羅 俊，劉金玲，鄭鹿平，羅 琴，滕 蔓*

(1.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部動(dòng)物免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 河南省動(dòng)物免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 鄭州 450002； 2.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院中英禽病國(guó)際研究中心，鄭州 450002； 3.河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院動(dòng)物醫(yī)藥學(xué)院，鄭州 450046)

1 CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)

成簇的規(guī)律性間隔短回文重復(fù)序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR)，是在細(xì)菌和古生菌中發(fā)現(xiàn)的一類重要外援基因，與CRISPR相關(guān)的(CRISPR associated，Cas)蛋白家族共同構(gòu)成細(xì)菌自身適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的重要部分，用以抵御外來(lái)質(zhì)?；蚴删w的入侵。CRISPR/Cas9系統(tǒng)屬于II型CRISPR/Cas系統(tǒng)，該系統(tǒng)只需一個(gè)與靶基因互補(bǔ)配對(duì)的單一向?qū)NA(single-guide RNA，sgRNA)的引導(dǎo)，Cas9蛋白即可特異性識(shí)別靶基因的前間隔序列鄰近基序(protospacer adjacent motif，PAM)5′-NGG-3′(N指代任一堿基)，從而激發(fā)其雙鏈DNA切割活性，產(chǎn)生一個(gè)雙鏈缺口(double-strand break，DSB)，同時(shí)基因組DNA在復(fù)制時(shí)即可利用自我修復(fù)功能直接修復(fù)DSB，最終實(shí)現(xiàn)對(duì)靶基因的精準(zhǔn)切割。2013年，Cong等首次將CRISPR/Cas9系統(tǒng)應(yīng)用于真核細(xì)胞的基因編輯并取得巨大成功，從而大大推動(dòng)了該技術(shù)在生命科學(xué)研究領(lǐng)域的應(yīng)用，此后短短數(shù)年間，CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)就廣泛應(yīng)用于包括人類細(xì)胞、細(xì)菌、斑馬魚、酵母、小鼠、果蠅和寄生蟲等多物種基因組的編輯。最近，將CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)應(yīng)用于病毒基因組的改造，尤其是一些致癌性病毒和皰疹病毒，已成為病毒學(xué)領(lǐng)域新的國(guó)際研究熱點(diǎn)，如人類乙肝病毒(hepatitis B virus，HBV)、高危人乳頭瘤病毒(high-risk human papillomavirus，HR-HPV)、單純皰疹病毒I型(herpes simplex virus 1，HSV-1)、愛潑斯坦-巴爾病毒(Epstein-Barr virus，EBV)、人類巨細(xì)胞病毒(human cytomegalovirus，HCMV)、卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒(Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus，KSHV)以及一些引起動(dòng)物疫病的皰疹病毒，如雞馬立克病病毒(Marek’s disease virus，MDV)、鴨腸炎病毒(duck enteritis virus，DEV)、豬偽狂犬病病毒(Pseudorabies virus，PRV)等。

