黃穎然，葉欣晴，劉 娟，于 洋

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，國(guó)家獸醫(yī)微生物耐藥性風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室，廣州 510642)

一項(xiàng)關(guān)于碳青霉烯類抗生素敏感性值對(duì)醫(yī)院病人死亡率影響的研究表明，MIC(minimum inhibitory concentration)值每增加2倍，病人死亡率也相應(yīng)提高2倍，數(shù)據(jù)提示，隨著抗菌藥物的廣泛使用，耐藥細(xì)菌不斷涌現(xiàn)并迅速擴(kuò)散傳播，嚴(yán)重弱化其療效，威脅著人類健康及公共衛(wèi)生安全。如何有效抗擊抗生素的耐藥性，成為全球科學(xué)家們當(dāng)前最為關(guān)注的問(wèn)題之一，新型抗菌策略的開(kāi)發(fā)迫在眉睫。然而新藥的研發(fā)速度遠(yuǎn)不及細(xì)菌耐藥性進(jìn)化的快速變遷，因此急需尋找其他途徑來(lái)延緩耐藥細(xì)菌所帶來(lái)的后抗生素時(shí)代的危機(jī)。通過(guò)聯(lián)合用藥于病原菌，并利用細(xì)菌的耐藥性進(jìn)化缺陷，如附屬敏感性(collateral sensitivity)來(lái)優(yōu)化耐藥細(xì)菌及癌細(xì)胞的治療方案，以更大程度地發(fā)揮藥物療效，延長(zhǎng)現(xiàn)有藥物的使用壽命是一種有效且被廣泛認(rèn)可的治療思路。附屬敏感性(collateral sensitivity)又稱交互敏感性、協(xié)同敏感性、側(cè)枝敏感性，由Szybalski和Bryso等于1952年首次在大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)并提出，即細(xì)菌對(duì)某一藥物敏感性下降時(shí)反而對(duì)另一藥物敏感性提高的現(xiàn)象。但可能由于以前細(xì)菌所展現(xiàn)的附屬敏感性未能引起人們的注意、其產(chǎn)生機(jī)制較為復(fù)雜，以及多數(shù)附屬敏感性的研究主要集中于腫瘤領(lǐng)域等原因，闡明細(xì)菌附屬敏感性現(xiàn)象或機(jī)制的相關(guān)研究并不多見(jiàn)。直到2013年，Imamovic和Sommer所繪制的大腸桿菌與各種藥物間的附屬敏感性關(guān)系圖以及 Lázár等于分子層面上解釋大腸桿菌對(duì)氨基糖苷類藥物所產(chǎn)生的附屬敏感性機(jī)制,為附屬敏感性的研究帶來(lái)了重大的突破，細(xì)菌附屬敏感性于近年又重新引起了科學(xué)家們的重視。后續(xù)多項(xiàng)關(guān)于附屬敏感性廣泛存在于細(xì)菌和癌細(xì)胞以及利用附屬敏感性來(lái)優(yōu)化藥物療效方案的研究報(bào)道亦指示了其樂(lè)觀的治療前景。

由于細(xì)菌基因表達(dá)調(diào)控、代謝以及表型改變之間的互作較為復(fù)雜，細(xì)菌在耐藥性進(jìn)化過(guò)程中既可產(chǎn)生交叉耐藥性(cross resistance)，也可產(chǎn)生附屬敏感性。隨著對(duì)細(xì)菌附屬敏感性的深入研究，人們發(fā)現(xiàn)其發(fā)生概率并不穩(wěn)定且規(guī)律性不強(qiáng)。因此，需要提升對(duì)細(xì)菌附屬敏感性發(fā)生機(jī)制的認(rèn)識(shí)，以更準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)細(xì)菌耐藥性基因的出現(xiàn)、突變和傳播的方法，從而更有針對(duì)性地利用附屬敏感性制定新型治療方案。本文對(duì)附屬敏感性的產(chǎn)生規(guī)律及影響細(xì)菌附屬敏感性的關(guān)鍵因素進(jìn)行綜述，并以此提出目前研究的不足以及未來(lái)發(fā)展的可能方向。

1 細(xì)菌耐藥性進(jìn)化與附屬敏感性

1.1 附屬敏感性體現(xiàn)了細(xì)菌耐藥性進(jìn)化路線選擇的多樣性

細(xì)菌耐藥性進(jìn)化是極為復(fù)雜的過(guò)程，在特定抗生素存在的情況下，細(xì)菌可通過(guò)改變其結(jié)構(gòu)、生理生化活動(dòng)以適應(yīng)抗生素給予的生存壓力，進(jìn)化出耐藥性。從遺傳學(xué)的角度而言，多種染色體的突變、耐藥質(zhì)粒轉(zhuǎn)導(dǎo)、抗性基因的獲得等均是細(xì)菌常見(jiàn)的耐藥性進(jìn)化方式，而這些遺傳物質(zhì)改變后往往具有多效作用。因此，在細(xì)菌耐藥性進(jìn)化過(guò)程中，其對(duì)單一藥物產(chǎn)生耐藥性的同時(shí)，也可能會(huì)對(duì)其他藥物產(chǎn)生耐藥性，即交叉耐藥性；相反地，如果對(duì)其他藥物的敏感性提高，則產(chǎn)生了附屬敏感性。附屬敏感性和交叉耐藥性均是細(xì)菌耐藥性進(jìn)化過(guò)程中的存在形式，且交錯(cuò)存在于細(xì)菌耐藥性進(jìn)化過(guò)程中,是細(xì)菌耐藥性進(jìn)化路線選擇多樣性的一種體現(xiàn)。

