何守魁，黎丹紅，施春雷，史賢明

（上海交通大學農業(yè)與生物學院，中美食品安全聯(lián)合研究中心，微生物代謝國家重點實驗室，上海 200240）

食品安全是備受全球關注的公共衛(wèi)生問題，食源性致病菌是引發(fā)食品安全問題的主要因素。據統(tǒng)計，我國平均每6.5 人中就有1 人因食用被食源性致病菌污染的食物而罹患疾病。沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、副溶血弧菌、致病性大腸桿菌、蠟樣芽孢桿菌、單增李斯特菌等都是我國常見的食源性致病菌。對這些食源性致病菌進行有效的控制，是保障食品安全的重要途徑。

在食品工業(yè)中，常使用物理殺菌因子和化學殺菌因子來控制致病菌，從而保障食品安全。然而，這些物理和化學因子的廣泛使用或不合理使用，已導致食源性致病菌形成抗性，包括低溫抗性、高溫抗性、干燥抗性、消毒劑抗性、有機酸抗性等。此外，有些致病菌（如沙門氏菌）甚至能夠同時抵御復雜食品基質（如蛋清和花生醬）中的多種逆境因子，并引發(fā)食品安全事件。因此，探索致病菌在食品加工與貯藏環(huán)節(jié)常用理化因子脅迫下的存活機制，對于解決抗性菌導致的食品安全問題具有重要意義。

近年來，日益成熟的高通量組學技術（如基因組學、轉錄組學、蛋白質組學和代謝組學等）在食源性致病菌抗逆機制研究方面得到了廣泛應用，為抗逆相關基因、sRNA、蛋白質和代謝物的全面發(fā)掘及其互作關系研究提供了堅實的技術支撐。例如，目前已通過轉錄組學和蛋白質組學技術挖掘到參與沙門氏菌酸抗性形成的多個調控蛋白質（如Fur、RpoS和OmpR）、結構基因（如、和）和sRNA（如RprA、ArcZ和GcvB），這些抗逆元件有望為新型控菌技術的開發(fā)提供候選作用靶標，最終用于食品的安全生產。

本文結合課題組前期的研究工作，綜述基因組學、轉錄組學、蛋白質組學和代謝組學技術在食源性致病菌抗逆機制研究中的應用進展，并對未來的發(fā)展方向進行展望，以期將組學技術更好地用于相關基礎研究，同時為食源性致病菌抗性菌株的防控作出重要貢獻。

1 基因組學技術在食源性致病菌抗逆機制研究中的應用

基因組攜帶了生物體（如食源性致病菌）的絕大多數遺傳信息，是微生物形成特定表型的本源。因此，全基因測序分析對于揭示食源性致病菌的抗性形成機制尤為重要。一代測序技術以Sanger雙鏈終止法為代表，二代測序技術以Roche公司的454技術、Illumina公司的Solexa/HiSeq技術和ABI（Applied Biosystems）公司的SOLID（sequencing by oligonucleotide ligation and detection）技術為代表，三代測序技術以Pacific BioSciences（PacBio）公司的單分子實時測序技術（single-molecule real-time sequencing，SMRT）和ONT（Oxford Nanopore Technologies）公司的納米孔測序技術（Nanopore）為代表。目前，全基因組測序主要依賴于二代和三代測序技術，這些技術在食源性致病菌應對抗生素、天然產物、高溫等脅迫的抗性形成機制研究方面得到了廣泛應用（表1）。

表1 基因組學技術在食源性致病菌抗逆機制研究中的應用案例Table 1 Application of genomics technology in investigations on stress response mechanisms of foodborne pathogens

1.1 二代測序技術的應用進展

二代測序技術在食源性致病菌耐藥性研究方面得到了廣泛的應用。例如，研究者們已借助Illumina的MiSeq/HiSeq測序平臺，發(fā)現了金黃色葡萄球菌的、、、、和這6 個基因與高水平苯唑西林耐藥性的形成相關，鑒定到副溶血弧菌中存在（Pro165Ser、Gly208Asp）、（Ile313Thr）、（Glu329Ala）和（Asn205Ser）等耐藥基因的突變。