2 致瘤性家禽皰疹病毒的基因編輯

2.1 傳統(tǒng)基因重組技術(shù)介導(dǎo)的基因編輯

在CRISPR/Cas9系統(tǒng)廣泛應(yīng)用于大基因組DNA病毒的基因編輯之前，科學(xué)家們主要利用傳統(tǒng)的基因同源重組技術(shù)(homologous recombination system，HRS)、黏粒(Cosmid)或F黏粒(Fosmid)基因組文庫(kù)技術(shù)以及細(xì)菌人工染色體(bacterial artificial chromosome，BAC)同源重組技術(shù)來(lái)實(shí)現(xiàn)皰疹病毒的基因組改造。MDV在病毒學(xué)分類上屬于甲亞科皰疹病毒，是少數(shù)幾種可在其自然感染宿主中誘導(dǎo)腫瘤發(fā)生并導(dǎo)致免疫抑制的一種致瘤性皰疹病毒。MDV早期感染雛雞導(dǎo)致馬立克病(Marek’s disease，MD)，是目前生物界已知毒性最強(qiáng)的一種致瘤性病毒。根據(jù)抗原性的不同，MDV可以分為3種不同的血清型：MDV-1、MDV-2和MDV-3，其中只有MDV-1流行毒株具有致病性和致瘤性，MDV-2和MDV-3的毒株對(duì)雞均無(wú)致病性，后者又被稱為火雞皰疹病毒(herpesvirus of turkey，HVT)。早在2002年，科學(xué)家們首先利用Cosmid基因組文庫(kù)技術(shù)構(gòu)建了MDV-1超強(qiáng)毒株Md5的感染性克隆，并進(jìn)一步分別構(gòu)建了38基因缺失株Md5Δpp38和基因缺失株Md5Δmeq，評(píng)估了該技術(shù)用于MDV病毒基因功能研究的可行性，并提出基因參與淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化但與病毒的復(fù)制無(wú)關(guān)。由于用重組黏粒構(gòu)建 MDV 感染性克隆重復(fù)性較差，且有可能形成不同的感染性病毒粒子，影響后續(xù)試驗(yàn)的穩(wěn)定性。因此，黏粒系統(tǒng)很快被BAC克隆和基因同源重組技術(shù)所取代。Schumacher等首次成功構(gòu)建了MDV-1 584Ap80C株的感染性BAC克隆。此后，利用BAC和Rec E/T、En passant等一步或兩步法同源重組技術(shù)，3種不同血清型的MDV疫苗株CVI988/Rispens、HVT、814、SB-1以及不同毒力MDV-1毒株的感染性BAC克隆陸續(xù)構(gòu)建成功。利用這些感染性BAC克隆，科學(xué)家們完成了7 個(gè)MDV毒株的全基因組序列分析，為后續(xù)MDV病原學(xué)、流行病學(xué)、遺傳進(jìn)化及致病機(jī)制研究奠定了重要基礎(chǔ)。

雖然HVT對(duì)宿主不具有致病性，但由于它與具有致病性的MDV-1毒株具有極強(qiáng)的抗原相關(guān)性，早在上世紀(jì)70年代就作為第一代商品疫苗應(yīng)用于MD的免疫預(yù)防并取得了良好的防控效果，對(duì)MD的防控貢獻(xiàn)巨大。這是人類歷史上第一個(gè)可以成功預(yù)防腫瘤發(fā)生的病毒性疫苗，至今仍在全球廣泛使用。同時(shí)，基于傳統(tǒng)的HRS或BAC重組技術(shù)，HVT也被廣泛用于研發(fā)攜帶異源病毒抗原蛋白的基因工程載體疫苗，在其基因組中插入外源病毒基因，如雞新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)、禽流感病毒(avian influenza virus，AIV)、雞傳染性法氏囊病病毒(infectious bursal disease virus，IBDV)、雞傳染性喉氣管炎病毒(infectious laryngotracheitis virus，ILTV)、禽白血病病毒(avian leucosis virus，ALV)和艾美耳球蟲(Eimeria)等的主要抗原蛋白基因。實(shí)驗(yàn)室研究數(shù)據(jù)顯示，這些HVT重組疫苗對(duì)MDV-1和相關(guān)病毒引起的家禽疫病具有良好和持久的免疫保護(hù)。但是，由于MDV基因組比較龐大，在構(gòu)建這些病毒基因組感染性BAC克隆的過程中，比較費(fèi)時(shí)費(fèi)力且成功率較低，而且該系統(tǒng)會(huì)將藥物篩選標(biāo)記基因和部分細(xì)菌質(zhì)粒片段殘留到重組病毒的基因組中，存在改變病毒原有生物學(xué)特性如病毒復(fù)制能力的可能性。在MDV基因工程疫苗毒株商品化之前，作為生物安全評(píng)價(jià)的重要前提，首先需要將相關(guān)抗性基因和外源片段從病毒基因組中剔除，這顯然進(jìn)一步增加了試驗(yàn)難度、工作量和研發(fā)成本。

