蔡亮，張炳東

（廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院麻醉科，廣西 南寧 530021）

0 引言

腦卒中已經(jīng)成為威脅人類生命健康的第二大疾病，每年約有1500萬(wàn)新發(fā)病例[1,2]。病理學(xué)將腦卒中分為兩大類：缺血性腦卒中（Cerebral Ischemic Stroke，CIS）和出血性腦卒中，其中約85%腦卒中病例屬于缺血性腦卒中。CIS誘因是大腦供血的主要血管栓塞或則體循環(huán)功能障礙導(dǎo)致腦組織供血不足。CIS損傷機(jī)制為缺血缺氧導(dǎo)致細(xì)胞外微環(huán)境改變和小膠質(zhì)等免疫細(xì)胞在缺血區(qū)被激活釋放炎癥因子[3,4]。與此同時(shí)，無(wú)氧代謝促使活性氮（Reactive nitrogen species，RNS）、活性氧（Reactive oxygen species，ROS）等自由基水平升高[5]。目前，急性缺血性腦卒中的首選治療方式是通過(guò)靜脈注射重組組織型纖溶酶原激活劑（Recombinant tissue plasminogen activator，rt-PA）重建血運(yùn)。雖然恢復(fù)缺血器官的血流對(duì)防止組織出現(xiàn)不可逆損傷至關(guān)重要，但再灌注本身也可能會(huì)導(dǎo)致器官損傷。CIRI并不單獨(dú)發(fā)生于缺血性腦卒中術(shù)后，首先顱內(nèi)腫瘤和血腫會(huì)壓迫病變區(qū)域的血管和增加顱內(nèi)壓，上訴原因會(huì)導(dǎo)致局部腦組織出現(xiàn)缺血、缺氧、水腫、壞死等諸多病理改變[5-7]；其次失血性休克和術(shù)中心律失常、心臟驟停都會(huì)導(dǎo)致體循環(huán)功能障礙、血容量不足和血流動(dòng)力學(xué)障礙從而引起腦組織缺血缺氧[8,9]；最后我們發(fā)現(xiàn)心肺轉(zhuǎn)流術(shù)（Cardiopulmonary bypass，CPB）治療過(guò)程中的持續(xù)性低血壓或手術(shù)操作也會(huì)導(dǎo)致CIRI[10,11]。 JAK1/STAT1信號(hào)通路作為一種重要的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。研究發(fā)現(xiàn)JAK/STAT信號(hào)通路不僅與造血、炎癥和免疫相關(guān)疾病有著密切聯(lián)系，還與細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖和分化有關(guān)[12,13]。TLR4/NF-κB信號(hào)通路在免疫中起著關(guān)鍵作用。研究發(fā)現(xiàn)TLR4/NF-κB信號(hào)通路激活后不僅能促進(jìn)星形膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞活化并釋放炎癥介質(zhì)，還會(huì)激活金屬蛋白途徑損傷血腦屏障[14-16]?，F(xiàn)發(fā)現(xiàn)TLR4/NF-κB與JAK/STAT信號(hào)通路之間存在串?dāng)_，且JAK1/STAT1信號(hào)通路參與調(diào)控TLR4信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)的炎癥反應(yīng)[17-19]。

越來(lái)越多的天然植物提取物如姜黃素、兒茶素被應(yīng)用于醫(yī)療領(lǐng)域，從天然植物中獲得外源性抗氧化劑已經(jīng)被作為減輕疾病氧化損傷的重要新策略。蘆薈苷作為蘆薈的天然提取物，屬于天然酪氨酸酶抑制劑，具有抗炎、抗腫瘤、抗氧化、等多種生物活性[20,21]。蘆薈苷的腦保護(hù)作用已有一定前期研究，基礎(chǔ)研究發(fā)現(xiàn)蘆薈苷具有減輕神經(jīng)系統(tǒng)疾病腦水腫、血腦屏障破壞、神經(jīng)炎癥、神經(jīng)元凋亡、氧化應(yīng)激和改善認(rèn)知功能障礙的作用[22,23]。鑒此，本實(shí)驗(yàn)擬從信號(hào)通路、細(xì)胞凋亡、炎癥方面探索蘆薈苷改善腦缺血再灌注損傷中的作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 藥品和試劑

