韓書煜，許飄尹，魏 華，吳志剛，楊祖鵬，譚雯予，楊廷雅，施金谷，梁靜真，黃 鈞

(1.廣西大學動物科學技術學院/廣西水生動物病害診斷實驗室/廣西高校水生生物健康養(yǎng)殖與營養(yǎng)調控重點實驗室，南寧 530004；2.廣西水產(chǎn)技術推廣站，南寧 530022)

【研究意義】近年來，抗生素濫用引起的細菌耐藥性問題已受到廣泛關注，而具有廣譜抗微生物活性防御素的出現(xiàn)為解決細菌耐藥難題提供了新思路[1]。防御素是一種小分子陽離子抗菌肽，在幫助機體抵抗病原入侵的過程中發(fā)揮重要作用，根據(jù)生物種類來源和二硫鍵連接方式可將其劃分為植物防御素、昆蟲防御素、α-防御素、β-防御素和θ-防御素等[2]。β-防御素具有β-折疊片結構、6個保守半胱氨酸殘基(Cys)和1個保守甘氨酸(Gly)殘基，廣泛分布于哺乳類、禽類、爬行類和魚類等多種生物體內，具有抗細菌、真菌和病毒等活性[3]。黃沙鱉(Huangsha soft-shelled turtle)是中華鱉(Pelodiscussinensis)的地理種群[4]，原產(chǎn)于我國華南的左江、右江和西江流域。本研究課題組前期已成功克隆獲得黃沙鱉β-防御素1基因(Hs-BD1)的開放閱讀框(ORF)序列[5]，但未對Hs-BD1進行蛋白表達和純化。因此，開展黃沙鱉β-防御素的蛋白表達和活性分析，對新型黃沙鱉生物工程藥物開發(fā)利用具有重要意義。【前人研究進展】目前，獲得具有抑菌活性防御素蛋白的主要手段是采用基因工程表達和化學合成法[6-8]，如利用蛋白自動合成儀合成綠蠅防御素phormicin A對金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)的最小抑菌濃度(MIC)為2.0 μg/mL，對幾種芽孢桿菌(Bacillussp.)和四聯(lián)微球菌(Micrococcustetragenus)的MIC為12.5～25.0 μg/mL，對大腸桿菌(Escherichiacoli)的MIC為300.0 μg/mL[8]；以大腸桿菌為宿主細胞表達的人類巨噬細胞β-防御素130重組蛋白對革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌ATCC25923(MIC為45.0 μg/mL)和革蘭氏陰性菌綠膿桿菌(Pseudomonasaeruginosa) ATCC27853(MIC為50.0 μg/mL)均表現(xiàn)出極強的抗菌活性[9]；將雞β-防御素Gal-4成熟肽區(qū)基因克隆到原核表達載體pET-30a并轉化至大腸桿菌感受態(tài)細胞中，所獲得的重組蛋白Gal-4對金黃色葡萄球菌和多殺性巴氏桿菌(Pasteurellamultocida)均表現(xiàn)良好的抑菌效果[10]；通過構建鵝β-防御素7(AvBD7)的重組表達質粒pProEX-AvBD7，將其轉化至大腸桿菌Rosetta感受態(tài)細胞中進行IPTG誘導表達，結果顯示鵝AvBD7重組蛋白對大腸桿菌、雞白痢沙門氏菌(Salmonellapullorum)、金黃色葡萄球菌、四聯(lián)球菌和枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)5種細菌均有顯著的抗菌活性[11]。β-防御素是龜鱉類先天免疫系統(tǒng)的重要組成部分，其種類較多，已從歐洲池塘龜(Emysorbicularis)[12]、中華鱉[13]和刺鱉(Apalonespinifera)[14]等龜鱉類體內分離到30余種[15]。此外，天然提取或基因工程表達的龜鱉類β-防御素均具有一定抗菌活性，如天然提取的歐洲池塘龜β-防御素tBD-1對單增李斯特菌(Listeriamonocytogenes)、大腸桿菌、白色念珠菌(Candidaalbicans)及耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌均具有較強抑菌效果[12]。中華鱉β-防御素2的重組蛋白rPs-BD2具有較強的抗微生物活性，對金黃色葡萄球菌08032706、枯草芽孢桿菌08042313和表皮葡萄球菌(S.epidermidis) 09021325的MIC在9.38～18.75 μg/mL，對大腸桿菌ATCC25922的MIC為37.50 μg/mL；rPs-BD2對人類紅細胞的溶血性和對鼠源性巨噬細胞的細胞毒性均較弱，表明重組蛋白rPs-BD2對機體具有較高的生物安全性[13]。龜鱉類多生活在污臟的陸地或水環(huán)境中，這些惡劣環(huán)境是微生物滋生的良好條件，為抵抗病原微生物感染、適應生活環(huán)境，龜鱉類在長期的自然選擇中其體內已形成包括β-防御素在內比較有效的防御系統(tǒng)[14-15]，因此，龜鱉類β-防御素在新型藥物或飼料添加劑開發(fā)上可能具有潛在的應用價值。【本研究切入點】至今，有關黃沙鱉β-防御素蛋白表達及活性檢測的研究鮮見報道?！緮M解決的關鍵問題】構建Hs-BD1成熟肽原核表達，并對重組蛋白rHs-BD1進行抗菌活性、溶血性和抗氧化能力等生物學活性檢測分析，旨在為黃沙鱉β-防御素功能的深入分析及新型黃沙鱉抗菌藥物開發(fā)利用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗用菌株為水產(chǎn)動物臨床分離細菌，包括無乳鏈球菌(Streptococcusagalactiae)HPG1、金黃色葡萄球菌HPN1、類志賀鄰單胞菌(Plesiomonsshigelloides)DAL1、遲鈍愛德華氏菌(Edwardsiellatarda)FCH1和大腸桿菌YLG1。克隆感受態(tài)細胞大腸桿菌DH5α、質粒pMD18-T和pCold-TF均購自寶日醫(yī)生物技術(北京)有限公司；表達菌株大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細胞購自北京全式金生物技術有限公司；His標簽蛋白(可溶性)純化試劑盒購自北京康為世紀生物科技有限公司；微孔BCA蛋白含量測定試劑盒、阿氏液(紅細胞保存液)、Triton X-100(聚乙二醇辛基苯基醚)、1,1-二苯基-2-苦肼基(DPPH)購自北京索萊寶科技有限公司；96微量孔板購自美國康寧公司；采血針管購自江蘇華達醫(yī)療器械有限公司。