2.2 CRISPR/Cas9系統(tǒng)介導(dǎo)的基因編輯

隨著CRISPR/Cas9系統(tǒng)大量應(yīng)用于大基因組DNA病毒，尤其是皰疹病毒的基因編輯以來(lái)，國(guó)內(nèi)外的科學(xué)家們已經(jīng)開始著手建立家禽皰疹病毒相關(guān)的CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)平臺(tái)和體系(圖1)，并在短短數(shù)年內(nèi)就將其應(yīng)用于絕大部分家禽皰疹病毒的基因編輯，而且已經(jīng)取得了大量重要的研究進(jìn)展(表1)。

PCR.聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)；IFA.間接免疫熒光試驗(yàn)；qRT-PCR.實(shí)時(shí)熒光定量PCR；confocal.共聚焦分析；24 well.24孔細(xì)胞板；6 well.6孔細(xì)胞板；T25.T25細(xì)胞瓶；LN.液氮保存PCR. Polymerase chain reaction; IFA. Indirect immunofluorescence assay; qRT-PCR. Quantitative real-time PCR; confocal. Confocal scanning; 24 well. 24-well plate; 6 well. 6-well plate; T25. T25 flask; LN. Liquid nitrogen storage圖1 家禽皰疹病毒CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)體系與操作流程Fig.1 Schematic of the CRISPR/Cas9-based systems for avian herpesvirus gene editing

2016年，Yao等利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)和單個(gè)病毒特異性的gRNA在預(yù)期的切割位點(diǎn)對(duì)HVT基因組的、和基因分別進(jìn)行了靶向短缺失突變，證明CRISPR/Cas9系統(tǒng)可以替代Cosmid文庫(kù)系統(tǒng)和BAC同源重組技術(shù)，高效精準(zhǔn)地實(shí)現(xiàn)MDV基因組的編輯，這是CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)在家禽皰疹病毒基因組改造中的首次應(yīng)用。緊接著，該團(tuán)隊(duì)又將CRISPR/Cas9系統(tǒng)應(yīng)用于MDV-1疫苗株CVI988/Rispens的編輯，通過雙gRNA表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染/病毒感染細(xì)胞的模式成功編輯敲除了基因和38基因，并證明基因或38基因的缺失均不影響CVI988/Rispens病毒的體外復(fù)制。與此同時(shí)，國(guó)內(nèi)學(xué)者也陸續(xù)有關(guān)于CRISPR/Cas9系統(tǒng)應(yīng)用于MDV基因編輯的報(bào)道，先后構(gòu)建了MDV-1超強(qiáng)毒株BS/15、Md5、GX0101和疫苗株CVI988/Rispens的基因部分或全部編輯缺失的毒株，相關(guān)研究同樣證實(shí)基因的缺失不會(huì)影響MDV-1毒株的體外復(fù)制。上述研究進(jìn)一步證實(shí)了CRISPR/Cas9系統(tǒng)用于MDV基因組編輯的可行性、簡(jiǎn)便性和高效性。