二代測序技術也被用于探索大腸桿菌、沙門氏菌等重要致病菌抵御天然產物、化學消毒劑和蛋清等逆境因子的機制。例如，Pereira等發(fā)現苯扎氯銨、雙氯苯雙胍己烷等殺菌劑的連續(xù)使用會導致大腸桿菌耐藥菌株的耐藥泵（、）、孔道蛋白（、）、RNA聚合酶（、）等相關基因發(fā)生突變。此外，本課題組利用Illumina HiSeq平臺對腸炎沙門氏菌的1 株蛋清抗逆菌株和1 株蛋清敏感菌株進行了全基因組測序，鑒定到70 個單核苷酸多態(tài)性位點差異和6 個插入缺失位點差異，這些差異位點涉及的基因主要與細胞分裂、DNA損傷修復、氨基酸代謝、三型分泌系統(tǒng)等相關。

1.2 三代測序技術的應用進展

三代測序技術也可單獨用于食源性致病菌的抗逆機制研究，但目前的應用相對較少。例如，Nguyen等利用PacBio RS II平臺對一株耐熱的山夫登堡沙門氏菌ATCC 43845進行測序，獲得了其基因組完成圖。該菌的基因組大小為4.92 Mb，GC相對含量為52.2%，共有5 105 個基因。該菌的特色是具有兩個通過基因水平轉移而獲得的TLPQC-1和TLPQC-2耐熱基因座，位于一個341.3 kb大小的質粒上，這個質粒與IncHI2 R478質粒相似，但并不攜帶任何耐藥基因。上述結果為這株典型的耐熱山夫登堡沙門氏菌高溫抗性形成機制的揭示提供了新視角。

1.3 二代與三代測序技術的聯(lián)合應用進展

近年來，二代與三代測序技術常被聯(lián)合用于食源性致病菌的耐藥機制研究，主要研究思路是先對較大批量的菌株進行二代測序，然后挑選代表性菌株進行三代測序，并整合二代和三代測序數據來分析基因組特征。例如，Zheng Zhiwei等利用Illumina HiSeq平臺對攜帶基因的33 株副溶血弧菌和2 株溶藻弧菌進行測序，并挑選2 株代表性菌株（Vb0624和Vb1636）進行Nanopore測序，發(fā)現這些菌株攜帶的基因上游是ISEcp1插入序列。其中，有32 株菌的基因位于染色體I的相同基因座上，有1 株菌的基因位于SXT/R391家族的新型整合性接合元件上，有1 株菌的基因位于IncP-1型質粒上。

同樣借助MiSeq和Nanopore測序技術，Octavia等發(fā)現質粒攜帶的、或耐藥基因與圣保羅沙門氏菌對第三代頭孢菌素抗性的形成密切相關；González-Santamarina等發(fā)現多重耐藥的德爾卑沙門氏菌和羅森沙門氏菌普遍攜帶耐藥基因，包括四環(huán)素耐藥基因（如、）、-內酰胺耐藥基因（如、）、氯霉素耐藥基因（如、）、磺胺耐藥基因（如、）、喹諾酮耐藥基因（如）等。

本課題組同時采用二代和三代測序技術對一株分離自雞肉的泛耐藥印第安納沙門氏菌的基因組特征進行分析，獲得了較精細的基因組完成圖。這株菌基因組大小為5.01 Mb，包含4.77 Mb的基因組和0.24 Mb的質粒，其典型特點是具有28 個基因組島、5 個沙門氏菌毒力島和27 個耐藥基因（位于IncHI2-IncHI2A質粒上）。這些較詳細的基因組信息為研究細菌耐藥性形成的分子機制奠定了基礎。

由此可知，在食源性致病菌的抗逆機制研究中，全基因組測序技術主要用于代表菌株（如抗逆菌）的序列特征分析。二代測序技術具有高通量、低成本、高精準度等優(yōu)勢，但其序列讀長限制增加了基因組拼接和后續(xù)數據分析的難度。以單分子測序為特點的三代測序技術雖克服了二代測序中存在的問題，但其測序錯誤率高，而且錯誤率是隨機出現的。因此，將二代與三代測序技術聯(lián)合使用可提高全基因組測序的準確度，這已成為基因組學技術在食源性致病菌抗逆機制研究中的應用趨勢。