1.2 附屬敏感是細(xì)菌耐藥性進(jìn)化過(guò)程中的一種“進(jìn)化代價(jià)”

細(xì)菌耐藥程度的變化及由此產(chǎn)生的適應(yīng)性代價(jià)(fitness cost)是決定其耐藥性進(jìn)化是否成功的因素之一。細(xì)菌對(duì)某種藥物進(jìn)化出耐藥性利于其生存和傳播的同時(shí)，也可能會(huì)因此導(dǎo)致其遺傳負(fù)荷增加、細(xì)胞生理生化活動(dòng)減弱等不利變化，即產(chǎn)生適應(yīng)性代價(jià)。細(xì)菌在耐藥性進(jìn)化中的適應(yīng)性代價(jià)普遍表現(xiàn)為發(fā)生耐藥性進(jìn)化的細(xì)菌在去除相應(yīng)藥物后，其生長(zhǎng)速率依然下降。適應(yīng)性代價(jià)決定了細(xì)菌能否維持及傳播其獲得的耐藥性。

在生物進(jìn)化過(guò)程中，一種性狀上有益變化的積累常與其他性狀的有害變化相關(guān)聯(lián)。在細(xì)菌對(duì)抗生素耐藥性進(jìn)化過(guò)程中，研究者也常能觀察到由突變基因介導(dǎo)的一系列影響細(xì)胞滲透性、酸性、營(yíng)養(yǎng)、膜和氧化應(yīng)激等的防御反應(yīng)。這些反應(yīng)常導(dǎo)致許多細(xì)菌在無(wú)藥情況下提高其適應(yīng)性代價(jià)，或擾亂基因組表達(dá)，從而產(chǎn)生附屬敏感性。細(xì)菌附屬敏感性機(jī)制可能涉及：1)細(xì)胞膜通透性的改變，如大腸桿菌減少對(duì)氨基糖苷類藥物吸收以產(chǎn)生耐藥性的同時(shí)也會(huì)相應(yīng)減少對(duì)其他藥物的排出而產(chǎn)生附屬敏感現(xiàn)象。2)耐藥性進(jìn)化提高胞內(nèi)特殊活性蛋白(如酶)的表達(dá)，激活另一種前體藥物提高有效藥物量而產(chǎn)生附屬敏感現(xiàn)象，如耐甲亞胺青霉素的大腸桿菌對(duì)呋喃妥因敏感性增強(qiáng)。3)細(xì)胞耐藥性進(jìn)化致代謝通路改變，其他抗生素對(duì)細(xì)胞的毒性效應(yīng)增強(qiáng)而產(chǎn)生附屬敏感現(xiàn)象，如耐替加環(huán)素大腸桿菌的突變體對(duì)呋喃妥因敏感性大幅度增加。4)耐藥性進(jìn)化令其他藥物對(duì)作用靶點(diǎn)的親和力增加而產(chǎn)生附屬敏感現(xiàn)象，如耐甲氧西林金黃色葡萄球菌PBP2a蛋白上E246G突變使其在克拉維酸存在的情況下對(duì)青霉素的敏感性提高。另外，不同菌株對(duì)某些藥物的附屬敏感性可能涉及一個(gè)或多個(gè)不同的作用機(jī)制。

綜上所述，細(xì)菌的附屬敏感性以及適應(yīng)性代價(jià)是耐藥性進(jìn)化過(guò)程中的一種取舍(trade-off)，即“進(jìn)化代價(jià)”。

1.3 細(xì)菌進(jìn)化的適應(yīng)性代價(jià)與附屬敏感性之間的關(guān)系

基于細(xì)菌附屬敏感性設(shè)計(jì)藥物治療方案時(shí)，細(xì)菌的適應(yīng)性代價(jià)能在一定程度上提高療效，抑制細(xì)菌耐藥性的發(fā)展；近期，也有研究人員利用數(shù)學(xué)模型，通過(guò)耐藥細(xì)菌的適應(yīng)性的變化來(lái)預(yù)測(cè)其附屬敏感效應(yīng)，但適應(yīng)性代價(jià)與附屬敏感性之間并無(wú)必然聯(lián)系。換而言之，細(xì)菌耐藥性進(jìn)化過(guò)程中所產(chǎn)生的適應(yīng)性代價(jià)不一定會(huì)引起細(xì)菌的附屬敏感性，且細(xì)菌附屬敏感性的產(chǎn)生不一定伴隨著適應(yīng)性代價(jià)。主要原因是部分細(xì)菌可通過(guò)代償突變來(lái)改善耐藥性進(jìn)化所產(chǎn)生的適應(yīng)性代價(jià)。此外，一些利于提高耐藥菌適應(yīng)性的突變?cè)谙鄳?yīng)野生株中反而是有害的，另外，一項(xiàng)對(duì)假單胞菌的研究顯示，50%的常見(jiàn)突變所引起的適應(yīng)性變化取決于其所在菌株的遺傳背景。不僅如此，特定的耐藥突變?cè)诓煌虮尘跋拢鶗?huì)因遺傳上位效應(yīng)而導(dǎo)致細(xì)菌不同的適應(yīng)性變化結(jié)果。