除了病毒蛋白編碼基因之外，Luo等利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)對(duì)MDV-1超強(qiáng)毒株RB-1B編碼的一系列微小RNA(microRNA，miRNA)基因進(jìn)行了編輯，成功構(gòu)建了一系列Meq基因簇miRNAs和Mid基因簇單個(gè)miRNA編輯缺失的毒株。令人意外的是，在CEF上的體外復(fù)制動(dòng)力學(xué)分析表明，Meq基因簇miRNAs及其單個(gè)miRNA的編輯缺失顯著降低了MDV的體外復(fù)制能力，而Mid基因簇中miR-M11的編輯缺失卻顯著增強(qiáng)了病毒的體外復(fù)制能力，這與此前報(bào)道的利用BAC克隆和Rec E/T同源重組技術(shù)構(gòu)建的相應(yīng)miRNA基因缺失的GX0101毒株C不影響其體外復(fù)制的結(jié)論完全不同，但卻與其在攻毒感染宿主體內(nèi)的復(fù)制動(dòng)力學(xué)趨勢(shì)一致。隨后，進(jìn)一步對(duì)MDV-1超強(qiáng)毒株GX0101編碼的第3個(gè)miRNA基因簇(即LAT基因簇miRNAs)的編輯發(fā)現(xiàn)，該基因簇miRNA的編輯缺失不影響MDV 在CEF上的體外復(fù)制能力以及相鄰病毒基因的表達(dá)，與此前研究報(bào)道LAT基因簇miRNAs具有調(diào)控潛伏感染的功能相一致。上述研究提示，與BAC克隆和Rec E/T同源重組技術(shù)可能改變MDV部分生物學(xué)特性(尤其是病毒復(fù)制能力)的缺陷相比，CRISPR/Cas9系統(tǒng)可能是一種更好地適用于MDV基因編輯的新技術(shù)，簡(jiǎn)便、低廉、高效，不僅可以用于較大的MDV蛋白編碼基因的編輯，還可用于像miRNA這樣僅僅21～24 nt的小片段非編碼RNA基因的編輯。

近期，有學(xué)者將CRISPR/Cas9系統(tǒng)應(yīng)用于編輯整合到MD淋巴瘤細(xì)胞染色體基因組的病毒基因。構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)Cas9蛋白的T淋巴腫瘤細(xì)胞系(lymphoblastoid cell line，LCL)MDCC-MSB-1-Cas9和MDCC-HP8-Cas9，然后用人工合成的特異性靶向gRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞系，可以成功將宿主細(xì)胞染色體基因組中整合的38基因進(jìn)行編輯，從而研究發(fā)現(xiàn)38基因的編輯缺失促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞系的增殖。隨后對(duì)MDCC-HP8-Cas9穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系基因組中整合的miR-M4(MDV編碼的宿主癌基因miR-155的病毒同源基因)進(jìn)行編輯敲除，進(jìn)一步證實(shí)miR-M4不是MDV轉(zhuǎn)化腫瘤細(xì)胞增殖的必需基因，但對(duì)淋巴瘤的誘導(dǎo)至關(guān)重要。

在MDV基因工程疫苗研究方面，CRISPR/Cas9系統(tǒng)也已展現(xiàn)出極好的技術(shù)優(yōu)勢(shì)。2018年，利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)和非同源末端連接(non-homologous end-joining，NHEJ)，研究人員成功將IBDV的2基因和紅色熒光蛋白(red fluorescent protein, RFP)串聯(lián)表達(dá)盒編輯插入到HVT基因組的UL45/46位點(diǎn)，然后通過-重組酶系統(tǒng)去除外源篩選基因RFP，從而構(gòu)建了HVT/IBDV-VP2二價(jià)重組疫苗候選毒株。緊接著，利用同樣的策略將ILTV-/和AIV-H9 N2-表達(dá)盒分別編輯插入HVT/IBDV-VP2重組病毒基因組的065/066和US2位點(diǎn)，成功構(gòu)建了HVT-VP2-gDgI-HA三價(jià)重組疫苗候選毒株。此外，有學(xué)者利用CRISPR/Cas9編輯系統(tǒng)和同源定向修復(fù)(homology-directed repair，HDR)，首先構(gòu)建了一個(gè)帶有UL45/46兩端同源臂的pHVT-UL45-46-eGFP表達(dá)盒，利用CRISPR/Cas9-HDR技術(shù)將其定向插入到HVT基因組中構(gòu)建供體病毒HVT-GFP，然后利用同樣的策略構(gòu)建攜帶相同同源臂且可表達(dá)AIV H7 N9-HA基因的pHVT-UL45-46-H7 N9-HA表達(dá)盒，再次利用CRISPR/Cas9-HDR技術(shù)將該表達(dá)盒精準(zhǔn)插入并替換重組病毒HVT-GFP中的綠色熒光蛋白(green fluorescent protein, GFP)，成功構(gòu)建了HVT-H7 N9-HA雙價(jià)候選疫苗毒株。與上述不同，也有學(xué)者利用傳統(tǒng)的BAC和Rec E/T同源重組系統(tǒng)先將AIV BJ/15株的H9 N2-HA基因插入到HVT-BAC感染性克隆基因組的UL45/UL46之間，通過半乳糖激酶篩選系統(tǒng)在SW102大腸桿菌中構(gòu)建HVT-BAC-H9 N2-HA供體DNA，然后再利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)編輯剔除BAC殘余序列，最終構(gòu)建僅含AIV H9 N2-HA基因的rHVT-H9 N2-HA重組疫苗候選毒株。

