宋維佳, 宋秀賢, 俞志明, 李 靖, 張 悅

海洋中麻痹性貝類毒素的合成轉(zhuǎn)化及其影響因素研究進展

宋維佳1, 2, 3, 4, 宋秀賢1, 2, 3, 4, 俞志明1, 2, 3, 4, 李 靖1, 2, 3, 張 悅1, 2, 3

(1. 中國科學(xué)院海洋研究所海洋生態(tài)與環(huán)境科學(xué)重點實驗室, 山東 青島 266071; 2. 青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點國家實驗室 海洋生態(tài)與環(huán)境科學(xué)功能實驗室, 山東 青島 266237; 3. 中國科學(xué)院海洋大科學(xué)研究中心, 山東 青島 266071；4. 中國科學(xué)院大學(xué), 北京 100049)

麻痹性貝類毒素(paralytic shellfish toxins, PSTs)是由某些甲藻產(chǎn)生的一種高毒性神經(jīng)毒素, 在海洋環(huán)境中分布廣、危害大, 可對水產(chǎn)養(yǎng)殖和人類健康造成重大危害；PSTs毒素的毒性大小隨種類和結(jié)構(gòu)的不同有較大差異。迄今, 國內(nèi)外學(xué)者針對PSTs的來源分布、遷移轉(zhuǎn)化、生物合成及其影響因素等開展了大量的調(diào)查研究, 但目前對于藻細(xì)胞產(chǎn)毒的生物合成途徑、遺傳學(xué)特征及其環(huán)境調(diào)控機理等研究仍處于起步階段。PSTs的生物合成過程不僅與藻細(xì)胞自身生長階段有關(guān), 還會受到光照、溫度、營養(yǎng)鹽等多種環(huán)境因素的影響, 環(huán)境條件的改變會引起藻細(xì)胞毒素組成和含量發(fā)生不同程度的變化。近年來, 研究人員應(yīng)用基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù), 發(fā)現(xiàn)了產(chǎn)生PSTs的典型甲藻——亞歷山大藻()細(xì)胞內(nèi)與PSTs毒素生物合成相關(guān)的某些基因或蛋白質(zhì), 對我們更清晰地了解亞歷山大藻產(chǎn)生PSTs毒素的機制具有重要意義。本文綜合以往的研究報道, 對亞歷山大藻中PSTs的生物合成與轉(zhuǎn)化及其主要影響因素進行了總結(jié), 以期為產(chǎn)毒有害藻華的防治提供科學(xué)依據(jù)。

甲藻; 麻痹性貝類毒素; 生物合成; 環(huán)境因素

隨著人類活動影響的加劇, 有害藻華已經(jīng)成為一種全球性的海洋生態(tài)問題, 且呈現(xiàn)出暴發(fā)規(guī)模加大、持續(xù)時間更長、致災(zāi)效應(yīng)加重、全球擴張明顯等特點[1], 對海洋生態(tài)系統(tǒng)的平衡、人類的健康與安全構(gòu)成嚴(yán)重威脅。尤其值得注意的是, 近年來有害藻華的原因種呈現(xiàn)出向甲藻類、有毒藻類演變的趨勢, 有毒甲藻藻華頻繁暴發(fā)。其中, 亞歷山大藻()是我國近海較為常見的、能夠產(chǎn)生麻痹性貝類毒素(paralytic shellfish toxins, PSTs)等多種藻毒素的甲藻類群, 2002—2017年間, 在我國近海形成了24次赤潮[2], 同時歐洲、北美等全球范圍內(nèi)多個海域也曾多次暴發(fā)該藻藻華。不僅破壞了海洋生態(tài)環(huán)境, 還給海水養(yǎng)殖業(yè)和濱海旅游業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失。更為嚴(yán)重的是, 當(dāng)海域中暴發(fā)有毒亞歷山大藻藻華后, 由藻細(xì)胞合成的PSTs毒素將通過食物鏈的生物放大作用(如貝類等濾食有毒藻細(xì)胞后, 毒素可在其體內(nèi)積累), 最終進入食物鏈頂端的人類體內(nèi)。其帶有正電荷的胍基基團可以與電壓門控鈉離子通道的羧基基團發(fā)生相互作用, 阻斷鈉離子通過神經(jīng)細(xì)胞膜, 影響正常的動作電位形成, 進而阻斷神經(jīng)傳導(dǎo), 對神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生麻痹作用, 從而導(dǎo)致中毒, 甚至造成死亡。