2 附屬敏感性發(fā)生的影響因素

2.1 細(xì)菌附屬敏感性機(jī)制存在不穩(wěn)定性

Barbosa等在試驗(yàn)中觀察到，不同耐頭孢磺啶銅綠假單胞桿菌PA14的平行樣本對(duì)其他抗生素(如慶大霉素和鏈霉素)的敏感性呈現(xiàn)相反的變化。這是因?yàn)榧?xì)菌發(fā)生耐藥性進(jìn)化的機(jī)制具有多樣性，且細(xì)菌耐藥性進(jìn)化軌跡具有一定隨機(jī)性，而細(xì)菌附屬敏感性取決于細(xì)菌耐藥性進(jìn)化所選擇的軌跡，因此細(xì)菌與藥物間的附屬敏感反應(yīng)具有不確定性。這意味著同一株細(xì)菌，即使每次都用相同的處理?xiàng)l件，也可能會(huì)產(chǎn)生不一致的附屬敏感性和交叉敏感性。Wright的經(jīng)典適應(yīng)度景觀圖模型很好地解釋了何為進(jìn)化路線的多樣性。

假設(shè)將細(xì)菌的基因型當(dāng)成一個(gè)二維平面(圖1)，適應(yīng)性表示為基因型平面上的高度。細(xì)菌的耐藥性進(jìn)化常有多個(gè)適應(yīng)峰，我們可把細(xì)菌的耐藥性進(jìn)化看作是其隨機(jī)朝著不同方向“上坡”的過(guò)程，而在不同的適應(yīng)峰之間會(huì)有一個(gè)進(jìn)化分支點(diǎn)(evolutionary branching point)，當(dāng)細(xì)菌在進(jìn)化過(guò)程中的基因型在此進(jìn)化分支點(diǎn)時(shí)，它未來(lái)的進(jìn)化路線就有了多種可能。因此，對(duì)于僅由突變產(chǎn)生耐藥性的細(xì)菌來(lái)說(shuō)，其最終耐藥性進(jìn)化結(jié)果的顯著差異與突變的隨機(jī)性相關(guān)。也正由于基因突變的隨機(jī)性，細(xì)菌在耐藥性進(jìn)化過(guò)程中衍生附屬敏感性的概率并不穩(wěn)定。同時(shí)，細(xì)菌產(chǎn)生附屬敏感的可重復(fù)性還會(huì)受到藥物直接作用的影響，某些種類的藥物確實(shí)能誘導(dǎo)出較為穩(wěn)定和固定的細(xì)菌附屬敏感性。

圖1 適應(yīng)度景觀圖[14]Fig.1 Fitness landscape[14]

此外，Imamovic等在一項(xiàng)縱向研究中發(fā)現(xiàn)，不同時(shí)間點(diǎn)從同一患者體內(nèi)分離出來(lái)的同種菌株，其耐藥特性也有較大差異。其中，最主要的原因是隨著時(shí)間的推移，細(xì)菌在抗生素壓力下產(chǎn)生并積累了多種突變。這些突變的逐步獲得與積累，以及基因的上位效應(yīng)等所帶來(lái)的影響，造成細(xì)菌耐藥性進(jìn)化中交叉耐藥性和附屬敏感性的動(dòng)態(tài)變化，增加了細(xì)菌附屬敏感性的不穩(wěn)定性。

綜上所述，細(xì)菌附屬敏感性的不穩(wěn)定性體現(xiàn)在其進(jìn)化方向的不確定性，以及在時(shí)間維度上積累的不同突變而導(dǎo)致的動(dòng)態(tài)變化。

2.2 細(xì)菌的遺傳背景影響其附屬敏感性發(fā)生

研究者們常在細(xì)菌附屬敏感性的研究中觀察到，同一基因位點(diǎn)的突變可在不同種群造成一定的耐藥性差異，即使兩個(gè)種群對(duì)同種藥物的耐藥性進(jìn)化方向相同，其耐藥性變化程度及附屬敏感性也常呈現(xiàn)一定的差異。這些差異由兩個(gè)細(xì)菌種群中目標(biāo)突變位點(diǎn)所在的基因內(nèi)部以及基因與基因間的遺傳背景差異所影響。通常，遺傳背景差異越大，細(xì)菌種群間的附屬敏感性、交叉耐藥性、適應(yīng)性代價(jià)及耐藥程度等的差異越明顯。