蘆薈苷（selleck公司），白介素10(IL-10)ELISA試劑盒（武漢華美公司），腫瘤壞死因子α（TNF-α）ELISA試劑盒（武漢華美公司），蘇木素伊紅(HE)染色試劑盒（索萊寶公司），TaKaRaMiniBEST Universal RNA Extraction Kit（TaKara公司），PrimeScript? RT Master Mix（TaKara公司），TB Green? Premix Ex Taq? II Tli RNaseH Plus（TaKara公司）, JAK1抗體（abcam公司），STAT1抗體（CST公司），p-STAT1抗體（abcam公司），TLR4抗體（abcam公司）, NF-kB抗體（abcam公司），p-NF-kB抗體（abcam公司），Caspase-3抗體（abcam公司），Bcl-2抗體（abcam公司），GAPDH抗體（abcam公司），β-actin抗體（BIOSS公司）。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康雄性SD大鼠75只，體重250g～280g，SPF級(jí)，購(gòu)自于廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK（桂）2014-0002，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SCXK（桂）2014-0003。本實(shí)驗(yàn)符合廣西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理要求。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物的分組及處理

75只SD雄性大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組（C組，n=25）、模型組（M組，n=25）和治療組（A組，n=25）。A組和M組參照楊麗[24]等人實(shí)驗(yàn)采用線栓法構(gòu)建大鼠腦缺血再灌注損傷（Middle cerebral artery occlusion and reperfusion，MCAO/R）模型，C組只結(jié)扎對(duì)應(yīng)的血管，A組再灌注時(shí)腹腔注射50mg/Kg蘆薈苷進(jìn)行治療。大鼠腦缺血再灌注24小時(shí)后及時(shí)取材并保存。

1.2.2 longa神經(jīng)功能評(píng)分

參照zea-longa神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)對(duì)再灌注24h大鼠進(jìn)行評(píng)分。具體標(biāo)準(zhǔn)為無(wú)神經(jīng)功能缺損為0分；患側(cè)前爪不能完全伸展為1分；行走時(shí)向患側(cè)轉(zhuǎn)圈為2分；行走時(shí)身體向患側(cè)傾倒為3分；不能自發(fā)行走并喪失意識(shí)為4分。

1.2.3 腦梗死面積測(cè)定

缺血再灌注24h后取出整個(gè)腦組織置于負(fù)20℃冰箱冷凍20分鐘，然后將腦組織切分為5-6片，厚度為2mm。將切好的大鼠腦片放入1% TTC溶液中，37 ℃避光染色30分鐘，染色結(jié)束后觀察并拍照記錄，采用image J軟件測(cè)算梗死面積。

1.2.4 蘇木素-伊紅染色

對(duì)缺血再灌注24h的大鼠腦組織進(jìn)行灌注固定，將灌注固定好的腦組織進(jìn)行包埋切片，取石蠟切片進(jìn)行二甲苯脫蠟、梯度酒精水化（100%→95%→90%→80%→70%→50%）后進(jìn)行蘇木素和伊紅染色，脫水透明處理后封片觀察。

1.2.5 腦組織炎癥檢測(cè)

采用大鼠酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒檢測(cè)缺血再灌注24h各組腦組織IL-10和TNF-α的變化。

1.2.6 qPCR檢測(cè)JAK1、STAT1、TLR4和NF-κB轉(zhuǎn)錄水平

采用TaKaRaMiniBEST Universal RNA Extraction Kit（9767）提取總RNA后再使用PrimeScript? RT Master Mix（036A）進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA，最后使用PrimeScript? RT Master Mix（820A）進(jìn)行PCR擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)。最后以GAPDH基因作為內(nèi)參基因并根據(jù)2-ΔΔCt公式計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量。本實(shí)驗(yàn)引物序列如下：

表1 引物序列

1.2.7 采用Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)信號(hào)通路及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)

使用預(yù)冷PBS緩沖液洗去海馬組織血漬，并使用蛋白裂解工作液（RIPA裂解液、蛋白酶抑制劑、蛋白磷酸酶抑制劑，100∶1∶1）裂解海馬組織獲得蛋白上清液。向上清液中加入5×上樣緩沖液后100℃水浴變性。SDS-PAGE電泳使蛋白分離。200 mA 90-120 min（根據(jù)分子量大小）將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，5%BSA封閉2h，封閉后的條帶放入一抗工作液4℃過(guò)夜，TBST緩沖液洗去多余一抗后放入熒光二抗工作液避光孵育2h后顯影，最后采用image J軟件對(duì)蛋白條帶進(jìn)行灰度值分析。

1.2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 26.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t法。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 longa神經(jīng)功能評(píng)分

根據(jù)longa神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)評(píng)定三組大鼠腦缺血再灌注24h后的神經(jīng)功能。C組未見神經(jīng)功能障礙；與C組比較，M組和A組大鼠神經(jīng)功能受損嚴(yán)重（P＜0.01）；與M組比較，A組大鼠神經(jīng)功能受損減輕（P＜0.01）。

