黃素偉，張偉巍，逯 娜，張 雁，徐昌富

張家口市第一醫(yī)院 胸外科，河北 張家口 075041

急性肺損傷（acute lung injury，ALI）多由直接和間接致傷因素導(dǎo)致肺泡上皮細(xì)胞及毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，造成彌漫性肺間質(zhì)及肺泡水腫，進(jìn)而出現(xiàn)急性低氧性呼吸功能不全［1-5］。有研究表明，炎癥因子白細(xì)胞介素4（interleukin 4，IL-4）、白細(xì)胞介素8（interleukin 8，IL-8）與toll 樣受體4（toll like receptor 4，TLR4）炎性信號(hào)通路相關(guān)，通過(guò)刺激巨噬細(xì)胞的激活干預(yù)ALI 的進(jìn)展［6-7］。在急性肺損傷的治療中，IL-4、白細(xì)胞介素10（interleukin 10，IL-10）和白細(xì)胞介素13（interleukin 13，IL-13）也發(fā)揮重要作用［8］。由此可見(jiàn)，炎癥因子是ALI 的重要生物學(xué)標(biāo)志物，同時(shí)有研究表明，炎癥因子可能通過(guò)誘導(dǎo)肺部細(xì)胞凋亡對(duì)ALI進(jìn)行干預(yù)［9-10］。本研究建立新西蘭兔單根多根多段ALI 模型，旨在探討多根多段與單根肋骨骨折ALI 炎癥生物學(xué)標(biāo)志物的變化差異，并分析多根多段肋骨骨折是否會(huì)影響肺組織細(xì)胞的凋亡?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器 60 只8 月齡新西蘭兔，體質(zhì)量（3.0±0.2）kg，雌雄各30 只，購(gòu)于北京市海淀興旺動(dòng)物養(yǎng)殖場(chǎng)［SYXK（京）2019-0054］。所有新西蘭兔月齡相近、體質(zhì)量相差不超過(guò)0.1 kg 雌雄各半。將新西蘭兔隨機(jī)分為3 組，對(duì)照組、單根組和多根組每組各20 只。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)醫(yī)院倫理委員會(huì)審核。PM7000 心電監(jiān)護(hù)儀（深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司），AVlCOMPACT3 型血?dú)夥治鰞x（瑞士雷度公司），LECA-RM2135 型石蠟切片機(jī)（德國(guó)萊卡公司），olympus bx40 光學(xué)顯微鏡（日本奧林巴斯公司），KS50R 低速離心機(jī)（凱達(dá)科學(xué)儀器有限公司），680 全自動(dòng)ELISA 儀（美國(guó)BIO-RAD 公司）。

1.2 研究方法

1.2.1 新西蘭兔模型構(gòu)建、分組及處理 實(shí)驗(yàn)前，新西蘭兔禁食6 h。用3% 戊巴比妥鈉注射液（40 mg/kg）腹腔注射麻醉后，取仰臥位固定于動(dòng)物固定臺(tái)上，脫去胸部及上腹部兔毛。將單根組新西蘭兔置于BIM-Ⅵ型生物撞擊機(jī)下，采用重362.8 g、直徑4.4 cm鋼球自撞擊機(jī)鋼管從1.0 m 高處，以自由下落方式撞擊動(dòng)物右側(cè)胸壁處致傷，多根組從1.5 m 高處，以自由下落方式撞擊動(dòng)物右側(cè)胸壁處致傷，對(duì)照組僅麻醉不撞擊，連接心電監(jiān)護(hù)儀記錄各組新西蘭兔傷前和傷后的呼吸頻率變化。

1.2.2 新西蘭兔血?dú)夥治?在致傷后24 h，用1.0 ml 動(dòng)脈血?dú)忉槼槿「鹘M新西蘭兔股動(dòng)脈血液樣本0.5 ml，在AVlCOMPACT3 型全自動(dòng)血?dú)夥治鰞x上測(cè)定肺泡動(dòng)脈氧分壓（arterial partial pressure of oxygen，PaO2），動(dòng)脈血二氧化碳分壓（arterial partial pressure of carbon dioxide，PaCO2），血氧飽和度（blood oxygen saturation，SaO2）。

1.2.3 酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)炎癥標(biāo)志物表達(dá) 新西蘭兔取動(dòng)脈血2 ml，4℃下3 000 r/min 離心10 min，收集上清液，分裝到EP 管中，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)血清中IL-4（RAB0301，美國(guó)sigma 公司）、IL-8（RAB1110，美國(guó)sigma 公司）和IL-10（RAB0802，美國(guó)sigma 公司）表達(dá)水平，于吸光度450 nm 下進(jìn)行各樣本吸光度檢測(cè)，每個(gè)樣本3 個(gè)復(fù)孔。