將CRISPR/Cas9系統(tǒng)應(yīng)用于MDV的抗病毒治療或抗病遺傳育種，最近也已進(jìn)行了一些探索。針對(duì)MDV編碼的6個(gè)病毒復(fù)制必須基因(6、19、27、30、49和4)，研究人員設(shè)計(jì)了11個(gè)gRNAs分別對(duì)MDV超強(qiáng)毒株RB-1B進(jìn)行編輯，研究顯示，大多數(shù)單個(gè)的gRNA雖然可以顯著抑制病毒的復(fù)制，但也可能導(dǎo)致逃逸突變體病毒的出現(xiàn)，兩個(gè)或兩個(gè)以上的gRNAs組合則可以完全消除病毒，即使經(jīng)連續(xù)傳代之后也沒有觀察到病毒逃逸突變體，這一發(fā)現(xiàn)說(shuō)明CRISPR/Cas9系統(tǒng)可以有效地阻止MDV的復(fù)制，為未來(lái)MD的抗病毒治療研究提供了可能性。更有趣的是，最近還有科學(xué)家嘗試培育了一種可在體內(nèi)共表達(dá)Cas9蛋白和ICP4-gRNAs(gICP4)的轉(zhuǎn)基因雞，通過腹腔注射MDV進(jìn)行動(dòng)物攻毒試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與僅轉(zhuǎn)染Cas9基因的野生型對(duì)照雞相比，表達(dá)ICP4-gRNAs/Cas9的轉(zhuǎn)基因雞體內(nèi)MDV復(fù)制水平明顯減少，提示CRISPR/Cas9或許可以作為抗病遺傳育種的一種選擇，用于控制雞群MDV的流行和感染。除了針對(duì)MDV自身，類似的抗病毒策略還被研究應(yīng)用于同時(shí)抵抗其它的家禽免疫抑制病與腫瘤病病毒。比如，將特異性靶向ALV-J和禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒(reticuloendotheliosis virus，REV)長(zhǎng)末端重復(fù)序列基因(long terminal repeat，LTR)的sgRNA，通過CRISPR/Cas9-HDR技術(shù)定向插入到814疫苗株的US2基因位點(diǎn)，分別構(gòu)建重組病毒r814-Cas9-sgLTR-8和rMDV-Cas9-gLTR1/6，這兩個(gè)重組病毒在宿主細(xì)胞中均能有效抑制ALV-J和REV的增殖，表明利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)構(gòu)建攜帶并能穩(wěn)定表達(dá)針對(duì)異源病毒的sgRNA的MDV重組疫苗，免疫宿主雞后可有效抵御相關(guān)病毒的攻擊，為ALV-J和REV的共感染提供了一種全新的防控策略，具有潛在的市場(chǎng)應(yīng)用前景。