例如，大腸桿菌與沙門(mén)菌兩者基因的相似度約為97.5%?；蛑饕幋a鉀離子轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白，而大腸桿菌攝取氨基糖苷類藥物需通過(guò)呼吸作用和質(zhì)子驅(qū)動(dòng)力(proton motive force，PMF)的介導(dǎo)，350突變基因可減少質(zhì)子驅(qū)動(dòng)力，導(dǎo)致大腸桿菌中依賴PMF介導(dǎo)的主要外排系統(tǒng)AcrAB-To1C的活性下降，從而導(dǎo)致細(xì)菌攝取氨基糖苷類藥物減少，產(chǎn)生相應(yīng)耐藥性，與此同時(shí)也會(huì)因此減弱對(duì)其他藥物的外排作用，對(duì)其他類藥物產(chǎn)生附屬敏感性。將大腸桿菌和沙門(mén)菌的基因做相同突變后，大腸桿菌與沙門(mén)菌對(duì)氨芐西林和紅霉素的耐藥性變化方向并不一致。并且，導(dǎo)入350突變基因片段后的大腸桿菌與沙門(mén)菌對(duì)不同種類藥物所表現(xiàn)的附屬敏感性也并不完全一致：導(dǎo)入突變基因片段的大腸桿菌對(duì)9種藥物(氨芐青霉素、頭孢西丁、強(qiáng)力霉素、四環(huán)素、氯霉素、紅霉素、萘啶酮酸、呋喃妥英、環(huán)丙沙星)產(chǎn)生附屬敏感性，然而導(dǎo)入突變基因的沙門(mén)菌僅對(duì)4種藥物產(chǎn)生附屬敏感性(頭孢西丁、強(qiáng)力霉素、四環(huán)素、萘啶酮酸)。這種不同由兩種細(xì)菌的基因內(nèi)上位效應(yīng)(intragenic epistasis)以及細(xì)菌基因間上位效應(yīng)所引起，后者為主要的影響。這些上位效應(yīng)的相互作用妨礙了人們預(yù)測(cè)附屬敏感性出現(xiàn)的準(zhǔn)確率。

2.3 環(huán)境因素影響細(xì)菌附屬敏感性

大量現(xiàn)有研究報(bào)道了影響細(xì)菌附屬敏感性的重要遺傳因素，除此以外，許多研究表明，環(huán)境因素也對(duì)細(xì)菌附屬敏感性有重大影響。這些環(huán)境因素體現(xiàn)在細(xì)菌所生存環(huán)境中的抗生素壓力強(qiáng)度、抗生素環(huán)境變化速率、不同的適應(yīng)性進(jìn)化方法、宿主內(nèi)環(huán)境等方面。了解影響細(xì)菌附屬敏感性的環(huán)境因素可令人們對(duì)其保守性有更深入的理解，從而在臨床上更好地預(yù)測(cè)以及應(yīng)用細(xì)菌附屬敏感性。

2.3.1 抗生素壓力強(qiáng)度影響細(xì)菌附屬敏感性 Oz等通過(guò)高/低強(qiáng)度抗生素持續(xù)誘導(dǎo)大腸桿菌的耐藥性進(jìn)化試驗(yàn)證明(圖2)，抗生素的選擇強(qiáng)度是導(dǎo)致抗生素耐藥性問(wèn)題復(fù)雜化的一個(gè)隱藏的重要參數(shù)，高強(qiáng)度的抗生素壓力更利于細(xì)菌的直接耐藥性、交叉耐藥性以及附屬敏感性的進(jìn)化。在溫和的抗生素壓力下，部分細(xì)菌亞群仍能繼續(xù)生長(zhǎng)，此時(shí)，細(xì)菌基因突變的目的往往是增強(qiáng)其在這一條件下的生長(zhǎng)適應(yīng)性，如通過(guò)對(duì)多藥耐藥基因或者轉(zhuǎn)錄子的改變來(lái)適應(yīng)環(huán)境的變化。而在高強(qiáng)度抗生素壓力下，細(xì)菌的首要任務(wù)為生存，因此它們不惜采取具高適應(yīng)性成本的基因突變，如以重要細(xì)胞器(核糖體)或者必須酶(RNA聚合酶)為目標(biāo)的基因突變來(lái)提高生存概率。不僅如此，細(xì)菌在較高強(qiáng)度抗生素壓力下會(huì)比其在溫和的抗生素壓力下積累更多類型的基因突變。這些突變常影響不同細(xì)胞通路(相應(yīng)藥物作用抑制的或者非相應(yīng)藥物作用抑制的特殊通路)或提高耐藥性進(jìn)化過(guò)程的適應(yīng)性，導(dǎo)致細(xì)菌出現(xiàn)更多交叉耐藥或附屬敏感反應(yīng)。