從全球范圍看, 近年來PSTs中毒事件顯著增加, 分布區(qū)域和影響范圍迅速擴散, 對海洋生物乃至人類健康與安全構(gòu)成了嚴(yán)重威脅。20世紀(jì)70年代以前, PSTs僅在北美、日本、歐洲沿海海域有所分布, 有記錄的PSTs中毒事件約為1 600人次; 而到2009年, 在環(huán)北太平洋沿海地區(qū)、歐洲沿海、美國東海岸、澳大利亞、北美南部等幾乎全球范圍內(nèi)均有PSTs的分布[3]。據(jù)估計, 近年來全球范圍內(nèi)每年發(fā)生約2 000起PSTs中毒事件, 人員死亡率約為15%[3-4], 已成為全球性的公共健康問題。在我國的廣東沿海、福建沿海、長江口鄰近海域、海州灣、北黃海和河北秦皇島近岸等海域PSTs問題也較為突出[5]。

海洋中PSTs毒素的生物合成受到營養(yǎng)鹽、溫度、光照等諸多外界環(huán)境因子的影響, 處于不同環(huán)境條件下的藻細(xì)胞其毒素的組成和含量是不同的。另外, 一些研究結(jié)果表明不同生長階段、不同細(xì)胞周期的亞歷山大藻細(xì)胞內(nèi)毒素含量也有差異, 毒素的生物合成是一個不連續(xù)的過程, 這說明藻細(xì)胞的產(chǎn)毒情況與其自身的生長情況密切相關(guān)[6-7]。

目前, 雖然亞歷山大藻產(chǎn)毒機制已成為有害藻華研究領(lǐng)域中的一個熱點, 但對于藻細(xì)胞產(chǎn)毒的環(huán)境調(diào)控機理、生物合成途徑和遺傳學(xué)機制等方面的研究仍處于起步階段。近年來隨著基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的發(fā)展, 針對PSTs的生物合成研究取得了一些新的進展, 學(xué)者們篩選鑒定出亞歷山大藻細(xì)胞內(nèi)與毒素生物合成相關(guān)的某些基因或蛋白質(zhì), 對揭示亞歷山大藻毒素的生物合成途徑具有重要意義。本文基于國內(nèi)外大量研究對亞歷山大藻中PSTs毒素的生物合成與轉(zhuǎn)化、外界環(huán)境因素對其影響等進行了綜述, 將為揭示PSTs毒素的產(chǎn)生及其環(huán)境因素之間的關(guān)系提供理論指導(dǎo), 對于產(chǎn)毒甲藻赤潮的有效防治、保障人類健康和海洋生態(tài)安全具有重要意義。

1 海洋中PSTs的來源

海洋環(huán)境中PSTs毒素主要來源于亞歷山大藻和裸甲藻, 已知的能夠產(chǎn)生PSTs的藻類包括塔瑪亞歷山大藻()、鏈狀亞歷山大藻()、微小亞歷山大藻()、鏈狀裸甲藻()等。近年來, 隨著城市化和工業(yè)化進程的加劇, 在沿海區(qū)域經(jīng)濟快速發(fā)展的同時, 近岸海域富營養(yǎng)化問題日益顯現(xiàn)。富營養(yǎng)化不僅表現(xiàn)為海水中營養(yǎng)物質(zhì)含量的劇烈升高, 更為嚴(yán)重的是海水中營養(yǎng)物質(zhì)的結(jié)構(gòu)也發(fā)生明顯的變化, 如N、P、Si三種主要營養(yǎng)鹽之間的比例發(fā)生改變, 尿素等有機態(tài)營養(yǎng)物質(zhì)在總營養(yǎng)物質(zhì)中所占比例上升等[8]。水體中營養(yǎng)物質(zhì)結(jié)構(gòu)的改變會導(dǎo)致浮游植物優(yōu)勢類群的更替, 一些有毒甲藻在浮游植物群落中占據(jù)優(yōu)勢, 在藻細(xì)胞快速繁殖的同時產(chǎn)生大量藻毒素。