3 非致瘤性家禽皰疹病毒的CRISPR/Cas9基因編輯

DEV感染鴨導(dǎo)致的病毒性腸炎流行廣泛，傳播迅速，發(fā)病率和死亡率都很高，是危害水禽養(yǎng)殖最嚴(yán)重的疫病之一。2017年，Zou等利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)和HDR介導(dǎo)的基因編輯策略，在DEV C-KCE毒株的UL27/UL26和US7/US8位點(diǎn)重組插入H5N1亞型高致病性AIV的基因和鴨坦布蘇病毒(duck tembusu virus，DTMUV)的和基因，構(gòu)建的重組病毒C-KCE-HA/PrM-E可作為一種潛在的三價(jià)候選疫苗株，用于同時(shí)預(yù)防H5N1-AIV、DTMUV和DEV的感染。隨后，有學(xué)者利用CRISPR/Cas9-NHEJ技術(shù)將AIV H5-HA抗原基因表達(dá)盒插入到DEV的UL27/UL26基因之間，構(gòu)建了重組表達(dá)AIV H5-HA的DEV雙價(jià)重組疫苗毒株。此外，利用相同的技術(shù)策略，有研究人員在編輯敲除ILTV毒力因子和4的同時(shí)，重組插入了NDV-F蛋白外源基因，構(gòu)建的重組病毒既不影響ILTV的復(fù)制，NDV-F蛋白也能正常表達(dá)。ILTV感染引起的雞傳染性喉氣管炎(infectious laryngotracheitis，ILT)和NDV引起的雞新城疫(Newcastle disease，ND)，都是嚴(yán)重危害家禽養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展的重要呼吸系統(tǒng)病，利用上述策略構(gòu)建多價(jià)重組疫苗，為此類疫病的有效防控提供了新的思路。

4 前景與展望

CRISPR/Cas系統(tǒng)是最新一代的基因組編輯技術(shù)，它能夠特異、高效、幾乎無(wú)所不能地改造(突變、敲除或插入)動(dòng)植物乃至微生物的基因組。自2012年問世以來(lái)，該技術(shù)迅速成為生命科學(xué)領(lǐng)域的全球研究焦點(diǎn)，并于2020年獲得諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。目前，發(fā)展最快、應(yīng)用最廣、效率最高的CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)已廣泛應(yīng)用于各種相關(guān)研究，如模式動(dòng)物構(gòu)建、人類疾病研究、基因治療、動(dòng)植物遺傳育種等。CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)在基因組比較龐大的DNA病毒研究中的應(yīng)用，也已成為新的國(guó)際研究熱點(diǎn)，其中聚焦最多的是皰疹病毒。家禽皰疹病毒主要包括MDV、HVT、DEV、ILTV等，CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)在這些家禽皰疹病毒的應(yīng)用主要集中在3個(gè)方面：一是對(duì)部分重要的病毒基因進(jìn)行突變或缺失，開展病毒基因功能和致病機(jī)制研究；二是利用NHEJ和/或HDR技術(shù)構(gòu)建以家禽皰疹病毒基因缺失疫苗或基因重組多價(jià)疫苗；三是研究探索家禽抗病毒治療及抗病遺傳育種的新策略和新技術(shù)。

利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)構(gòu)建一系列的MDV基因缺失疫苗、基因工程載體疫苗和多價(jià)疫苗，可能會(huì)成為今后相當(dāng)一段時(shí)期內(nèi)最受關(guān)注的研究方向和內(nèi)容。以HVT作為載體構(gòu)建的基因工程二價(jià)苗和三價(jià)苗，目前已在臨床實(shí)踐中得到應(yīng)用。但是，近50年來(lái)在MD疫苗長(zhǎng)期廣泛的使用和高強(qiáng)度的疫苗免疫壓力下，MDV的毒力正在不斷增強(qiáng)甚至發(fā)生變異，今后若要取得良好的免疫防控效果，利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)對(duì)當(dāng)前最新流行的MDV-1優(yōu)勢(shì)毒株進(jìn)行基因組改造以構(gòu)建能夠有效防控vv+MDV或變異株流行的新型高效MD基因工程疫苗，是需要優(yōu)先考慮的問題。同時(shí)，利用CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)對(duì)家禽皰疹病毒的全基因組進(jìn)行g(shù)RNA設(shè)計(jì)、分析和掃描編輯，也有可能會(huì)為進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)和鑒定新的致病因子和毒力基因帶來(lái)新的契機(jī)。顯然，CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)在家禽皰疹病毒研究應(yīng)用的大幕已經(jīng)拉開，更多挑戰(zhàn)和驚喜也正等待研究者們進(jìn)一步努力揭曉。