2 轉錄組學技術在食源性致病菌抗逆機制研究中的應用

轉錄組學技術可從整體水平上研究生物體（如食源性致病菌）在特定狀態(tài)下（如脅迫因子）的基因轉錄水平和表達調控規(guī)律。轉錄組學技術主要包括基于雜交方法的基因表達譜芯片技術和基于測序方法的RNA-seq技術等。這些方法在沙門氏菌、單增李斯特菌、阪崎克羅諾桿菌、大腸桿菌O157:H7、空腸彎曲桿菌等致病菌抵御高溫、低溫、消毒劑、食品基質等逆境因子研究方面得到了較廣泛的應用（表2），為食源性致病菌抗逆機制的深入解析提供了關鍵的基因和通路。

表2 轉錄組學技術在食源性致病菌抗逆機制研究中的應用案例Table 2 Application of transcriptomics technology in investigations on stress response mechanisms of foodborne pathogens

2.1 基因表達譜芯片技術的應用進展

基因表達譜芯片是基于核酸探針雜交的原理來檢測基因的表達變化情況。目前，該技術已應用于沙門氏菌抵御干燥、次氯酸鈉和高溫等脅迫因子以及單增李斯特菌抵御堿和二氧化氯等脅迫因子的機制研究（表2）。

Li Haiping等以一株干燥抗性強的田納西沙門氏菌和一株干燥抗性弱的鼠傷寒沙門氏菌為研究對象，通過基因表達譜芯片技術探索這兩株菌在干燥脅迫下的轉錄譜差異，結果表明，田納西沙門氏菌和鼠傷寒沙門氏菌分別有71 個基因（63 個基因表達上調、8 個基因表達下調）和94 個基因（85 個基因表達上調、9 個基因表達下調）的表達在干燥脅迫后發(fā)生顯著變化，主要與脂肪酸、轉運子、能量代謝、細胞膜、蛋白質合成、滲透脅迫等通路相關。其中，與鼠傷寒沙門氏菌相比，田納西沙門氏菌的鞭毛合成和蛋白質合成降低、海藻糖合成增加、應激反應和細胞膜修飾被激活，表明這些是田納西沙門氏菌形成干燥抗性的策略。

Wang Siyun等利用基因表達譜芯片技術探究沙門氏菌對次氯酸鈉這一重要氧化型消毒劑的應答機制，結果表明，鼠傷寒沙門氏菌和腸炎沙門氏菌共有209 個基因的表達在次氯酸鈉脅迫后發(fā)生了顯著變化，這些基因主要與應激反應、核糖體合成、菌膜形成、能量代謝、半胱氨酸合成和鐵硫簇組裝等相關。此外，應激反應相關的33 個基因（如、）和毒力相關的19 個基因（如、）在鼠傷寒和腸炎這兩種血清型的沙門氏菌中呈現出不同的表達模式，說明沙門氏菌可能啟動一些血清型特異的方式來應答次氯酸鈉脅迫。

2.2 RNA-seq技術的應用進展

RNA-seq技術主要借助高通量測序的方法來發(fā)掘差異表達基因。近年來，該技術在食源性致病菌的抗逆機制研究方面應用非常廣泛，包括沙門氏菌應答酸、蛋清和花生油的機制探索，單增李斯特菌的菌膜形成機制研究，大腸桿菌O157:H7應答低溫、超聲和歐姆加熱的機理解析（表2）。

Hu Shuangfang等通過RNA-seq技術探索腸炎沙門氏菌對酸脅迫的轉錄響應機制，發(fā)現酸脅迫導致該菌280 個基因的表達顯著上調，274 個基因的表達顯著下調。通過分析這些基因參與的生化代謝過程和信號轉導通路，發(fā)現腸炎沙門氏菌主要通過降低能量損耗和蛋白乙?；?，啟動應激反應和鐵硫簇合成途徑，并維持必要的細胞過程來應對酸脅迫。

曹啟航采用RNA-seq技術對不同時期的菌膜和浮游狀態(tài)單增李斯特菌進行測序，發(fā)掘到1 123 個與菌膜形成相關的基因，并通過實時熒光定量聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）技術證實了轉錄組測序結果的可靠性。京都基因與基因組百科全書（Kyoto Ncyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路分析結果進一步顯示，差異表達基因主要與群體感應、細菌分泌、細菌趨化、鞭毛組裝、磷酸轉移酶系統(tǒng)等相關。這些研究結果為揭示單增李斯特菌菌膜這一重要抗逆態(tài)的形成機制奠定了基礎。