1.2 Hs-BD1基因成熟肽片段克隆

提取黃沙鱉肝臟總RNA，并反轉錄合成cDNA。參考許飄尹等[5]的方法獲得Hs-BD1基因ORF序列，在其成熟肽基因編碼區(qū)5'端和3'端分別設計1個帶有限制性酶切位點BamHⅠ的上游引物及帶有EcoRⅠ的下游引物，用于擴增Hs-BD1基因成熟肽部分。引物序列分別為rBD-F：5′-CGGGATCCACTAGGGACCGAGCATGTG-3′；rBD-R：5′-CGGAATTC CTAGACTCTGATCCTGC-3′。其中，單下劃線分別為BamHⅠ和EcoRⅠ的酶切位點，波浪線為終止密碼子位點，粗體為限制性內切酶的保護堿基。PCR反應體系(25.0 μL)：2×EASYTaqSupermix聚合酶12.5 μL，上、下游引物各1.0 μL，ddH2O 8.5 μL，cDNA模板2.0 μL。擴增程序：95 ℃預變性3 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，進行30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測后，將目的片段條帶進行膠回收純化并送至北京六合華大基因科技有限公司進行測序，以驗證所擴增的Hs-BD1基因成熟肽片段是否正確。

1.3 重組質粒pCold-TF-Hs-BD1構建及鑒定

將1.2回收獲得的PCR產(chǎn)物與載體pCold-TF分別用限制性內切酶BamHⅠ和EcoRⅠ進行雙酶切過夜反應，用DNA純化回收試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司]回收目的基因及載體片段，隨后將酶切純化后的pCold-TF質粒及Hs-BD1基因成熟肽序列片段進行連接，再將連接產(chǎn)物轉化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞中進行藍白斑篩選。以1.2的引物進行菌落PCR篩選陽性克隆菌落，陽性菌液送至北京六合華大基因科技有限公司進行測序，將鑒定正確的陽性菌液采用質粒小量快速提取試劑盒(北京艾德萊生物科技有限公司)提取重組質粒pCold-TF-Hs-BD1。