細(xì)菌在不同的藥物濃度，且藥物濃度梯度的跨度大于預(yù)期MIC的試管中生長(zhǎng)。于高強(qiáng)度抗生素梯度以及溫和強(qiáng)度的抗生素梯度壓力下誘導(dǎo)培養(yǎng)細(xì)菌群體22 h，將能在最高藥物濃度下存活的細(xì)菌群體轉(zhuǎn)移到新的具有更高藥物濃度的試管中培養(yǎng)，持續(xù)22 dBacterial populations were grown in several tubes with increased drug concentrations that span the expected MIC of the population. Populations were grown for approximately 22 h and the populations surviving in the highest drug concentration were transferred to new culture vials with higher drug concentration, lasting for 22 days圖2 強(qiáng)、弱選擇條件下液體培養(yǎng)細(xì)菌進(jìn)化試驗(yàn)示意圖[46]Fig.2 Schematic illustration of bacterial evolution experiments in liquid culture under strong and mild selection[46]

2.3.2 抗生素環(huán)境變化速率影響細(xì)菌附屬敏感性 除了抗生素強(qiáng)度，環(huán)境變化速率(rate of environmental change)也會(huì)影響細(xì)菌的耐藥性進(jìn)化。以抗生素濃度變化速率為例，Lindsey等通過(guò)使用3種不同濃度增量速率(快速、適中、平緩)的利福平來(lái)誘導(dǎo)大腸桿菌的耐藥性進(jìn)化(后續(xù)將簡(jiǎn)稱為抗生素增量法)，并檢測(cè)大腸桿菌對(duì)利福平耐藥的相關(guān)基因(編碼RNA聚合酶β亞基的基因)序列。試驗(yàn)結(jié)果顯示，誘導(dǎo)過(guò)程中大腸桿菌產(chǎn)生的所有類型的基因突變都是非同義的，平緩、適中的抗生素增量法誘導(dǎo)的細(xì)菌的核苷酸多樣性顯著高于快速抗生素增量法誘導(dǎo)的細(xì)菌，這可能是由于平緩和適中的藥物濃度增量速率給細(xì)菌種群提供更多發(fā)生和傳播耐藥性突變的機(jī)會(huì)。除此以外，研究人員還發(fā)現(xiàn)由于受到基因符號(hào)上位效應(yīng)(sign genetic epistasis)和環(huán)境上位效應(yīng)(environmental epistasis)，以及后一耐藥突變的發(fā)生與否常取決于前一個(gè)關(guān)鍵的耐藥突變是否發(fā)生等因素的影響，在快速抗生素增量法下誘導(dǎo)的細(xì)菌無(wú)法獲得在平緩和適中藥物濃度增量速率下所取得的耐藥性進(jìn)化路線，以至細(xì)菌最終無(wú)法獲得可適應(yīng)最高藥物濃度的突變基因型，這表明循序漸進(jìn)的低水平耐藥突變更利于細(xì)菌的耐藥性發(fā)展。除抗生素濃度的增量速率以外，溫度以及CO等環(huán)境因素的變化速率不同，也可能會(huì)影響生物基因型的進(jìn)化路線，導(dǎo)致細(xì)菌附屬敏感性差異。

2.3.3 不同適應(yīng)性進(jìn)化方法影響細(xì)菌附屬敏感性 Jahn等用不同的抗生素適應(yīng)性進(jìn)化方法(adaptive laboratory evolution，ALE)，如梯度法和每日25%、50%、100%濃度增量法(后續(xù)將簡(jiǎn)稱為增量法)，來(lái)誘導(dǎo)大腸桿菌的耐藥性(圖3)。結(jié)果表明，除了每日100%增量法，其他方法誘導(dǎo)后細(xì)菌耐藥性均超過(guò)臨床折點(diǎn)。在不同適應(yīng)性進(jìn)化方法誘導(dǎo)下，處于臨床折點(diǎn)附近的大腸桿菌對(duì)其他藥物的交叉耐藥性及附屬敏感性大部分相似。對(duì)比梯度法和25%增量法，梯度進(jìn)化譜系生長(zhǎng)速度較慢，25%增量法誘導(dǎo)的細(xì)菌增長(zhǎng)速度最快；在25%增量法以及梯度法誘導(dǎo)后細(xì)菌基因型很相似，但是相對(duì)而言，25%增量法所誘導(dǎo)的細(xì)菌基因型更豐富且?guī)缀鯏y帶了所有梯度法誘導(dǎo)的細(xì)菌所發(fā)生的突變，因此，推測(cè)在梯度法誘導(dǎo)后細(xì)菌所發(fā)生的突變可能是最重要的抗性表型。此項(xiàng)研究所展現(xiàn)的“較低濃度抗生素壓力下細(xì)菌基因型更豐富”的結(jié)論與Oz等所提出的“細(xì)菌在高濃度抗生素壓力下會(huì)比其在低濃度抗生素壓力下積累更多類型的基因突變”的結(jié)論不一致，原因尚不明確。可以確定的是細(xì)菌一旦有存活的機(jī)會(huì)，往往會(huì)朝著更利于生存的方向進(jìn)化。因此適當(dāng)?shù)沫h(huán)境刺激及適應(yīng)性代價(jià)反而常促進(jìn)細(xì)菌的進(jìn)化，讓其得以不斷自我完善。而附屬敏感效應(yīng)正是細(xì)菌不斷進(jìn)化以適應(yīng)抗生素壓力過(guò)程中的所產(chǎn)生的缺陷，人們利用此缺陷來(lái)延緩其耐藥性進(jìn)化速度以達(dá)到“減抗增效”的目的。

