚至可以增加產(chǎn)量。培養(yǎng)條件方面，可尋找能耗更低的培養(yǎng)條件，如進(jìn)行菌株馴化使其可耐10～20 ℃低溫（一般菌株適宜溫度約為25～30 ℃），以滿足寒冷地區(qū)的BC培養(yǎng)。生物反應(yīng)器方面，生物反應(yīng)器為BC高效、規(guī)?；?、連續(xù)化生產(chǎn)提供條件，為此可設(shè)計(jì)并優(yōu)化生物反應(yīng)器，包括相對(duì)靜態(tài)條件下的反應(yīng)器如盤式反應(yīng)器、氣溶膠反應(yīng)器、膜反應(yīng)器等，以及動(dòng)態(tài)條件下的反應(yīng)器如球形鼓泡塔式反應(yīng)器、氣升式反應(yīng)器等。

3.3 材料加工性能

天然纖維素“不熔”，且“不溶”的特點(diǎn)使其在加工方面存在挑戰(zhàn)。具體來說，一方面，天然纖維素?zé)o法熔化，高溫下直接分解；另一方面，天然纖維素溶解性低，不溶于常見的水和有機(jī)溶劑，可溶于氯化鋰/,-二甲基乙酰胺（lithium chloride/,-dimethylacetamide，LiCl/DMAc）、-甲基嗎啉--氧化物（-methylmorpholine--oxide，NMMO）、NaOH/尿素水溶液等溶劑體系，但是這些溶劑不可食用甚至有毒有害，難以應(yīng)用于細(xì)胞培育肉支架。對(duì)于纖維素溶解的原理存在兩種主流觀點(diǎn)，一是溶劑破壞了分子內(nèi)和分子間的氫鍵網(wǎng)絡(luò)。與之相反，另一種觀點(diǎn)則認(rèn)為，纖維素具有兩親性，溶劑消除了強(qiáng)烈影響溶解的纖維素分子間疏水相互作用。

對(duì)于天然纖維素難加工的問題，可以對(duì)纖維素進(jìn)行化學(xué)改性以增強(qiáng)水溶性。降低DP或分子質(zhì)量也有助于纖維素溶解。此外，可以選擇適用于纖維素分散液（而不是只適用于溶液）的加工方式，從而避免不可食用溶劑的引入。

3.4 力學(xué)性能

支架各項(xiàng)力學(xué)性能中受重點(diǎn)關(guān)注的是剛度，其常用評(píng)價(jià)指標(biāo)為彈性模量（尤其是楊氏模量）。肌肉和脂肪細(xì)胞均對(duì)基質(zhì)剛度敏感，但是不同類型的細(xì)胞對(duì)剛度有不同要求。以肌肉細(xì)胞為例，雖然在不同剛度的基質(zhì)上均可形成肌管，但是所得肌管長(zhǎng)度和肌管簇?cái)?shù)量存在差異，并且僅在近似天然骨骼肌的剛度（楊氏模量約12 kPa）上出現(xiàn)含肌球蛋白或肌動(dòng)蛋白條紋的肌管?；诩?xì)胞-剛度響應(yīng)這一因素，Bomkamp等提出，對(duì)于肌源性細(xì)胞和脂肪源性細(xì)胞，支架的理想楊氏模量分別約為12～21 kPa和2～3 kPa。除細(xì)胞增殖與分化的角度外，從食品口感的角度考量，細(xì)胞培育肉支架在烹飪后應(yīng)具有適中的剛度以保證良好咀嚼性已達(dá)到對(duì)肉品的逼真模仿，盡管目前對(duì)熱處理支架力學(xué)性能的研究極其有限。

纖維素本身剛度大。對(duì)于植物纖維素，MCC的楊氏模量約為25 GPa。受各向異性、纖維素中的晶體缺陷、結(jié)晶度、尺寸、測(cè)量方法等因素影響，CNC的楊氏模量數(shù)值不等（7.5～143.0 GPa）。BC單根纖維的楊氏模量約為80 GPa，由雙向和單向拉伸測(cè)試得到的BC膜的楊氏模量則分別為200～500 MPa和1～10 MPa。雖然纖維素材料本身的剛度大，但是纖維素支架成品的剛度受纖維素原料特性、制備方法等眾多因素影響而呈現(xiàn)出寬闊的可變范圍?？傮w而言，支架的剛度由材料剛度、結(jié)構(gòu)剛度二者從不同維度共同決定。因此，相關(guān)研究人員可從這兩方面入手調(diào)整纖維素支架整體的剛度。

調(diào)節(jié)纖維素材料剛度的方式包括與其他材料復(fù)合、物理或化學(xué)交聯(lián)等。比如，用海藻酸鹽（1 g/100 mL）和CNF（0.15～0.75 g/100 mL）為原料、CaCO和-葡萄糖酸--內(nèi)酯為交聯(lián)劑可制備楊氏模量約為5～60 kPa的水凝膠。這一剛度范圍適合肌源細(xì)胞生長(zhǎng)，并且上述原料均可食用。再如，膠原功能化（楊氏模量（2.2±0.2）kPa）、戊二醛化學(xué)交聯(lián)（楊氏模量（4.1±0.3）kPa）均可增加去細(xì)胞化蘋果組織（（1.1±0.1）kPa）的剛度。但是來自動(dòng)物的膠原和有毒的戊二醛不適于構(gòu)建細(xì)胞培育肉支架，因此在復(fù)合材料、交聯(lián)材料的選擇上應(yīng)慎重考量。不影響食用性的常用纖維素-纖維素交聯(lián)材料主要為檸檬酸。對(duì)于纖維素-復(fù)合材料交聯(lián)，交聯(lián)劑是否使用及選用種類視二者物理化學(xué)特性而定。比如利用蛋白和碳水化合物混合后在高溫下發(fā)生的美拉德反應(yīng)，可實(shí)現(xiàn)纖維素與大豆蛋白等非動(dòng)物源蛋白的交聯(lián)。此外，纖維素結(jié)晶度與材料剛度呈正相關(guān)，因此可選用適宜結(jié)晶度的纖維素制備支架。