RNA-seq技術也被用于研究腸炎沙門氏菌在蛋清（含有卵轉鐵蛋白、溶菌酶等抗菌因子）以及花生油（存在干燥和饑餓等脅迫環(huán)境）等食品基質中的存活機理。本課題組將RNA-seq技術用于腸炎沙門氏菌在蛋清逆境脅迫下的轉錄組響應機制研究，發(fā)現該菌在蛋清中孵育6、12、24 h后，分別有1 200、1 312、1 415 個基因的表達發(fā)生了顯著變化；其中，表達顯著上調的基因主要富集在堿性pH適應、滲透脅迫響應、鐵吸收、DNA損傷修復、肽聚糖合成和交聯(lián)、生物素合成等通路，表達顯著下調的基因主要富集在翻譯、核苷酸代謝、能量代謝、運動、沙門氏菌毒力島等通路。此外，通過基因功能分析，揭示了包膜脅迫相關蛋白CpxR可正向調控基因的表達來響應蛋清逆境的脅迫。在致病菌應答花生油的研究中，Deng Xiangyu等借助RNA-seq分析發(fā)現腸炎沙門氏菌在花生油中干燥和饑餓脅迫等作用下幾乎處于生理休眠狀態(tài)，只有不足5%的基因轉錄成RNA。這些基因主要包括、、等熱休克基因，、、等冷休克基因以及、等調控基因。此外，、、、、、等非編碼RNA的表達也發(fā)生了顯著變化，表明它們參與了腸炎沙門氏菌在花生油中的抗逆存活。

綜上可知，基因表達譜芯片技術和RNA-seq技術均已被用于食源性致病菌的抗逆機制研究。然而，與基因表達譜芯片技術相比，RNA-seq技術具有多個優(yōu)勢，包括測定細菌完整轉錄組圖譜、發(fā)現新轉錄本、獲得基因轉錄起始位點等。因此，RNA-seq技術將成為食源性致病菌抗逆機制研究的主流轉錄組測序手段。

3 蛋白質組學技術在食源性致病菌抗逆機制研究中的應用

蛋白質組學技術主要用于研究一個生物體（如食源性致病菌）在特定狀態(tài)下（如脅迫因子）的蛋白質整體表達水平和變化規(guī)律。在過去20 年間，雙向電泳（two-dimensional electrophoresis，2-DE）、細胞培養(yǎng)條件下穩(wěn)定同位素標記（stable isotope labeling by amino acids in cell culture，SILAC）、蛋白質非標記定量（label-free）、多維蛋白質鑒定（multidimensional protein identification technology，MudPIT）和同位素標記相對和絕對定量（isobaric tags for relative and absolute quantitation，iTRAQ）等多種蛋白質組學技術已被成功用于發(fā)掘食源性致病菌在物理因子（如高溫、低溫）、化學因子（如酸、鹽、乙醇）和食品基質（如蛋清）脅迫下的差異表達蛋白質（表3），為抗性形成機制的揭示提供了必要的候選蛋白質。

表3 蛋白質組學技術在食源性致病菌抗逆機制研究中的應用案例Table 3 Application of proteomics technology in investigations on stress response mechanisms of foodborne pathogens

3.1 2-DE技術的應用進展

建立于1975年的2-DE技術是一項經典的蛋白質組學技術，其原理是基于蛋白質的等電點和分子質量差異來分離蛋白質，并可結合質譜技術來鑒定差異蛋白質。2-DE技術在單增李斯特菌的低溫適應機制、克羅諾桿菌的滲透響應機制以及副溶血弧菌的乙醇耐受機制等研究方面得到了應用（表3）。

Cacace等借助2-DE技術開展蛋白質組學研究，并結合基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜（matrixassisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS）鑒定差異蛋白質，從而分析單增李斯特菌對低溫的適應機制，結果發(fā)現，單增李斯特菌在4 ℃條件下，共有65 個蛋白質的表達發(fā)生顯著變化（57 個蛋白質表達顯著上調、8 個蛋白質表達顯著下調），這些蛋白質主要與能量代謝、營養(yǎng)物質吸收、蛋白質合成、氧化應激和脂質合成等相關。