1.4 重組蛋白rHs-BD1誘導表達及鑒定

1.4.1 重組蛋白rHs-BD1誘導表達 將重組質粒pCold-TF-Hs-BD1轉化至大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細胞中。分別將30.0 μL含重組質粒pCold-TF-Hs-BD1和空質粒pCold-TF的大腸桿菌BL21(DE3)菌液轉移至5.0 mL LB液體培養(yǎng)基(含氨芐青霉素)中復蘇；將30.0 μL不含任何質粒的大腸桿菌BL21(DE3)菌液轉移至5.0 mL LB液體培養(yǎng)基(不含氨芐青霉素)復蘇，37 ℃下120 r/min振蕩過夜培養(yǎng)。隨后將這幾種培養(yǎng)液置于37 ℃下180 r/min振蕩培養(yǎng)6 h，每隔30 min測定1次菌液的OD值，直至菌液OD600 nm為0.4～0.5，然后將上述菌液置于15 ℃低溫搖床預冷30 min。加入終濃度為0.2、0.5、0.8和1.0 mmol/L的IPTG，15 ℃下180 r/min繼續(xù)誘導24 h。取1.0 mL已誘導的菌液置于1.5 mL離心管中，4 ℃下12 000 r/min離心5 min，去除上清液。然后向每個管內加入1.0 μL PMSF蛋白酶抑制劑和100.0 μL RIPA細胞快速裂解液，充分混勻并簡短離心后將其置于冰上靜置30 min。4 ℃下12 000 r/min離心5 min，分別收集沉淀和上清液。此時，重組蛋白rHs-BD1存在于該沉淀或上清液中，置于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 十二硫酸酯鈉—聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)和Western blotting檢測 按照SDS-PAGE凝膠制備試劑盒說明進行操作，表達上清液按4∶1比例加入5×SDS蛋白上樣緩沖液，表達沉淀則先加入100.0 μL 1×PBS吸打混勻，再加入適量上樣緩沖液混勻，簡短離心，100 ℃加熱5 min使蛋白充分變性。使用SDS-PAGE凝膠對表達上清液和表達沉淀進行重組蛋白rHs-BD1的電泳，以考馬斯亮藍染色檢測蛋白表達情況。經(jīng)SDS-PAGE后，將重組蛋白rHs-BD1轉移到PVDF膜上，將一抗Anti-6×His Tag抗體用Western一抗稀釋液按照1∶800的比例進行稀釋，于4 ℃避光過夜孵育。然后用1×TBST漂洗液洗去多余的一抗殘留物(避光搖床孵育約0.5 h)，每5 min更換1次漂洗液。將二抗辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG(H+L)抗體用二抗稀釋液以1∶5000比例稀釋，室溫避光搖床孵育1.0 h，去除二抗時用1×TBST漂洗液洗滌5～6次，每次約5 min?？贵w孵育完成后，去除多余的液體，晾干PVDF膜。用移液槍將混合顯色液均勻地加在PVDF膜上，于暗處放置3～5 min。將已顯色的PVDF膜置于ImageQuant LAS 500成像儀器中拍照觀察，利用ImageJ軟件對不同濃度IPTG誘導下重組蛋白rHs-BD1的Western blotting檢測結果進行灰度分析，比較蛋白的表達量。

1.5 重組蛋白rHs-BD1純化

利用Ni柱親和層析法進行重組蛋白rHs-BD1純化。將100.0 mL含重組蛋白rHs-BD1的大腸桿菌菌液12 000 r/min離心7 min后收集菌體，去除上層液體培養(yǎng)基后，加入100.0 μL PMSF蛋白酶抑制劑和10.0 mL RIPA細胞裂解液充分混勻，在冰上靜置30 min以裂解細菌細胞，然后4 ℃下12 000 r/min離心5 min，收集上清液，采用His標簽蛋白(可溶性)純化試劑盒進行分離純化。用20.0 mL Binding Buffer平衡純化柱后，以Binding Buffer等體積稀釋重組蛋白rHs-BD1樣品并上純化柱；分別用10.0和15.0 mmol/L咪唑洗脫雜蛋白，最后用Elution Buffer洗滌層析柱，洗滌、收集重組蛋白rHs-BD1，并進行SDS-PAGE驗證；純化后的重組蛋白rHs-BD1含量采用微孔BCA蛋白含量測定試劑盒進行測定。