減小結(jié)構(gòu)剛度的方式包括前文中提到的造孔、構(gòu)建定向孔道等。隨著孔隙度增加，支架中起力學(xué)支撐的實(shí)質(zhì)減少，整體結(jié)構(gòu)更為松散，剛度降低。Isobe等通過調(diào)節(jié)纖維素濃度，制備出楊氏模量30 kPa～1.3 MPa的纖維素水凝膠。而在通過鹽析法引入直徑約為300 μm的孔隙后，材料的楊氏模量降低至5.4 kPa。

此外，為滿足理想的支架剛度，去細(xì)胞化植物支架似乎是最簡(jiǎn)便的選擇。植物支架在去細(xì)胞化處理后楊氏模量普遍下降，多數(shù)未改性去細(xì)胞化植物支架的楊氏模量在1 kPa（蘋果萼筒組織）～21 kPa（菠菜葉）范圍內(nèi)，這與期待的細(xì)胞培育肉支架剛度相接近，省去大量額外操作。當(dāng)然，這一合適的模量區(qū)間也得益于研究者傾向于選擇較為柔軟的植物樣品，比如禾本科植物的葉片。實(shí)際上，在植物種類、來源部位、處理方式等多種因素影響下，去細(xì)胞化植物的剛度可以實(shí)現(xiàn)楊氏模量從千帕級(jí)到吉帕級(jí)的大范圍波動(dòng)。

4 結(jié) 語

本文討論了纖維素在細(xì)胞培育肉支架中的應(yīng)用潛力與挑戰(zhàn)。細(xì)胞培育肉領(lǐng)域迫切尋求非動(dòng)物源、可食用、成本低廉的支架原料。細(xì)胞培養(yǎng)常用的可食用支架材料包括膠原或明膠、殼聚糖、透明質(zhì)酸、大豆蛋白、海藻酸鈉、瓊脂糖、纖維素等。在限定非動(dòng)物來源的情況下，纖維素具有明顯的成本優(yōu)勢(shì)。纖維素主要存在于植物細(xì)胞壁，是自然界中含量最豐富的高分子，作為膳食纖維有助人體健康。此外，纖維素已在醫(yī)學(xué)、生物領(lǐng)域具有研究基礎(chǔ)和商業(yè)化生產(chǎn)基礎(chǔ)。因此，纖維素有望成為優(yōu)質(zhì)支架原料，推動(dòng)細(xì)胞培育肉產(chǎn)業(yè)發(fā)展。

本文介紹了適用于纖維素基細(xì)胞培育肉支架的制備方法。多孔結(jié)構(gòu)可通過冷凍干燥、發(fā)泡、犧牲材料、鹽析等方式形成。分化用支架所需的定向結(jié)構(gòu)可通過定向冷凍、機(jī)械拉伸等實(shí)現(xiàn)。微載體所需的微球結(jié)構(gòu)更適合由微生物原位生成球形BC而獲得。因此，如需獲得具有兩種及以上上述結(jié)構(gòu)的支架，可同時(shí)采取多種方式。如希望僅用一種方法獲得上述多種特定結(jié)構(gòu)的支架，則可通過去細(xì)胞化法獲得天然精細(xì)結(jié)構(gòu)，或者通過3D打印獲得可定制化的復(fù)雜結(jié)構(gòu)。

然而，纖維素在細(xì)胞培育肉支架中存在一定挑戰(zhàn)。對(duì)于細(xì)胞黏附性有限的問題，可以引入RGD肽和含RGD的蛋白，更經(jīng)濟(jì)的方法是進(jìn)行表面電荷改性。對(duì)于不易溶解導(dǎo)致加工困難的問題，可使用水溶性良好的纖維素衍生物，此外也可采用非溶解狀態(tài)纖維素制備支架，以規(guī)避有毒溶劑問題。對(duì)于纖維素剛度與細(xì)胞培育肉理想支架差異較大的問題，可以通過調(diào)控支架結(jié)構(gòu)、交聯(lián)、與其他材料復(fù)合、選擇合適結(jié)晶度的纖維素等方式調(diào)節(jié)剛度，不過更直接可行的方法是以去細(xì)胞化植物為支架。

整體而言，雖然植物纖維素支架的工藝更成熟，但BC和去細(xì)胞化纖維素分別以其原位調(diào)控成形的靈活性和簡(jiǎn)單操作即可獲得的精細(xì)結(jié)構(gòu)而在細(xì)胞培育肉支架中同樣具有良好前景。纖維素基生物材料的設(shè)計(jì)與優(yōu)化有待相關(guān)科研人員進(jìn)一步探索研究，從而助力細(xì)胞培育肉生產(chǎn)。