李 鑫，方 超，李建華

（1.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)分院，黑龍江 齊齊哈爾 161006；2.哈藥集團生物疫苗有限公司，哈爾濱 150069）

在動物血清抗體監(jiān)測過程中，常進行血凝-血凝抑制試驗，如新城疫病毒抗體、禽流感病毒抗體、減蛋綜合征病毒抗體等，均需要新鮮的1%雞紅細(xì)胞作為材料輔助進行試驗。但新鮮雞紅細(xì)胞的制備需要特定環(huán)境（無病毒感染）下的SPF大公雞，且保存期較短，配制繁瑣，所以使用方便和穩(wěn)定的雞紅細(xì)胞保存方法是必然的需求。本研究通過借鑒相關(guān)研究制備了醛化雞紅細(xì)胞、凍干雞紅細(xì)胞，并與1%新鮮的雞紅細(xì)胞進行了對比試驗，以期為適用于現(xiàn)地實際應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料

磷酸緩沖鹽溶液（PBS），購自Biosharp公司，按說明書添加雙蒸水，調(diào)節(jié)pH值為7.2～7.4；2.5%戊二醛溶液（C5H8O2），購自中國醫(yī)藥（集團）上?；瘜W(xué)試劑公司；血凝-血凝抑制用新城疫病毒標(biāo)準(zhǔn)抗原/抗體、血凝-血凝抑制用禽流感H9病毒標(biāo)準(zhǔn)抗原/抗體，均為哈藥集團生物疫苗有限公司制備。

2 方法

2.1 新鮮雞紅細(xì)胞的制備

參照楊志峰[1]制備雞紅細(xì)胞的方法，選擇12個月以上的SPF公雞，翅下靜脈無菌采集血液至抗凝管中，低速（3 000 r·min-1）離心5 min，去除上層液，留取下層雞紅細(xì)胞，用PBS液洗滌，再離心，去上清，重復(fù)2次。最后，采用PBS重懸雞紅細(xì)胞，配制成10%的雞紅細(xì)胞懸液，置于4℃冰箱中保存。

2.2 1%雞紅細(xì)胞的制備

取新鮮配制的10%雞紅細(xì)胞，1 500 r·min-1離心5 min，參考王宇波等[2]的方法，按血細(xì)胞比容用pH為7.2～7.4的PBS液重懸，得到1%雞紅細(xì)胞，放置于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 醛化紅細(xì)胞的制備

根據(jù)萬勇虎等[3]、孫軍杰等[4]試驗結(jié)果，確定醛化紅細(xì)胞的制備方案。將雞紅細(xì)胞緩慢加入2.5%戊二醛溶液中，配制成1%紅細(xì)胞懸液，在4℃條件下醛化5 h，放置于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4 凍干紅細(xì)胞的制備

曾麗亞[5]在《診斷用凍干雞紅細(xì)胞的制備》研究中，制定了適合紅細(xì)胞凍干的條件：將醛化后紅細(xì)胞懸液置于液氮氣相中平衡30 min，凍干體系達(dá)到超冷狀態(tài)但未出現(xiàn)結(jié)冰，再置于冷凍干燥機中抽真空，凍干時間設(shè)置為20 h，凍干隔板溫度為-35℃，最后將西林瓶壓蓋、封裝。取凍型完整、顏色均勻和空隙致密的凍干紅細(xì)胞，放置于-20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

2.5 微量血凝-血凝抑制試驗

設(shè)2個試驗組，分別為醛化紅細(xì)胞試驗組、凍干紅細(xì)胞試驗組，以及對照組（1%新鮮雞紅細(xì)胞），見表1。以上各組同時進行新城疫病毒和禽流感H9病毒的微量血凝-血凝抑制比較試驗，具體步驟參照康華玲等[6]、黃艷羚等[7]的試驗方法。

表1 試驗分組

2.6 現(xiàn)地臨床血清樣本檢測

隨機無菌采集取某雞場現(xiàn)地雞血10份，進行3 500 r·min-1離心5 min，分離血清，分別使用2.5%醛化紅細(xì)胞、2%凍干紅細(xì)胞、1%新鮮雞紅細(xì)胞進行新城疫病毒抗體和禽流感H9病毒抗體檢測，觀察各試驗組的差異。

3 結(jié)果與分析

3.1 新城疫病毒血凝-血凝抑制試驗（NDV HAHI）

通過新城疫病毒血凝-血凝抑制試驗，重復(fù)3次同時比較試驗，取平均值（保留整數(shù)），可以看出：對照組與試驗組1和試驗組2存在明顯差異。在血凝試驗中，對照組較試驗組1和試驗組2的血凝價均高，且試驗組1比對照組低2個效價、試驗組2比對照組低3個效價，具體見表2；在血凝抑制試驗中，試驗組1比對照組的新城疫血凝抑制價

高1個效價，試驗組2比對照組的血凝抑制價高2個效價。通過重復(fù)試驗比較可知，試驗組1和試驗組2與對照組的血凝價-血凝抑制價差異穩(wěn)定，具體見表2、表3。

表2 新城疫病毒血凝試驗結(jié)果

表3 新城疫病毒血凝抑制試驗結(jié)果

3.2 禽流感H9病毒血凝-血凝抑制試驗（AIVH9 HA-HI）

通過禽流感H9病毒血凝-血凝抑制試驗，重復(fù)3次同時比較試驗，取平均值（保留整數(shù)），在血凝試驗中，對照組較試驗組1、試驗組2的血凝價均高，且試驗組1比對照組低1個效價、試驗組2比對照組低2個效價，具體見表4；在血凝抑制試驗中，試驗組1比對照組禽流感血凝抑制價高1個效價，試驗組2比對照組血凝抑制價高2個效價，具體見表5?？煽闯?，對照組與試驗組仍存在明顯差異。重復(fù)試驗可以看出，差異存在是穩(wěn)定的。