亞歷山大藻屬中約有30余個藻種, 其中至少一半可以產(chǎn)生PSTs毒素。盡管不同藻種以及同一藻種的不同株系均具有不同的產(chǎn)毒特性, 甚至同一株系藻細(xì)胞在不同的環(huán)境條件下的產(chǎn)毒特征也有所差異, 但亞歷山大藻屬的產(chǎn)毒種所產(chǎn)生的PSTs毒素種類相對穩(wěn)定, 主要可以產(chǎn)生兩類PSTs毒素: 氨基甲酸酯類毒素和N-磺酰氨甲酰基類毒素[9]。另外, 研究表明, 不僅亞歷山大藻營養(yǎng)細(xì)胞能夠產(chǎn)生毒素, 其在不利環(huán)境下形成的孢囊也具有較強的產(chǎn)毒能力[10]。濾食性貝類攝食游動細(xì)胞和孢囊都會引起PSTs在其組織內(nèi)的積累。而鑒于PSTs較強的水溶性特征, 自然水體中往往也存在一定含量的溶解態(tài)PSTs毒素, 已有報道表明美國、葡萄牙等近海海域均出現(xiàn)過水體中PSTs高于產(chǎn)毒藻細(xì)胞內(nèi)PSTs含量的情況[11-13]。另有研究表明, 被產(chǎn)毒藻釋放到胞外水體的這部分毒素對于水生生物仍具有顯著危害[14]。

多項研究發(fā)現(xiàn), 貝類生物體內(nèi)的PSTs含量與水體中亞歷山大藻營養(yǎng)細(xì)胞密度、表層沉積物中孢囊的分布與豐度具有顯著的正相關(guān)關(guān)系[15-17]。貝類生物通過濾食藻類攝入的PSTs在其體內(nèi)不斷累積, 當(dāng)達(dá)到一定濃度后會引起貝類生物發(fā)生殼瓣閉合反應(yīng)、耗氧反應(yīng)、足絲反應(yīng)、心搏, 以及神經(jīng)生理反應(yīng)和攝食反應(yīng), 甚至影響到存活[18]。另一方面, 學(xué)者們深入分析了貝類、魚類生物體內(nèi)抗氧化酶系統(tǒng)對攝入PSTs毒素的響應(yīng)。結(jié)果表明, 在攝入一定的PSTs毒素后, 貽貝、蝦夷扇貝()、鱸魚()等生物體內(nèi)的超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶(GSTs)等酶活性均受到不同程度的激活[19-21]。這說明PSTs毒素進入貝類、魚類等生物體內(nèi)后將誘導(dǎo)產(chǎn)生大量的活性氧自由基, 進而導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化損傷, 對貝類、魚類生物產(chǎn)生一定的毒害作用。更為嚴(yán)重的是, 該毒素若通過食物鏈向更高營養(yǎng)級生物傳遞將會對人類的生命健康與安全造成嚴(yán)重威脅。

PSTs作為一類由石房蛤毒素(saxitoxin, STX)及其衍生物組成的生物毒素, 其對海洋生物及人類的毒性效應(yīng)隨毒素的種類和結(jié)構(gòu)的不同有較大差異。了解產(chǎn)毒藻和其他海洋生物體內(nèi)PSTs的種類、結(jié)構(gòu)的動態(tài)變化, 對于評估有害藻華暴發(fā)海域PSTs毒素污染的危害性至關(guān)重要。

2 PSTs的化學(xué)結(jié)構(gòu)與相互轉(zhuǎn)化

PSTs毒素是一類四氫嘌呤的衍生物, 其結(jié)構(gòu)上的4個位點(R1-R4)可以發(fā)生乙酰化、磺?；?、羥基化、氨甲酰化等多種取代反應(yīng)(見圖1)。