圖1 三組大鼠Longa評(píng)分的比較（n=25）

2.2 各組大鼠腦梗死面積比較

M組與A組大鼠腦缺血再灌注24h后出現(xiàn)不同面積的梗死灶，C組未見梗死灶。使用image j軟件測(cè)定三組腦組織梗死面積并計(jì)算梗死面積百分比。我們發(fā)現(xiàn)與C組比較，M組與A組腦組織梗死面積百分比明顯增大（P＜0.05）；而與M組比較，A組腦組織梗死面積百分比顯著減少（P＜0.05）。

圖2 三組大鼠腦組織TTC染色結(jié)果（n=5）

圖3 三組大鼠腦組織梗死面積百分比的比較

2.3 各組腦組織病理?yè)p傷情況比較

病理顯微鏡觀察各組大鼠海馬組織損傷情況，如下圖所示C組海馬組織細(xì)胞排列有序、層次分明，結(jié)構(gòu)清晰完整，核仁明顯和基質(zhì)清晰均勻；與C組比較，M組海馬神經(jīng)元數(shù)量減少且排列不規(guī)整，并出現(xiàn)細(xì)胞核固縮、染色加深和彌漫空泡樣變性。通過(guò)觀察A組海馬組織，我們發(fā)現(xiàn)注射蘆薈苷藥液能改善海馬組織損傷情況。

圖4 各組大鼠海馬組織病理學(xué)改變（n=5，放大倍數(shù)40×，100×）

2.4 各組腦組織IL-10、TNF-α含量比較

通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附反應(yīng)檢測(cè)大鼠海馬組織中的IL-10、TNF-α變化。我們發(fā)現(xiàn)與C組對(duì)比，M組和A組海馬組織中的IL-10抗炎因子明顯降低（P＜0.05），與M組相比，A組海馬組織中的IL-10明顯升高（P＜0.05）；與C組對(duì)比，M組和A組大鼠海馬組織中的TNF-α炎癥因子明顯增加（P＜0.05），與M組相比，A組大鼠海馬組織中的TNF-α明顯降低（P＜0.05）。

圖5 各組大鼠腦組織TNF-α和IL-10表達(dá)水平比較（n=5）

2.5 TLR4、NF-κB、JAK1和STAT1 mRNA在各組腦組織中的表達(dá)比較

使用RT-qPCR方法檢測(cè)TLR4、NF-Kβ、JAK1和STAT1的轉(zhuǎn)錄水平。我們發(fā)現(xiàn)與C組比較，M組的TLR4、NF-Kβ、JAK1和STAT1的轉(zhuǎn)錄明顯增加（P＜0.01）；同時(shí)與M組相比， A組的TLR4、NFKβ、JAK1和STAT1的轉(zhuǎn)錄顯著降低（P＜0.05）。

2.6 TLR4/NF-Kβ、JAK1/STAT1信號(hào)通路相關(guān)蛋白及凋亡蛋白在腦組織中的表達(dá)比較

使用image J軟件檢測(cè)各組目的蛋白、內(nèi)參蛋白或總蛋白的灰度值，目的蛋白在海馬組織中相對(duì)表達(dá)量即為目的蛋白與內(nèi)參蛋白的灰度值比值或目的蛋白與總蛋白的灰度值比值。如圖6.1所示Caspase3蛋白在M組和A組中表達(dá)較C組明顯增加（P＜0.05）；與M組對(duì)比，A組Caspase3蛋白的表達(dá)明顯降低（P＜0.05）。與此同時(shí)，M組Bcl-2蛋白表達(dá)較C組明顯被抑制（P＜0.05），而A組Bcl-2蛋白表達(dá)較M組顯著增加（P＜0.01）。

圖6 各組大鼠海馬組織TLR4、NF-κB、JAK1、STAT1的mRNA表達(dá)水平比較（n=5）

圖6.1 Bcl-2、Caspase3蛋白在三組大鼠海馬組織中的表達(dá)比較（n=5）

觀察JAK1/STAT1信號(hào)通路相關(guān)蛋白在大鼠海馬組織中的表達(dá)水平，如圖6.2所示M組JAK1蛋白表達(dá)較C組明顯升高（P＜0.05）；與M組相比，A組海馬組織JAK1蛋白水平明顯下降（P＜0.05）。同樣M組海馬組織STAT1蛋白磷酸化水平較C組明顯增高（P＜0.05）；而A組海馬組織STAT1蛋白磷酸化水平較M組明顯降低（P＜0.05）。結(jié)果顯示M組海馬組織TLR4蛋白表達(dá)水平較C組明顯增高（P＜0.05），而TLR4蛋白在A組海馬組織中的表達(dá)水平較M組明顯被抑制（P＜0.05）。同樣，NF-κB蛋白在M組海馬組織中的磷酸化水平較C組顯著增加（P＜0.05）；與M組相比，A組海馬組織NF-κB磷酸化水平明顯下調(diào)（P＜0.05）。