1.6 抗菌活性檢測

采用最小抑菌濃度(MIC)法進行抗菌活性檢測。以氨芐青霉素、去離子水為對照，以大腸桿菌ATCC25922為質控菌株。將細菌劃線接種于LB固體培養(yǎng)基中，37 ℃過夜培養(yǎng)。將培養(yǎng)好的菌落用生理鹽水洗脫制成0.5 McF的菌懸液備用。首先，將重組蛋白rHs-BD1用滅菌生理鹽水進行倍比稀釋，在96孔板的一行12個孔中分別加入400.0、200.0、100.0 μg/mL……的2倍稀釋重組蛋白rHs-BD1樣品各30.0 μL，每個樣品設3個平行組；其次在各孔內分別加入90.0 μL腦心浸液(BHI)培養(yǎng)基混勻；最后，向各孔內分別加入已制備好的各種菌懸液30.0 μL，混勻。至此，12個孔的重組蛋白rHs-BD1樣品終含量依次為80.0、40.0、20.0 μg/mL……的2倍遞減濃度。陽性對照為等體積氨芐青霉素，12個孔的氨芐青霉素含量依次為400.0、200.0、100.0 μg/mL……的2倍遞減濃度，陰性對照為等體積去離子水。將96孔板置于37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)48.0 h，經(jīng)肉眼觀察無細菌生長孔的最小藥物濃度即為該藥物的MIC。

1.7 溶血性分析

參照廣慧娟[16]的方法進行溶血性分析。利用加入抗凝劑阿氏液的注射器采集4.0～5.0 mL新鮮黃沙鱉血液置于10.0 mL無菌EP管中，顛倒輕柔混勻。將采集的新鮮血液與生理鹽水按照1∶1比例上下顛倒輕柔混勻，4 ℃下2000 r/min離心5 min，棄上清液。再將等體積生理鹽水加入剩余沉淀中，緩慢顛倒混勻，4 ℃下2000 r/min離心5 min，反復洗滌直至上清液呈透明顏色為止。血細胞稀釋液制備：吸取上述血細胞沉淀100.0 μL置于15.0 mL無菌EP管中，加入10.0 mL生理鹽水顛倒混勻。試驗組設置：在血細胞稀釋液中加入不同含量的重組蛋白rHs-BD1，使其終含量分別為20.0、40.0、60.0和80.0 μg/mL；以1% Triton X-100為陽性對照，以生理鹽水為陰性對照，37 ℃孵育30 min，2000 r/min離心5 min。取上清液加入酶標板中，用酶標儀測定樣品在540 nm處的吸光值。每個樣品或對照設3個平行。

溶血率(%)=(樣品吸光值-生理鹽水組吸光值)/(陽性對照吸光值-生理鹽水組吸光值)×100

1.8 抗氧化能力檢測

參照廣慧娟[16]的方法，通過計算DPPH自由基清除率進行抗氧化能力檢測，整個試驗過程避光進行。稱取1.2 mg DPPH溶解于500.0 μL甲醇中獲得6×10-3mol/L DPPH母液，4 ℃避光保存?zhèn)溆?。試驗前用甲醇溶液將DPPH母液稀釋至終濃度為6×10-5mol/L的DPPH工作液。在DPPH工作液中加入不同含量的重組蛋白rHs-BD1，使其終含量分別為20.0、40.0、80.0和120.0 μg/mL，充分混合。以無菌生理鹽水為空白對照，室溫避光放置30 min，隨后用酶標儀檢測517 nm處的吸光值，每個樣品或對照設3個平行。

DPPH自由基清除率(%)=(樣品吸光值-空白對照吸光值)/空白對照吸光值×100

2 結果與分析

2.1 pCold-TF-Hs-BD1原核表達載體的構建及鑒定

以引物rBD-F和rBD-R擴增Hs-BD1基因成熟肽序列片段，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果(圖1-A)顯示，擴增片段長度約126 bp，片段大小與預期結果相符。PCR產(chǎn)物測序結果與Hs-BD1基因cDNA序列的成熟肽區(qū)比對無誤，表明序列擴增成功。pCold-TF質粒雙酶切結果(圖1-B)顯示，在5769 bp處有1條明顯的條帶，該條帶應為pCold-TF線性片段；重組質粒pCold-TF-Hs-BD1的雙酶切結果(圖1-C)顯示，在5769和126 bp處各有1條特異性條帶，其中，5769 bp處的特異性條帶應為pCold-TF線性片段，126 bp處的特異性條帶應為Hs-BD1基因成熟肽序列片段，均與預計結果相符，表明重組質粒pCold-TF-Hs-BD1構建成功。