使用4種不同的適應(yīng)性實(shí)驗(yàn)室進(jìn)化法誘導(dǎo)大腸桿菌對(duì)不同藥物的耐藥性。這4種不同的方法分別為梯度法、100%濃度增量法、50%濃度增量法和25%濃度增量法。梯度法是將細(xì)菌接種到10個(gè)等藥物濃度梯度，且每個(gè)梯度為2倍的96孔板中，第2天將生長(zhǎng)在最高濃度的細(xì)胞接種到新的梯度中，持續(xù)14 d。在增量方法中，每轉(zhuǎn)移一次，藥物濃度提高100%、50%或25%。所有方法體系均在試驗(yàn)的第4天達(dá)到野生型菌株的最低抑菌濃度(MIC)Adaptation of E. coli K12 to three antibiotics following four adaptation protocols with different selection strengths. The four selection systems are named “gradient” “100% increment” “50% increment” and “25% increment”. In the gradient approach, cells were inoculated into a 2-fold, 10-step drug gradient and cells growing in the highest concentration were used for inoculation of a fresh gradient. In the increment approaches the drug concentration was raised with every transfer either by 100%, 50%, or 25%. The wild type minimal inhibitory concentration (MIC) was reached on the fourth day of the experiment for all increment lineages圖3 不同抗生素適應(yīng)性實(shí)驗(yàn)室進(jìn)化方法[57]Fig.3 Different adaptive laboratory evolution experimental design of the study[57]

此項(xiàng)研究表明，不同的環(huán)境因素對(duì)細(xì)菌的耐藥性進(jìn)化有決定性影響。其中，抗生素的增量速率常決定細(xì)菌的最大耐藥水平，間接影響細(xì)菌的附屬敏感性。而一旦細(xì)菌種群達(dá)到指定的耐藥水平，無(wú)論其所采用的實(shí)驗(yàn)室進(jìn)化方式如何，細(xì)菌種群間的基因型與表型都有一定的相似性。這是由于進(jìn)化的本質(zhì)是自然選擇，雖然細(xì)菌耐藥性進(jìn)化具有一定的隨機(jī)性從而豐富了其耐藥性進(jìn)化路線的多樣性，但是細(xì)菌在適應(yīng)一定選擇壓力的過(guò)程中可獲得的變化數(shù)量有限且進(jìn)化傾向于此類突變，細(xì)菌的進(jìn)化具有一定的方向性，因此暴露在類似環(huán)境中的細(xì)菌所發(fā)生的變化具有一定的相似性。而在25%濃度增量法以及梯度法誘導(dǎo)下，細(xì)菌種群間基因型的差異提示，不同的適應(yīng)性進(jìn)化方法也可能會(huì)造成其基因型有細(xì)微的不同，至于這些細(xì)微的不同是否會(huì)進(jìn)一步地影響細(xì)菌后續(xù)的進(jìn)化軌跡及附屬敏感效應(yīng)，仍需通過(guò)更深入的高通量試驗(yàn)研究解答。

2.3.4 細(xì)菌寄生環(huán)境的理化性質(zhì)影響附屬敏感性 除了上述常見(jiàn)于體外試驗(yàn)的環(huán)境因素，細(xì)菌寄生環(huán)境的理化性質(zhì)對(duì)細(xì)菌的附屬敏感性也有重大影響。例如：膽汁可上調(diào)細(xì)菌外排泵；鋅可降低氨基糖苷類降解酶的活性；高溫可改變無(wú)藥條件下耐利福平細(xì)菌突變?nèi)后w的生長(zhǎng)狀況；細(xì)菌可因不同的pH、溫度、膽鹽濃度等環(huán)境條件而更傾向于某種耐藥性進(jìn)化。這意味著，宿主的某些生理?xiàng)l件也可能會(huì)影響細(xì)菌在有藥以及無(wú)藥環(huán)境下的進(jìn)化路線，從而影響其附屬敏感性。例如，耐慶大霉素大腸桿菌的基因突變?nèi)后w在培養(yǎng)條件為37 ℃時(shí)對(duì)頭孢呋辛表現(xiàn)出交叉耐藥性，然而卻在培養(yǎng)條件為42 ℃時(shí)表現(xiàn)出對(duì)頭孢呋辛的附屬敏感性；42 ℃，甲氧芐氨嘧啶存在條件下，大腸桿菌更傾向于進(jìn)化成具有突變的耐藥群體，此群體在42 ℃培養(yǎng)條件下對(duì)呋喃妥因表現(xiàn)出交叉耐藥性，但卻在37 ℃培養(yǎng)條件下表現(xiàn)出相應(yīng)的附屬敏感性。這提示細(xì)菌可因其所寄生環(huán)境的理化性質(zhì)不同而表現(xiàn)出不同的附屬敏感性。因此，應(yīng)用附屬敏感性設(shè)計(jì)臨床治療方案時(shí)，也需要充分考慮細(xì)菌寄生環(huán)境的理化性質(zhì)對(duì)其附屬敏感性的影響。