1.2.4 蘇木精-伊紅染色法檢測(cè)肺病理?yè)p傷 取各組新西蘭兔肺組織的石蠟包埋組織，用石蠟切片機(jī)切4 μm 厚度切片，60℃烘5 min；二甲苯Ⅰ脫臘20 min，二甲苯Ⅱ脫臘10 min，1/2 二甲苯+1/2 無(wú)水乙醇-100%-95%-85%-70%-50% 乙醇各1 min，自來(lái)水沖洗15 s；蘇木素染色5 min，自來(lái)水沖洗1 min，使切片變藍(lán)；1% 鹽酸乙醇分化10 s，自來(lái)水沖洗1 min；1% 稀氨水返藍(lán)10 s，自來(lái)水洗1 min；伊紅染色1 min，自來(lái)水洗30 s；依次運(yùn)用不用濃度的50%、70%、80% 乙醇脫水各1 min，再用95% 乙醇漂色1 min，無(wú)水乙醇脫水5 min，最后放入二甲苯Ⅰ3 min，二甲苯Ⅱ3 min；中性樹(shù)膠封片后顯微鏡下進(jìn)行觀察。

1.2.5 蛋白免疫印跡法檢測(cè)凋亡標(biāo)志蛋白表達(dá) 取適量肺組織在液氮中研磨并取總蛋白，使用BCA 法測(cè)定蛋白濃度，采用5×十二烷基硫酸鈉的蛋白上樣緩沖液在98℃上煮沸10 min 后儲(chǔ)存于-80℃冰箱備用。實(shí)驗(yàn)時(shí)將各樣本加入不同的泳道，濃縮膠電壓80 V 10 min，分離膠電壓110 V 2 h，后轉(zhuǎn)至PVDF 膜，5% 脫脂奶粉封閉2 h。加入特異性一抗B 淋巴細(xì)胞瘤-2 基因（B-lymphocytoma-2 gene BCL2）、BCL2-associated X 的蛋白質(zhì)（BCL2-associated X protein，BAX）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（Caspase3）和GAPDH（1∶2 000，bs-0755R，北京Bioss 有限公司）于4℃冰箱過(guò)夜。TBST 洗膜3 次，每次5 min，加入特異性二抗，孵育1 h。TBST 洗膜3 次，每次5 min，采用ECL 化學(xué)發(fā)光液曝光顯影，使用Photoshop 圖像分析軟件系統(tǒng)進(jìn)行半定量分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 23.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間比較采用雙尾獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組新西蘭兔的呼吸頻率比較 建模前，3 組新西蘭兔的呼吸頻率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。建模后，與對(duì)照組比較，單根組和多根組新西蘭兔呼吸頻率顯著升高，且多根組顯著高于單根組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 3 組新西蘭兔呼吸頻率變化情況比較（，次/min）

表1 3 組新西蘭兔呼吸頻率變化情況比較（，次/min）

注：與對(duì)照組比較，①P＜0.05；與單根組比較，②P＜0.05

2.2 各組新西蘭兔骨動(dòng)脈血?dú)獗容^ 與對(duì)照組比較，單根組和多根組PaO2、SaO2顯著降低，PaCO2顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與單根組比較，多根組PaO2和SaO2顯著降低，PaCO2顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表2。

表2 各組新西蘭兔動(dòng)脈血?dú)庾兓闆r比較（）

表2 各組新西蘭兔動(dòng)脈血?dú)庾兓闆r比較（）

注：與對(duì)照組比較，①P＜0.05；與單根組比較，②P＜0.05；1 mmHg=0.133 kPa

2.3 各組新西蘭兔血清炎癥因子表達(dá)水平比較 與對(duì)照組比較，單根組和多根組IL-4、IL-8 和IL-10 表達(dá)水平顯著升高，且多根組較單根組升高更明顯，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表3。

表3 各組新西蘭兔血清炎癥因子表達(dá)水平比較（，pg/ml）

表3 各組新西蘭兔血清炎癥因子表達(dá)水平比較（，pg/ml）

注：與對(duì)照組比較，①P ＜0.05；與單根組比較，②P ＜0.05

2.4 各組新西蘭兔肺病理學(xué)比較 與對(duì)照組比較，單根組和多根組均出現(xiàn)急性肺損傷表現(xiàn)，肺組織明顯淤血，肺泡萎陷并呈局灶性、梅花樣的肺不張表現(xiàn)，肺組織可見(jiàn)大小不一的不規(guī)則點(diǎn)、片狀出血區(qū)域，切面可見(jiàn)紅色滲液溢出，并伴有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；多根組病理學(xué)結(jié)果嚴(yán)重程度高于單根組，肺泡萎陷增加，出血區(qū)域擴(kuò)大，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)增加，提示多根肋骨骨折造成了嚴(yán)重的肺部損傷和肺部細(xì)胞凋亡。見(jiàn)圖1。