2.2 重組蛋白rHs-BD1表達

SDS-PAGE分析結果(圖2)顯示，經(jīng)IPTG誘導且含重組質粒pCold-TF-Hs-BD1的大腸桿菌上清液和沉淀表達產(chǎn)物在58.1 kDa處均有1條特異性條帶，與融合蛋白分子量預測值一致，而未經(jīng)IPTG誘導的大腸桿菌表達產(chǎn)物無該特異性條帶，說明經(jīng)IPTG誘導后重組蛋白rHs-BD1成功獲得表達；重組蛋白rHs-BD1在上清液(泳道3～6)和沉淀(泳道9～12)中均有分布，說明誘導獲得表達的重組蛋白rHs-BD1存在可溶性和包涵體2種形式，后續(xù)試驗僅取上清液進行重組蛋白rHs-BD1純化。

Western blotting檢測結果(圖3)表明，由不同濃度IPTG誘導的含pCold-TF-Hs-BD1的大腸桿菌上清液表達產(chǎn)物在約58.1 kDa附近均有1條特異性顯色條帶，該條帶大小與融合蛋白分子量預測值一致，表明重組蛋白rHs-BD1與Anti-6×His Tag抗體發(fā)生特異性反應；未經(jīng)IPTG誘導的大腸桿菌表達產(chǎn)物無該特異性顯示條帶；當IPTG誘導濃度為0.2 mmol/L時重組蛋白rHs-BD1在上清液中的表達量最大(泳道2～5)?；叶确治鼋Y果(圖4)顯示，當IPTG濃度為0.5、0.8和1.0 mmol/L時重組蛋白rHs-BD1條帶的灰度均顯著低于當IPTG濃度為0.2 mmol/L時重組蛋白rHs-BD1條帶的灰度(P<0.05)?？梢?，Western blotting檢測結果可進一步證實重組蛋白rHs-BD1在大腸桿菌中已成功表達，且IPTG對含pCold-TF-Hs-BD1大腸桿菌上清液表達產(chǎn)物的最佳誘導濃度為0.2 mmol/L。

2.3 重組蛋白rHs-BD1的純化結果

SDS-PAGE檢測蛋白純化結果(圖5)顯示，經(jīng)IPTG誘導含pCold-TF-Hs-BD1的大腸桿菌上清液表達產(chǎn)物在約58.1 kDa處有明顯條帶(泳道1)，與融合蛋白預測值相符；將重組蛋白rHs-BD1上樣至純化柱后的樣品流出液在約58.1 kDa處未觀察到明顯條帶(泳道2～3)，說明重組蛋白rHs-BD1與純化柱中的Ni2+結合程度較好；經(jīng)10.0 mmol/L咪唑逐步洗脫(泳道4～6)，可見流出液中雜蛋白含量逐漸減少；采用15.0 mmol/L咪唑洗脫，可見流出液中雜蛋白含量進一步減少(泳道7～9)；采用Elution Buffer洗脫，在約58.1 kDa處可見較單一的蛋白條帶，該蛋白條帶應為重組蛋白rHs-BD1(泳道10)。說明以15.0 mmol/L咪唑可充分洗脫雜蛋白，以Elution Buffer可洗脫重組蛋白rHs-BD1。因此，以Elution Buffer洗脫的重組蛋白rHs-BD1進行后續(xù)蛋白含量測定和抗菌活性分析。

利用微孔BCA蛋白含量測定試劑盒所得測定值繪制標準曲線，計算重組蛋白rHs-BD1含量，得到試劑盒自帶標準品(BSA)的標準曲線公式為y=0.0009x+0.0016(圖6)。其中，x表示蛋白含量，y表示OD562 nm。已純化的重組蛋白rHs-BD1在OD562 nm處的吸光值為0.362，因此，根據(jù)標準曲線公式計算出其蛋白含量為400.0 μg/mL。