Riedel等通過2-DE和MALDI-TOF MS技術鑒定克羅諾桿菌響應滲透脅迫的相關蛋白質。他們分別采用物理干燥和直接添加氯化鈉來營造兩種不同類型的滲透脅迫，并在滲透處理的菌體中鑒定到80 個顯著差異表達的蛋白點，這些蛋白點對應了53 個顯著差異表達蛋白質。表達顯著上調的蛋白質主要是DNA/RNA穩(wěn)定酶、分子伴侶和氧化應激酶，表達顯著下調的蛋白質主要是鞭毛結構蛋白和細胞隔膜相關蛋白。

Chiang等通過2-DE技術研究副溶血弧菌的乙醇耐受機制，發(fā)現乙醇脅迫導致該菌8 個蛋白質的表達上調、7 個蛋白質的表達下調，但是這些蛋白質大都未被鑒定。此外，免疫印跡分析發(fā)現，一個類似于GroEL的蛋白質的表達被乙醇脅迫所誘導，說明該蛋白質參與了副溶血弧菌的乙醇脅迫應答反應。

由此可知，2-DE技術過去在食源性致病菌的抗逆機制研究中得到了較廣泛的應用。然而，由于該方法的靈敏度低、重復性差、蛋白質覆蓋率低，無法對整個基因組所表達的全部蛋白質進行鑒定和定量。因此，SILAC、Label-free、MudPIT和iTRAQ等定量蛋白質組學研究方法應運而生。

3.2 SILAC技術的應用進展

SILAC技術是在添加有輕型、中型和重型同位素標記的必需氨基酸（如賴氨酸和精氨酸）的培養(yǎng)基中進行細胞培養(yǎng)，使得培養(yǎng)若干代細胞后，細胞內的蛋白質能夠被同位素標記，然后將蛋白質等量混合并進行質譜鑒定。目前，該技術在食源性致病菌抗逆機制研究中的應用相對較少，主要集中于副溶血弧菌低溫脅迫適應機制研究。例如，Ma Weixing等利用SILAC技術分析副溶血弧菌應對4 ℃低溫脅迫的蛋白質表達譜變化，共鑒定到1 182 個蛋白質，并對其中的601 個蛋白質進行了定量分析，結果表明，低溫脅迫導致副溶血弧菌51 個蛋白質的表達顯著上調，129 個蛋白質的表達顯著下調。KEGG通路分析結果顯示，這些差異表達蛋白質主要集中于磷酸戊糖途徑、糖酵解、三羧酸循環(huán)、轉錄、翻譯等通路。在后續(xù)的SILAC技術優(yōu)化過程中，可以重點針對價格昂貴、脫靶率高等問題展開攻關，從而擴大其在食品安全領域的應用范圍。

3.3 Label-free技術的應用進展

Label-free技術無需同位素標記，通過比較質譜峰強度或質譜分析次數，測定不同組別樣品中的蛋白質表達差異。目前，Label-free技術在食源性致病菌抗逆機制研究中的應用相對較少，主要用于探究大腸桿菌的熱應激反應。例如，Tian Xiaojing等利用Label-free技術探究大腸桿菌O157:H7對歐姆加熱的應答反應，共鑒定到2 633 個蛋白質。其中，高強度（10 V/cm）和低強度（5 V/cm）的歐姆加熱分別導致169 個和84 個蛋白質的表達發(fā)生顯著變化，這些蛋白質主要集中于二羧酸代謝、ABC轉運、氨基酸合成、甘油磷脂代謝、核糖體代謝等通路。由于Label-free技術成本較低，并可提高蛋白質定量的準確性和低豐度蛋白質的檢測效率，因此在未來研究食源性致病菌的抗逆機制時可以合理選用。

3.4 MudPIT技術的應用進展

MudPIT是多維蛋白質鑒定技術，該技術先通過特異性的胰蛋白酶消化產生多肽，然后進行多維毛細管液相色譜分離，最后進行電噴霧串聯(lián)質譜分析。目前，MudPIT技術主要用于腸炎沙門氏菌應答低溫等離子體脅迫以及單增李斯特菌應答乳酸鏈球菌素、氫氧化鈉脅迫方面的研究（表3）。