3 細(xì)菌附屬敏感性的潛在應(yīng)用前景

3.1 高度保守的附屬敏感效應(yīng)及其預(yù)測(cè)準(zhǔn)確性是附屬敏感性應(yīng)用的前提

慢性感染的特性決定其需要特定的治療方案，因此附屬敏感性在臨床慢性感染的治療上具有較大的發(fā)展前景。然而，多項(xiàng)研究表明，細(xì)菌耐藥性進(jìn)化過(guò)程中附屬敏感以及交叉耐藥效應(yīng)普遍是交替出現(xiàn)的，這意味著若要將附屬敏感性應(yīng)用到臨床治療，需保證治療過(guò)程中細(xì)菌總是或者大概率對(duì)某些藥物對(duì)進(jìn)化出穩(wěn)定且固定的附屬敏感性，即高度保守的附屬敏感效應(yīng)(conserved collateral sensitivity effects)。近期有多項(xiàng)研究報(bào)道了細(xì)菌與藥物間高度保守的附屬敏感反應(yīng)，為細(xì)菌附屬敏感性的應(yīng)用前景帶來(lái)曙光。例如，大腸桿菌對(duì)環(huán)丙沙星耐藥的同時(shí)，對(duì)慶大霉素、磷霉素有較高保守程度的附屬敏感性，而影響細(xì)菌外排泵系統(tǒng)的突變是引起其附屬敏感性發(fā)生的重要因素。無(wú)獨(dú)有偶，Imamovic等也在不同囊性纖維病患者體內(nèi)分離出具有不同遺傳背景的銅綠假單胞桿菌，并發(fā)現(xiàn)這些臨床樣本對(duì)環(huán)丙沙星耐藥的同時(shí)，對(duì)慶大霉素、黏菌素具有較高保守程度的附屬敏感性，這種附屬敏感的產(chǎn)生與基因突變有關(guān)。基因?qū)?dǎo)致MexC轉(zhuǎn)運(yùn)體的過(guò)度表達(dá)，影響細(xì)菌的多重耐藥外排系統(tǒng)，從而引起試驗(yàn)株的附屬敏感效應(yīng)。因此，基因突變或MexC蛋白的豐度可能是一種潛在的、可預(yù)測(cè)附屬敏感效應(yīng)的標(biāo)志物。這些研究結(jié)果啟示，在不同遺傳背景的細(xì)菌種群中，附屬敏感效應(yīng)機(jī)制的相似性及可預(yù)測(cè)性是將細(xì)菌的附屬敏感效應(yīng)運(yùn)用于臨床的前提，而這種相似性與可預(yù)測(cè)性取決于由細(xì)菌種群的耐藥機(jī)制所造成細(xì)菌生理變化的相似程度。或許，未來(lái)可通過(guò)檢測(cè)細(xì)菌附屬敏感效應(yīng)的基因組或蛋白質(zhì)組生物標(biāo)志物來(lái)預(yù)測(cè)耐藥細(xì)菌的附屬反應(yīng)，從而更科學(xué)地設(shè)計(jì)藥物治療方案，提高慢性感染治療的成功率。

上文提到，細(xì)菌遺傳背景的差異以及細(xì)菌耐藥突變路線的多樣性，是預(yù)測(cè)細(xì)菌種群形成高度保守的附屬敏感效應(yīng)的最大的障礙。針對(duì)此問(wèn)題，Ardell和Kryazhimskiy用聯(lián)合適應(yīng)度效應(yīng)分布(joint distribution of fitness effects，JDFE)來(lái)量化細(xì)菌耐藥突變的多效性所帶來(lái)的多種影響。JDFE是指細(xì)菌在產(chǎn)生一個(gè)新突變后，將在初始使用的抗生素(用以誘導(dǎo)產(chǎn)生耐藥性的抗生素)環(huán)境與之后使用的另一抗生素環(huán)境中表現(xiàn)出不同的適應(yīng)性變化，將這兩種變化的可能性組合起來(lái)，并計(jì)算其發(fā)生概率，這種概率稱為JDFE。利用JDFE和數(shù)學(xué)模型模擬短時(shí)間內(nèi)細(xì)菌附屬敏感效應(yīng)的動(dòng)態(tài)變化，并優(yōu)化了先前用以預(yù)測(cè)附屬敏感反應(yīng)發(fā)生率及估算預(yù)測(cè)準(zhǔn)確性的計(jì)算模型。優(yōu)化后的計(jì)算模型減少了細(xì)菌遺傳背景差異及耐藥突變路線的多樣性，但強(qiáng)調(diào)了細(xì)菌耐藥突變種類對(duì)預(yù)測(cè)結(jié)果的影響。但由于缺乏高通量試驗(yàn)數(shù)據(jù)的支持以及體內(nèi)試驗(yàn)的驗(yàn)證；計(jì)算模型僅局限于細(xì)菌多染色體的突變；且在設(shè)計(jì)模型時(shí)簡(jiǎn)化了許多參數(shù)對(duì)細(xì)菌耐藥性進(jìn)化路線的影響，該計(jì)算模型尚且不夠完善，后續(xù)仍需對(duì)此類數(shù)學(xué)模型做更深入的研究。