2.4 重組蛋白rHs-BD1的抗菌活性分析

由表1可知，重組蛋白rHs-BD1對革蘭氏陰性菌大腸桿菌YLG1、類志賀鄰單胞菌DAL1和遲鈍愛德華氏菌FCH1的MIC均為20.00 μg/mL，對革蘭氏陽性菌無乳鏈球菌HPG1和金黃色葡萄球菌HPN1的MIC為40.00 μg/mL，均高于傳統(tǒng)抗生素氨芐青霉素對這些細菌的MIC。說明重組蛋白rHs-BD1對這些革蘭氏陽性和陰性菌均具有一定的抗菌活性，但抗菌活性弱于氨芐青霉素。

2.5 重組蛋白rHs-BD1的溶血性分析

由表2可知，當重組蛋白rHs-BD1含量為20.0、40.0、60.0和80.0 μg/mL時，其對黃沙鱉血細胞的溶血性分別為1.5%、2.7%、3.3%和4.2%，即在含量為20.0～80.0 μg/mL范圍內，重組蛋白rHs-BD1的溶血性隨著其含量的升高而增強，但總體上未超過5.0%，說明重組蛋白rHs-BD1對黃沙鱉血細胞的溶血作用較弱。

2.6 重組蛋白rHs-BD1的抗氧化能力分析

由表3可知，當重組蛋白rHs-BD1含量為20.0、40.0、80.0和120.0 μg/mL時，其對DPPH自由基的清除率分別為2.6%、5.2%、11.6%和17.0%，即在含量為20.0～120.0 μg/mL范圍內，重組蛋白rHs-BD1的抗氧化能力隨著其含量的升高而增強，說明重組蛋白rHs-BD1具有一定的抗氧化能力。

表1 重組蛋白rHs-BD1和氨芐青霉素對幾種細菌的MIC比較

表2 黃沙鱉重組蛋白rHs-BD1的溶血性分析

3 討 論

采用大腸桿菌系統(tǒng)對真核生物來源的蛋白進行表達易出現(xiàn)錯誤折疊問題[17-18]，重組蛋白不能正確折疊可能會形成難溶解的包涵體，在重組蛋白的N端融合有助于蛋白表達和折疊的觸發(fā)因子TF可避免重組蛋白包涵體的形成[18]。本研究將Hs-BD1基因成熟肽片段序列連接到pCold-TF載體，通過分別收集裂解菌體的上清液和沉淀分析表達蛋白的可溶性，結果表明，重組蛋白rHs-BD1在上清液和沉淀中均有較明顯表達，但由于重組蛋白rHs-BD1在上清液的表達量較大，上清液表達產(chǎn)物能與Anti-6×His Tag抗體發(fā)生特異性反應，因此，可認為重組蛋白rHs-BD1為可溶性表達；重組蛋白rHs-BD1在沉淀中也有明顯表達，究其原因可能與裂解菌體的上清液和沉淀分離不徹底有關，但仍需進一步驗證。本研究中，使用0.2、0.5、0.8和1.0 mmol/L IPTG進行重組蛋白rHs-BD1的表達誘導，結果發(fā)現(xiàn)當IPTG誘導濃度為0.2 mmol/L時重組蛋白rHs-BD1在上清液中表達量最大，推測較高濃度的IPTG可能對細菌生長具有抑制作用，后續(xù)可通過測定OD600 nm來量化不同濃度IPTG對表達菌株生長的影響程度[19]。綜合考慮試驗成本，本研究中IPTG的最佳誘導濃度為0.2 mmol/L。經(jīng)過Ni親和層析柱純化后的重組蛋白rHs-BD1含量為400.0 μg/mL，低于部分文獻[6，10]報道β-防御素重組蛋白的純化濃度，其原因可能是：①在低濃度咪唑洗脫雜蛋白時有不少重組蛋白rHs-BD1被洗脫，導致最終純化的重組蛋白rHs-BD1量減少；②純化均在室溫條件下進行，而溫度與重組蛋白純化量呈負相關，在相對高溫條件下蛋白純化效率會降低[7]。后續(xù)可通過降低純化溫度或增大粗蛋白上樣量再經(jīng)超濾濃縮方法獲得更高濃度的純化蛋白。