表4 禽流感H9病毒血凝試驗結(jié)果

表5 禽流感H9病毒血凝抑制試驗結(jié)果

3.3 現(xiàn)地臨床樣本檢測

在某雞場現(xiàn)地采集的血液，分離得到血清約0.75 mL·只-1，使用不同紅細(xì)胞懸液，各重復(fù)3次。新城疫、禽流感H9的血凝抑制試驗中，使用2.5%醛化紅細(xì)胞、2%凍干紅細(xì)胞的抗體效價結(jié)果均高于1%新鮮雞紅細(xì)胞（分別為8.2 lb、9.7 lb和7.4 lb；7.0 lb、8.0 lb和6.3 lb；），且符合試驗組中兩者之間的抗體差異規(guī)律。詳細(xì)結(jié)果見表6。

表6 現(xiàn)地臨床樣本血清檢測結(jié)果lb

4 分析與討論

禽類抗體監(jiān)測是養(yǎng)殖業(yè)的重點項目，從抗體檢測結(jié)果中可以得到禽類的免疫情況及有無潛在的疫病存在。禽類抗體檢測通常在實驗室采用瓊括試驗、間接酶聯(lián)免疫吸附試驗、微量血凝抑制試驗等進行，但在現(xiàn)地抗體臨檢通常采用微量血凝-血凝抑制試驗，試驗中需要新鮮的雞紅細(xì)胞，但新鮮雞紅細(xì)胞制備需要離心機、SPF大公雞等條件，現(xiàn)場制備麻煩，因此這成為限制臨床檢測禽類血清樣本的因素[8]。通過醛化紅細(xì)胞和凍干紅細(xì)胞替代新鮮雞紅細(xì)胞進行檢測，可為現(xiàn)地臨床試驗提供便利。

通過2.5%醛化紅細(xì)胞（試驗組1）、2%凍干紅細(xì)胞（試驗組2）與1%新鮮雞紅細(xì)胞（對照組）比較試驗發(fā)現(xiàn)，在新城疫病毒血凝試驗中，試驗組1與對照組比低2個效價，試驗組2與對照組比低3個效價；而在禽流感-H9病毒血凝試驗中，試驗組1較對照組低1個效價，試驗組2較比照組低2個效價。在新城疫血凝抑制試驗中，試驗組1較對照組高1個效價，試驗組2較對照組高2個效價；在禽流感-H9病毒血凝抑制試驗中，試驗組1較對照組高1個效價，試驗組2較對照組高2個效價。3組之間的差異存在著一定的規(guī)律性[9]。

有報道表明，2.5%戊二醛可改變紅細(xì)胞表面受體結(jié)構(gòu)，從而使紅細(xì)胞的血凝活性發(fā)生改變[10]，所以醛化的雞紅細(xì)胞與新鮮的雞紅細(xì)胞的血凝價等存在一定差異。新鮮的雞紅細(xì)胞保存期短，僅能維持5 d左右，之后會發(fā)生紅細(xì)胞破裂，但由于戊二醛存在2個具有反應(yīng)活性的醛基，可與新鮮紅細(xì)胞上的自由氨基或者巰基結(jié)合，從而增加了紅細(xì)胞的機械強度，不容易發(fā)生破碎，延長了紅細(xì)胞的保存期[11]。

凍干紅細(xì)胞是通過醛化后的雞紅細(xì)胞冷凍真空干燥制備而成，凍干紅細(xì)胞加水復(fù)原后，細(xì)胞形態(tài)完整，仍可進行血凝-血凝抑制試驗，原則上血凝價與醛化后的雞紅細(xì)胞相同，但在凍干前分裝或操作不當(dāng)均會造成紅細(xì)胞的破壞，所以在血凝-血凝抑制試驗中，醛化的雞紅細(xì)胞與冷凍真空干燥的雞紅細(xì)胞存在1～2個效價差。醛化的雞紅細(xì)胞保存時間大概為3個月以上[12]，而凍干紅細(xì)胞在4℃條件下可維持半年以上[13]。

通過現(xiàn)地臨床檢測雞的新城疫病毒、禽流感H9病毒抗體情況，可以看出醛化紅細(xì)胞、凍干紅細(xì)胞與新鮮的雞紅細(xì)胞的抗體效價之間的差異是穩(wěn)定存在的，且醛化紅細(xì)胞與新鮮雞紅細(xì)胞及凍干紅細(xì)胞與新鮮紅細(xì)胞之間的差值也是相對穩(wěn)定的。所以，在現(xiàn)地進行血凝-血凝抑制試驗，可應(yīng)用醛化紅細(xì)胞或凍干紅細(xì)胞來代替1%新鮮雞紅細(xì)胞。

新鮮的雞紅細(xì)胞制備簡單，但在4℃條件下保存期僅為5 d左右，醛化的紅細(xì)胞保存期所有延長，但兩者在現(xiàn)地檢測中，存在運輸問題，若路途顛簸，可能造成紅細(xì)胞的二次破裂，影響試驗結(jié)果。而凍干雞紅細(xì)胞形態(tài)穩(wěn)定，不易再受外界影響破壞紅細(xì)胞，對結(jié)果影響較小。綜上所述，在現(xiàn)地進行血凝-血凝抑制試驗時可使用2%凍干雞紅細(xì)胞來代替1%新鮮雞紅細(xì)胞。