3.2 基于細(xì)菌附屬敏感性制定科學(xué)的用藥策略

基于細(xì)菌附屬敏感性所設(shè)計(jì)的給藥方案可在不降低療效的前提下減少抗生素用量，從而降低抗生素相關(guān)的毒性風(fēng)險(xiǎn)，擴(kuò)大抗生素的應(yīng)用范圍，并限制抗生素耐藥性發(fā)展。附屬敏感效應(yīng)為提高藥物療效和延長(zhǎng)現(xiàn)有藥物使用壽命的問(wèn)題提供了新思路，但是細(xì)菌的耐藥性進(jìn)化是復(fù)雜的，即使細(xì)菌對(duì)某些藥物存在附屬敏感性，不當(dāng)?shù)挠盟幏桨敢部赡軙?huì)加速細(xì)菌耐藥性的進(jìn)化。因此，更需充分考慮以下問(wèn)題：如何基于特定細(xì)菌的附屬敏感效應(yīng)制定科學(xué)而有效的藥物治療方案，在設(shè)計(jì)此方案的過(guò)程中需要重視哪些關(guān)鍵因素？

上文已強(qiáng)調(diào)各種環(huán)境因素對(duì)細(xì)菌附屬敏感性有重大影響，需在制定用藥方案時(shí)給予充分考慮。此外，另一項(xiàng)研究通過(guò)數(shù)學(xué)模型顯示：在細(xì)菌和藥物間存在附屬敏感效應(yīng)的情況下，同時(shí)用藥和間隔1 d的輪換用藥治療法可顯著抑制細(xì)菌的耐藥性進(jìn)化。對(duì)于間隔1 d的輪換用藥療法，開(kāi)始使用時(shí)間依賴型的抗生素比最初使用濃度依賴型的抗生素更有效地抑制細(xì)菌耐藥性進(jìn)化；當(dāng)細(xì)菌對(duì)藥物的附屬敏感性是單向的或細(xì)菌對(duì)所計(jì)劃使用藥物存有耐藥性的情況下，需慎重考慮用藥的先后次序。這提示，基于細(xì)菌附屬敏感性設(shè)計(jì)藥物治療方案的效果，與用藥間隔時(shí)間、藥物類型、藥物濃度、用藥順序、細(xì)菌現(xiàn)有耐藥情況等多種因素密切相關(guān)。因此若要形成成熟的基于細(xì)菌附屬敏感性設(shè)計(jì)用藥方案，我們?nèi)孕枭钊胨伎既绮≡退幬锏奶禺愋?、藥物間附屬敏感效應(yīng)的方向性、輪換用藥的最佳切換時(shí)間、藥物代謝動(dòng)力學(xué)、藥物效應(yīng)動(dòng)力學(xué)、藥物間不同的相互作用等更多方面的因素對(duì)用藥方案的影響。

4 小 結(jié)

近年來(lái)，借用細(xì)菌的附屬敏感性來(lái)延長(zhǎng)、優(yōu)化現(xiàn)有藥物的療效是治療耐藥細(xì)菌的新思路之一，但目前對(duì)于細(xì)菌附屬敏感性的研究尚處于初始階段，由于進(jìn)化軌跡的隨機(jī)性所造成細(xì)菌附屬敏感效應(yīng)的異質(zhì)性、較低重復(fù)性，以及細(xì)菌的表觀遺傳效應(yīng)、基因缺失、基因水平轉(zhuǎn)移等因素均增加了實(shí)際情況下細(xì)菌耐藥性進(jìn)化的復(fù)雜性及預(yù)測(cè)難度。為了打破體外試驗(yàn)的多種限制因素，更接近自然演化的耐藥性進(jìn)化情況，應(yīng)著重收集臨床治療前后的菌株并對(duì)其進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，分析其交叉耐藥性和附屬敏感性，并將分析結(jié)果與高通量實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)和數(shù)學(xué)模型相結(jié)合，以更好地評(píng)估細(xì)菌附屬敏感性出現(xiàn)的保守程度，解釋進(jìn)化的內(nèi)在隨機(jī)性以及保證細(xì)菌附屬敏感效應(yīng)的高度保守性，從而更準(zhǔn)確地解析且更好地應(yīng)用細(xì)菌附屬敏感效應(yīng)。后續(xù)仍需要結(jié)合更多的前瞻性研究，提高對(duì)細(xì)菌耐藥性進(jìn)化以及附屬敏感性的認(rèn)識(shí)，以更加準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)及利用附屬敏感效應(yīng)突破由細(xì)菌耐藥性進(jìn)化引起的難點(diǎn)問(wèn)題。