根據(jù)R4基團的不同可以將常見的PSTs毒素分為4類: 1) 氨基甲酸酯類毒素(carbamate toxins), 包括STX、新石房蛤毒素(neosaxitoxin, neoSTX)和膝溝藻毒素1-4(gonyautoxin 1-4, GTX1-4); 2) 脫氨甲?；惗舅?decarbamoyl toxins), 包括脫氨甲?；扛蚨舅?decarbamoyl saxitoxin, dcSTX)、脫氨甲?；率扛蚨舅?decarbamoyl neosaxitoxin, dcneoSTX)和脫氨甲?；显宥舅?-4(decarbamoyl gonyautoxin 1-4, dcGTX1-4); 3) N-磺酰氨甲?；惗舅?N-sulfocarbamoyl toxins), 包括膝溝藻毒素5-6(gon-yautoxin 5-6, GTX5-6)和N-磺酰氨甲酰基膝溝藻毒素1-4(N-sulfocarbamoylgonyautoxin 1-4, C1-4); 4)脫氧脫氨甲?；惗舅?deoxydecarbamoyl toxins), 包括脫氧脫氨甲酰基石房蛤毒素(deoxydecarbamoyl saxitoxin, doSTX)和脫氧脫氨甲?；显宥舅?-3 (deoxydecarbamoyl gonyautoxin 2-3, doGTX2-3)(見表1)。

表1 不同種類PSTS的毒性和結(jié)構(gòu)

注: STX: 石房蛤毒素; neoSTX: 新石房蛤毒素; GTX: 膝溝藻毒素; dcSTX: 脫氨甲?；扛蚨舅? dcneoSTX: 脫氨甲酰基新石房蛤毒素; dcGTX: 脫氨甲?；显宥舅? C, N-磺酰氨甲?；显宥舅? doSTX: 脫氧脫氨甲?；扛蚨舅? doGTX: 脫氧脫氨甲?；显宥舅?/p>

取代基的差異導(dǎo)致不同種毒素的毒性水平呈現(xiàn)出多樣化[22-23]。其中, 氨基甲酸酯類毒素具有較高的毒性, STX和neoSTX的毒性最高; N-磺酰氨甲酰基類毒素, 包括GTX5-6和C1-4, 毒性最低。

多項研究表明, 有毒藻和以其為食的貝類生物兩者體內(nèi)PSTs的組成及其相對含量有所差異。比如Kwong等研究了暴露于產(chǎn)毒甲藻的貝類體內(nèi)毒素情況, 發(fā)現(xiàn)這些以微藻為食的貝類生物體內(nèi)毒素組分與藻細(xì)胞相似, 但各組分相對含量卻存在較大差異,藻細(xì)胞內(nèi)的PSTs以N－磺酰氨甲?；惗舅?C1&2)為主, 其含量占PSTs總含量的66.6%, 氨基甲酸酯類毒素(GTX1-4、STX、neoSTX)只占PSTs總含量的33.4%; 而在貝類生物體內(nèi), C1&2毒素相對含量明顯降低, 氨基甲酸酯類毒素(GTX1-4、STX、neoSTX)所占比例升高至53.0%[24]。生物攝食含有毒素的亞歷山大藻后, 其體內(nèi)的酶可促進不同結(jié)構(gòu)、不同種類的PSTs發(fā)生相互轉(zhuǎn)化[25-27]; 學(xué)者還從蟹、貽貝、牡蠣等多種生物體內(nèi)篩選出可促進PSTs相互轉(zhuǎn)化的細(xì)菌[28-30]。也就是說不同結(jié)構(gòu)的PSTs毒素可在生物體內(nèi)某些酶或細(xì)菌的作用下發(fā)生轉(zhuǎn)化, 從而導(dǎo)致產(chǎn)毒藻和以其為食的其他海洋生物兩者體內(nèi)PSTs的含量和組成有較大差異。另外, 部分研究表明在某些不存在酶或細(xì)菌的條件下, PSTs基團也可以發(fā)生改變從而導(dǎo)致不同結(jié)構(gòu)PSTs之間發(fā)生相互轉(zhuǎn)化, 且其轉(zhuǎn)化速率受到pH和溫度的影響, 這說明PSTs之間的轉(zhuǎn)化還包括一些不依賴于酶或細(xì)菌即可發(fā)生的化學(xué)過程[31]。