圖6.2 JAK1/STAT1和TLR4/NF-κB通路相關(guān)蛋白在三組大鼠海馬組織中的表達(dá)（n=5）

圖6.3 各組JAK1/STAT1和TLR4/NF-κB通路相關(guān)蛋白在海馬組織中的表達(dá)比較

3 討論

CIRI涉及腦水腫、神經(jīng)元凋亡、血腦屏障破壞等病理現(xiàn)象[5]。CIRI不僅存在于缺血性腦卒中的治療過(guò)程，也存在于頸部手術(shù)術(shù)后、術(shù)中低血壓以及體外循環(huán)過(guò)程[8-11]。自由基損傷在CIRI中起著核心作用，大腦是全身耗氧量最高的器官，這種高耗氧量決定了大腦較其他器官更容易產(chǎn)生自由基[5]?，F(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)引入外源性抗氧化劑有利于減輕腦缺血再灌注所帶來(lái)的損傷。蘆薈苷是從蘆薈中提取的主要蒽醌苷，屬于酪氨酸酶抑制劑，具有有抗炎、抗病毒、抗氧化等多種生物活性。

現(xiàn)發(fā)現(xiàn)多種藥物改善腦缺血再灌注損傷的機(jī)制與JAK1/STAT1和TLR4/NF-κB信號(hào)通路有關(guān)，同時(shí)有研究證明二者之間存在串?dāng)_關(guān)系[17-19]。神經(jīng)炎癥是導(dǎo)致CIRI最重要的機(jī)制之一，首先TNF-α在CIRI中起著重要作用，它可以增加血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性和細(xì)胞粘附分子表達(dá)，也能促進(jìn)白細(xì)胞浸潤(rùn)和神經(jīng)元凋亡的進(jìn)程[25]；其次NF-κB是調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)和細(xì)胞存活的重要轉(zhuǎn)錄因子，它主要由缺血再灌注損傷過(guò)程中產(chǎn)生的ROS激活，NF-κB可以促進(jìn)各類炎癥細(xì)胞激活并釋放炎癥因子；同時(shí)在阿爾茨海默癥中發(fā)現(xiàn)NF-κB與Tau蛋白、β樣淀粉蛋白的代謝密切相關(guān)，我們認(rèn)為NF-κB可能與腦缺血再灌注損傷愈后認(rèn)知功能障礙密切相關(guān)[14,15,26,27]。

神經(jīng)功能評(píng)分和腦組織梗死面積能直接反應(yīng)腦組織損傷情況及蘆薈苷治療效果。本研究結(jié)果顯示M組大鼠神經(jīng)功能受到嚴(yán)重?fù)p傷，而注射蘆薈苷藥液后能夠明顯改善CIRI引起的大鼠神經(jīng)功能障礙；TTC檢測(cè)CIRI能引起腦組織梗死，而注射蘆薈苷藥液后能夠有效減少大鼠腦組織梗死面積。蘇木精-伊紅染色是最適合觀察組織損傷情況的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，鏡下發(fā)現(xiàn)CIRI引起大鼠腦組織及海馬組織出現(xiàn)大量病理樣改變，而注射蘆薈苷能夠有效改善缺血再灌注誘導(dǎo)的大鼠腦組織損傷。炎癥貫穿CIRI的整個(gè)病理過(guò)程，并與預(yù)后及其他病理機(jī)制密切相關(guān)；通過(guò)分析腦組織中的NF-κB磷酸化和TNF-α、IL-10水平，我們發(fā)現(xiàn)蘆薈苷能夠有效抑制CIRI中的神經(jīng)炎癥。我們使用RT-qPCR和免疫蛋白印記法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)蘆薈苷不僅可以抑制腦缺血再灌注引起的TLR4、NF-κB、JAK1、STAT1 mRNA轉(zhuǎn)錄，還會(huì)抑制TLR4、JAK1蛋白表達(dá)水平與NF-κB、STAT1蛋白磷酸化水平。Caspase3蛋白是細(xì)胞凋亡信號(hào)傳導(dǎo)級(jí)聯(lián)反應(yīng)中重要的一環(huán)，而Bcl-2蛋白是細(xì)胞內(nèi)重要的抗凋亡蛋白；根據(jù)免疫蛋白印記結(jié)果我們發(fā)現(xiàn)蘆薈苷能夠抑制腦缺血再灌注中的Bcl-2蛋白降低和 Caspase3蛋白升高。

綜上所述，本研究表明蘆薈苷能夠改善腦缺血再灌注損傷，其機(jī)制可能JAK1/STAT1和TLR4/NF-κB信號(hào)通路有關(guān)。