Hs-BD1成熟蛋白的C端包含由6個Cys殘基形成的3對二硫鍵，空間構象穩(wěn)定，不易被蛋白酶水解，具有α-螺旋和β-折疊片結構，化學結構牢固[13]，富含正電荷并易吸附在帶負電荷的病原菌磷脂膜表面，引起細胞膜破損[5，20]。本研究發(fā)現(xiàn)，重組蛋白rHs-BD1不受His標簽影響，無需酶切處理即可顯示廣譜抗菌活性，與Su等[21]、Zhou等[22]、符梅等[23]的研究結果相似；重組蛋白rHs-BD1對3種革蘭氏陰性菌的抗菌效果稍強于2種革蘭氏陽性菌，可能與革蘭氏陽性菌和陰性菌的細胞壁結構和組成成分不同有關；與其他人工合成的抗菌肽相比，重組蛋白rHs-BD1對革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌的抑菌活性稍強于人巨噬細胞重組β-防御素130(MIC為45.00 μg/mL)[9]，但弱于化學合成的綠蠅防御素phormicin A的抑菌活性(MIC為2.00 μg/mL)[8]和脆皮大頭蛙抗菌肽Lf-CATHla的抑菌活性(MIC為12.25 μg/mL)[16]；對革蘭氏陰性菌大腸桿菌的抑菌活性強于Lf-CATHla(MIC為50.00 μg/mL)[16]、β-防御素130(MIC為60.00 μg/mL)[9]和防御素phormicin A(MIC為300.00 μg/mL)[8]，但相較于傳統(tǒng)抗生素氨芐青霉素，重組蛋白rHs-BD1的抗菌效果存在一定差距，后續(xù)可通過氨基酸定點突變技術增加多肽的帶正電性或采取改良分子結構來提高重組蛋白rHs-BD1的抗菌活性[24]。

溶血性是檢測生物制劑對機體是否安全的重要指標。已報道的各種β-防御素重組蛋白的溶血率均相對較低，如500.0 μg/mL鴿重組蛋白AvBD1的溶血率僅1.94%[25]，500.0 μg/mL鴨重組蛋白AvBD5對鴨血紅細胞的溶血率為7.47%[26]，而豬重組蛋白rPBD114在含量小于256.0 μg/mL時，其溶血率均小于3.90%，且對細胞的毒性也較低[21]。本研究結果表明，當重組蛋白rHs-BD1含量小于80.0 μg/mL時，其溶血率低于4.20%，說明重組蛋白rHs-BD1對黃沙鱉血細胞傷害較小、安全性較高，具有作為生物制劑進行開發(fā)的潛力。

在正常機體中，活性氧自由基代謝失調會干擾機體細胞的正常功能[27]。已報道的許多重組抗菌肽均具有DPPH自由基清除作用，如86.8 μmol/L的亞洲璃眼蜱重組防御素蛋白Ha-defensin-1和160.0 μg/mL的脆皮大頭蛙Lf-CATHla對DPPH自由基的清除率分別為20.50%[28]和57.79%[16]。本研究結果表明，當重組蛋白rHs-BD1含量為20.0、40.0、80.0和120.0 μg/mL時，其對DPPH自由基的清除率分別為2.6%、5.2%、11.6%和17.0%，說明重組蛋白rHs-BD1對DPPH自由基具有一定的清除作用和抗氧化能力，可作為一種新型抗氧化藥物應用于因自由基過量累積引起的疾病治療。

為有效控制黃沙鱉細菌性疾病提供新途徑，本研究前期克隆獲得了黃沙鱉cathelicidin基因cDNA序列。本研究中，通過對Hs-BD1進行原核表達成功獲得具有廣譜抗菌活性及一定抗氧化能力的可溶性重組蛋白rHs-BD1，對開展黃沙鱉病害綠色防治及穩(wěn)定和發(fā)展黃沙鱉養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)具有重要意義。但有關蛋白純化條件優(yōu)化及重組蛋白rHs-BD1的毒理作用仍需深入探究，以便將研究結果更好地應用于生產(chǎn)實踐。

4 結 論

基于Hs-BD1基因成熟肽序列成功構建了pCold-TF-Hs-BD1原核表達載體。經(jīng)大腸桿菌原核表達的重組蛋白rHs-BD1主要為可溶性表達，其分子量約58.1 kDa。經(jīng)純化的重組蛋白rHs-BD1含量為400.0 μg/mL，具有一定的廣譜抗菌活性和抗氧化能力，對黃沙鱉血細胞的溶血作用相對較弱，且對機體毒副作用較低，可用于新型黃沙鱉抗菌藥物開發(fā)。