Miyamoto等利用MudPIT技術探索單增李斯特菌對乳酸鏈球菌素的應答機制，發(fā)現有13 個蛋白質的表達發(fā)生了顯著變化（9 個蛋白質表達顯著上調、4 個蛋白質表達顯著下調），以上蛋白質主要與代謝過程、氧化應答、運動性等相關。此外，Ritter等借助MudPIT技術分析腸炎沙門氏菌在低溫等離子體處理下的蛋白質表達譜變化，共在處理組菌體中鑒定到249 個特異性表達的蛋白質，這些蛋白質主要與乙二醛酶I、ABC轉運系統(tǒng)底物結合蛋白、轉錄激活因子、氧化還原酶等相關。MudPIT技術可對樣品量較少的蛋白質進行快速分析，但不能提供蛋白質翻譯后修飾的相關信息，因此可根據研究目的合理地將該技術用于食源性致病菌抗逆機制研究。

3.5 iTRAQ技術的應用進展

iTRAQ是美國AB SCIEX公司推出的體外同位素標記新技術，采用同位素標記多肽的氨基基團，并結合高精度的串聯(lián)質譜分析，從而對不同樣品中的蛋白質進行定量。該方法靈敏度高、重復性好，近年來在阪崎克羅諾桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、空腸彎曲桿菌等重要食源性致病菌的抗逆機制研究中得到了較廣泛的應用（表3）。

Hu Shuangfang等利用iTRAQ技術發(fā)掘阪崎克羅諾桿菌應對干燥脅迫的相關蛋白質，共鑒定到87 個表達顯著上調的蛋白質和146 個表達顯著下調的蛋白質。基因本體論（gene ontology，GO）和KEGG分析結果顯示，滲透脅迫相關蛋白質的合成被干燥脅迫所誘導，而毒力、黏附和鞭毛相關蛋白質的表達在干燥脅迫后受到抑制，表明這些通路參與了阪崎克羅諾桿菌干燥抗性的形成。

Thai等以氟喹諾酮誘導的金黃色葡萄球菌耐藥菌株為研究對象，利用iTRAQ技術發(fā)掘到147 個與耐藥性形成相關的蛋白質，并借助熒光定量PCR實驗確證了蛋白質組學結果的可靠性。String分析結果進一步顯示，代謝途徑、氨酰-tRNA合成和核糖體相關蛋白質的互作關系密切，暗示了這些通路在金黃色葡萄球菌氟喹諾酮耐藥性形成中可能發(fā)揮重要作用。

本團隊將iTRAQ技術用于腸炎沙門氏菌這一重要食源性致病菌的抗逆機制研究，主要通過該技術發(fā)掘沙門氏菌抗逆相關的蛋白質，并借助熒光定量PCR技術和基因敲除技術鑒定關鍵抗逆蛋白質。例如，He Shoukui等通過iTRAQ技術發(fā)掘到腸炎沙門氏菌乙醇抗性形成相關的138 個蛋白質，這些蛋白質主要與ABC轉運子、代謝、調控子、核糖體和毒力島等通路相關?；蚬δ芊治鼋Y果進一步表明，ABC轉運子途徑的和嘌呤代謝通路的在抗性形成過程中發(fā)揮負向調控作用。此外，Qin Xiaojie等將iTRAQ技術應用于腸炎沙門氏菌在蛋清逆境中的存活機制研究，發(fā)現分別有273、284 個和303 個蛋白質的表達在50%、80%和100%蛋清的脅迫下發(fā)生顯著變化，大多數表達顯著上調的蛋白質與鐵吸收、氨基酸合成、轉運子、調控子和應激反應相關，大多數表達顯著下調的蛋白質與能量代謝、運動和毒力相關。其中，應激反應途徑的硫酯酶基因缺失導致腸炎沙門氏菌在蛋清中的存活能力顯著降低，這可能與細胞膜的破裂和細胞形態(tài)的改變相關。

綜上可知，在眾多蛋白質組學研究方法中，2-DE技術過去在食源性致病菌的抗逆機制研究中應用較多，但該技術具有靈敏度低、重復性差、蛋白質覆蓋率低等缺點。因此，iTRAQ等定量蛋白質組學技術目前常用于發(fā)掘食源性致病菌抗逆相關蛋白質。