圖1 各組新西蘭兔肺病理學(xué)結(jié)果比較（蘇木精-伊紅染色×200）

2.5 各組新西蘭兔肺部組織凋亡信號(hào)通路分子的比較 蛋白免疫印跡法檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，單根組和多根組B 淋巴細(xì)胞瘤-2 基因（B-lymphocytoma-2 gene BCL2）-associated X 的 蛋白質(zhì)（BCL2-associated X protein，BAX）、Casepase3蛋白表達(dá)水平顯著上升，BCL2 表達(dá)水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與單根組比較，多根組BAX、Casepase3 蛋白表達(dá)水平顯著上升，BCL2 表達(dá)水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)圖2。

圖2 各組新西蘭兔肺部組織凋亡信號(hào)通路分子的比較

3 討論

ALI 的臨床特征為肺容積減少、肺順應(yīng)性降低、通氣/血流比例失調(diào)，伴有進(jìn)行性低氧血癥和呼吸窘迫，肺部影像學(xué)表現(xiàn)為非均一性的滲出性病變［11-12］。胸部撞擊傷致ALI 的致傷機(jī)制尚不完全清楚，有研究認(rèn)為，直接暴力撞擊時(shí)強(qiáng)大的外力壓迫胸壁，使胸腔體積迅速縮小，胸腔內(nèi)壓力快速升高，壓迫肺組織，使其出血、水腫，當(dāng)外力撤除后，胸廓回彈，在產(chǎn)生胸腔內(nèi)負(fù)壓的同時(shí)，受壓肺組織快速?gòu)?fù)張，加重肺組織原來(lái)受損區(qū)域的損傷，過(guò)度和失控的炎癥反應(yīng)導(dǎo)致肺組織發(fā)生繼發(fā)性損傷。炎癥反應(yīng)及炎性因子釋放在胸部撞擊傷致急性肺損傷的發(fā)展過(guò)程中起關(guān)鍵的作用，也是肺損傷后病情復(fù)雜的重要原因［13-17］。但白細(xì)胞介素在創(chuàng)傷造成的多根多段肋骨骨折所致肺損傷中發(fā)揮的作用尚不清晰。本研究結(jié)果顯示，單根組和多根組新西蘭兔肺損傷加劇，呼吸頻率顯著升高，PaO2和SaO2顯著降低，PaCO2顯著升高。這提示肺部功能的損傷。結(jié)合HE 病理分析，多根組出現(xiàn)肺組織淤血，肺泡萎陷及肺不張等炎性細(xì)胞浸潤(rùn)表現(xiàn)，證實(shí)了多根多段肋骨骨折會(huì)造成顯著的肺細(xì)胞損傷。本研究結(jié)果顯示，單根組和多根組新西蘭兔外周血IL-4、IL-8、IL-10 等炎性因子均顯著增加，且多根組顯著高于單根組。這提示炎癥因子的釋放與骨折損傷程度存在一定關(guān)系。

BAX 和BCL2 是參與細(xì)胞凋亡的重要基因［18］。有研究表明，BAX/BCL2/Caspase9/Caspase3 途徑可以顯著調(diào)控非小細(xì)胞肺癌癌細(xì)胞增殖、凋亡過(guò)程，且參與肺癌細(xì)胞周期調(diào)控［19］。本研究結(jié)果顯示，單根組和多根組BAX、Casepase3 蛋白表達(dá)水平顯著上升，BCL2 表達(dá)水平降低，且多根組各蛋白表達(dá)水平的改變程度均高于單根組。這提示，BAX、BCL2 及Caspase3 分子是機(jī)械損傷致多根多段肋骨骨折造成肺組織損傷的重要調(diào)控因子，其參與了炎性誘導(dǎo)的肺損傷過(guò)程。

綜上所述，本研究證實(shí)了多根多段肋骨骨折會(huì)造成新西蘭兔肺部嚴(yán)重病理?yè)p傷，炎癥標(biāo)志物表達(dá)水平上升，凋亡標(biāo)志物表達(dá)水平發(fā)生顯著變化，且生物標(biāo)志物改變水平可能與損傷程度有一定的相關(guān)性。