4 代謝組學技術在食源性致病菌抗逆機制研究中的應用

代謝組學技術是以生物體（如食源性致病菌）的所有代謝物為研究對象，考察分子質量小于1 000 Da的小分子在特定狀態(tài)下（如脅迫因子）的含量變化規(guī)律。根據研究對象的差異，代謝組學可分為非靶向代謝組學（分析未知化合物）和靶向代謝組學（分析已知化合物）。根據分析手段的不同，代謝組學可分為氣相色譜-質譜聯(lián)用（gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS）代謝組學和核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）代謝組學等。這些技術已在單增李斯特菌、大腸桿菌、鼠傷寒沙門氏菌、金黃色葡萄球菌等多種致病菌抵御環(huán)境壓力的研究方面取得了一些應用（表4），在一定程度上推動了食源性致病菌抗逆機制的探索進程。

表4 代謝組學技術在食源性致病菌抗逆機制研究中的應用案例Table 4 Application of metabolomics technology in investigations on stress response mechanisms of foodborne pathogens

4.1 GC-MS技術的應用進展

GC-MS是以離子荷質比（電荷-質量比）測量為基礎的分析儀器，具有靈敏度高、分辨率高、重現性好、公共數據庫定性方便等優(yōu)勢。近年來，GC-MS技術在食源性致病菌應答低溫、酸、鹽、抗生素等多種脅迫因子的研究中得到了應用（表4）。例如，Singh等借助GC-MS技術分析單增李斯特菌對8 ℃低溫脅迫的代謝應答響應，發(fā)現64 個代謝物的含量發(fā)生顯著變化（56 個代謝物的含量顯著增加、8 個代謝物的含量顯著降低）。其中，胞內氨基酸、糖類、有機酸、多胺和相容性溶質等物質的含量增加，這些物質可抑制冰晶的形成，保護單增李斯特菌免受低溫的損害。此外，吳芮庭采用GC-MS技術分析了鼠傷寒沙門氏菌敏感菌株、耐藥質粒pHXY0908攜帶菌株、替加環(huán)素耐藥并攜帶pHXY0908菌株的代謝組學差異，發(fā)現氨基酸代謝、嘧啶代謝和ABC轉運是重要的代謝通路，其中氨基酸代謝通路中的-天冬氨酸是關鍵代謝物，可作為深入研究耐藥機制的切入點。

4.2 NMR技術的應用進展

NMR技術具有制樣簡單、重復性好、檢測無偏向性等優(yōu)點，可檢測微生物細胞內發(fā)生的生物化學變化。目前，NMR技術在食源性致病菌抗逆方面的應用研究主要是由新加坡國立大學Yang Hongshun博士課題組開展的。該課題組成功利用該技術探索了大腸桿菌對電解水、乳酸、超聲等脅迫因子的代謝應答響應（表4）。例如，Liu Qin等利用NMR技術探索大腸桿菌對電解水的代謝應答機制，發(fā)現亞抑菌濃度的電解水導致28 個代謝物（包括氨基酸、核苷酸、有機酸）的含量發(fā)生顯著變化。這些代謝物富集在30 個通路中，其中5 個通路與電解水應激反應密切相關，分別為氨酰-tRNA生物合成，纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸生物合成與降解，甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝，以及精氨酸和脯氨酸代謝。

鑒于GC-MS技術和NMR技術在致病菌抗逆機制研究方面的優(yōu)勢，后續(xù)研究可進一步拓展這些技術的應用范圍。此外，利用這些技術發(fā)掘出的關鍵代謝物，有望作為食源性致病菌抗逆菌株的生物標志物，用于抗逆菌株檢測技術的建立。

5 多組學技術聯(lián)合分析在食源性致病菌抗逆機制研究中的應用

食源性致病菌在應對外界脅迫時，會啟動不同的生理生化代謝系統(tǒng)，以適應環(huán)境變化。因此，食源性致病菌抗逆性的形成是多個代謝通路協(xié)調作用的復雜調控過程，僅從基因、sRNA、蛋白質或代謝物等層次中的任一方面都無法完整揭示其中的分子機制。多組學聯(lián)合分析是突破單一組學研究瓶頸的有效方法，可從轉錄到代謝層面反映致病菌變化的全過程，實現不同層次數據的整合互補，從而推動食源性致病菌抗逆機制的全面解析。在過去數年間，多組學聯(lián)合分析技術已被用于食源性致病菌的抗逆機制研究，包括金黃色葡萄球菌對細菌素和單寧的應激反應、單增李斯特菌的堿耐受反應以及空腸彎曲桿菌的酰胺醇類耐藥機制等方面（表5）。

表5 多組學技術聯(lián)合分析在食源性致病菌抗逆機制研究中的應用案例Table 5 Application of multi-omics technologies in investigations on stress response mechanisms of foodborne pathogens

Du Hechao等應用轉錄組學和蛋白質組學技術探究耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌對亞抑菌濃度細菌素Plantaricin GZ1-27的應激反應，發(fā)現有1 090 個基因和418 個蛋白質的表達發(fā)生顯著變化。其中，75.9%（173/228）的基因在mRNA和蛋白質水平上的變化趨勢一致，說明轉錄組學和蛋白質組學數據之間的關聯(lián)性較好。生物信息學分析結果進一步顯示，在轉錄和翻譯層面均發(fā)生顯著變化的基因主要集中在菌膜形成、DNA復制與損傷修復、應激反應、嘌呤代謝和氨基酸代謝等途徑。細菌素Plantaricin GZ1-27引起的菌膜形成相關基因和蛋白質的表達變化，的確導致金黃色葡萄球菌菌膜形成受到抑制，在一定程度上證實了多組學技術聯(lián)合分析在食源性致病菌抗逆機制研究方面的應用優(yōu)勢。

此外，借助轉錄組學和代謝組學聯(lián)合分析，Liu Miaomiao等揭示了金黃色葡萄球菌耐甲氧西林菌株通過滲透壓、pH值、氨基酸合成與代謝、三羧酸循環(huán)、鐵離子代謝等方面的調控來應答亞抑菌濃度的單寧脅迫，Fleury等闡明了金黃色葡萄球菌通過調控滲透壓穩(wěn)態(tài)、氧化應激、金屬離子轉運、ATP合成來應答高溫脅迫。通過整合基因組學和轉錄組學數據，Kim等發(fā)現苯扎氯銨的使用會導致銅綠假單胞菌外排泵基因的過表達以及基因的突變，從而誘導該菌對多黏菌素B和其他抗生素產生耐藥性。此外，李會通過轉錄組學、蛋白質組學和代謝組學等3 種組學技術聯(lián)合分析，發(fā)現空腸彎曲桿菌酰胺醇類耐藥性的形成主要與鞭毛組裝、ABC轉運蛋白、核糖體、趨化蛋白相關。

綜上可知，多組學技術聯(lián)合分析比單一組學分析在食源性致病菌抗逆機制研究方面更具優(yōu)勢。例如，轉錄組學與代謝組學數據的關聯(lián)，可實現差異基因和差異代謝物的共表達分析，促進基因和代謝物變化之間的因果關系探究，進而鎖定關鍵基因、代謝物和通路，系統(tǒng)解析致病菌的抗逆機制。因此，可將多組學技術聯(lián)合分析合理用于抗逆基因、sRNA、蛋白質和代謝物的發(fā)掘工作，從而推動食源性致病菌抗逆分子機制的探索進程。

6 結 語

基因組學、轉錄組學、蛋白質組學和代謝組學等技術具有通量較高的優(yōu)勢，已在食源性致病菌抗逆機制解析方面得到了較為廣泛的應用。綜合目前的文獻報道來看，通過比較外源理化因子施加與不施加條件下食源性致病菌的組學特征，或者解析抗逆菌株與敏感菌株的組學特征差異，進而對差異基因、sRNA、蛋白質和代謝物進行GO功能聚類和KEGG代謝通路等方面的生物信息學分析，是組學技術在食源性致病菌抗逆機制研究中的主流研究思路。這些研究結果顯示，食源性致病菌抗性的形成并不是某個基因、sRNA、蛋白質或代謝通路單獨作用的結果，而是多個基因、sRNA、蛋白質和多個代謝物協(xié)調作用的綜合表現，涉及多個網絡的調控。

在這一研究領域，以后可以重點考慮開展以下方面的工作：1）實現從單一組學研究到多組學整合分析的轉變，從而更全面更精準地發(fā)掘關鍵抗逆元件，并且強化高通量組學技術在抗逆基因、sRNA和蛋白質功能分析和互作模式構建方面的應用，從而揭示食源性致病菌抗性形成的調控網絡和過程機制；2）建立以抗逆基因、抗逆sRNA、抗逆蛋白質、抗逆代謝物和關鍵代謝通路為主體的抗性組數據庫，并且推動以這些抗逆元件為靶標的新型控菌技術的建立，從而為保障食品安全和公眾健康作出重要貢獻。