總結(jié)前人的研究結(jié)果, 不同結(jié)構(gòu)PSTs之間的轉(zhuǎn)化方式主要包括以下幾種(見圖2)。

注: STX: 石房蛤毒素; neoSTX: 新石房蛤毒素; GTX: 膝溝藻毒素; dcSTX: 脫氨甲?；扛蚨舅? dcGTX: 脫氨甲酰基膝溝藻毒素; C: N-磺酰氨甲?；显宥舅?/p>

1) N－磺酰氨甲酰基類毒素可以脫掉21位N原子上的磺酸基, 生成相應(yīng)的氨基甲酸酯類毒素, 如: C1→GTX2, C2→GTX3, GTX5→STX等[32-33]。該反應(yīng)除在貝類組織內(nèi)發(fā)生外, 在沒有酶或細(xì)菌的水體中也可發(fā)生, 轉(zhuǎn)化速率隨著溫度和pH的升高而加快[31]。由于氨基甲酸酯類毒素的毒性遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于N－磺酰氨甲?；惗舅? 這一轉(zhuǎn)化將使PSTs的總毒性升高4～10倍[34]。

另外, N－磺酰氨甲酰基類毒素也可以脫掉磺酰氨甲?；D(zhuǎn)化為相應(yīng)的脫氨甲?；惗舅? 如: C1→dcGTX2, C2→dcGTX3, GTX5→dcSTX等。這類轉(zhuǎn)化一般只發(fā)生于某些貝類的組織中[25]。

2) 在某些可利用PSTs作為碳源的細(xì)菌作用下, 氨基甲酸酯類毒素可以脫掉氨基甲?；鶊F, 生成對應(yīng)的脫氨甲?；惗舅? 如: GTX2&3→dcGTX2&3等。這一轉(zhuǎn)化導(dǎo)致PSTs的毒性降低, 常常發(fā)生于貝類生物體內(nèi)[30]。

3) 氨基甲酸酯類毒素可以在磺基轉(zhuǎn)移酶(sulfo-transferase)的作用下發(fā)生磺化反應(yīng), 一分子磺酸基團被轉(zhuǎn)移到21位N原子上, 生成毒性相應(yīng)較低的N-磺酰氨甲?；惗舅? 如GTX2→C1, GTX3→C2, STX→GTX5 等[35]。這一類轉(zhuǎn)化可在亞歷山大藻細(xì)胞內(nèi)大量發(fā)生, 被認(rèn)為是C類毒素的合成路徑。

4) 11位C原子上的R2、R3基團可發(fā)生空間異構(gòu)化。PSTs在有毒藻和貝類體內(nèi)可以發(fā)生由不穩(wěn)定的β異構(gòu)體向穩(wěn)定的α異構(gòu)體的轉(zhuǎn)化, 如C2→C1, GTX3→GTX2, GTX4→GTX1等[24], 最終兩種異構(gòu)體的比例一般約為α∶β=3∶1[25]?？梢岳眠@一比例來判斷貝類生物染毒時間的長短; 此外, Jones 等利用藻細(xì)胞毒素提取物, 配置成pH=7的毒素溶液在25 ℃下進行了孵育實驗, 90 d后α、β異構(gòu)體的比例由0.8增長至2.0[31], 也即PSTs在水體中也可發(fā)生由β異構(gòu)體向α異構(gòu)體的轉(zhuǎn)化。

5) 在sp、sp等某些細(xì)菌的作用下, PSTs毒素1位N原子上發(fā)生脫羥基過程, 11位C原子上的硫酸酯基團也可以被消除, 完成毒素之間的轉(zhuǎn)化, 如GTX1→GTX2, GTX4→GTX3, C1&2→GTX5, neoSTX→STX, GTX1-4→STX、neoSTX等[28-30, 36-37], 這一轉(zhuǎn)化在厭氧環(huán)境中具有更高的轉(zhuǎn)化速率。貝類中的一些天然還原劑, 如谷胱甘肽和半胱氨酸, 也可以介導(dǎo)該還原性反應(yīng)[33]。研究發(fā)現(xiàn)在改性粘土去除有毒藻的過程中, 沉積物-海水環(huán)境中也會發(fā)生高毒性組分GTX1&4向低毒性組分GTX2&3的轉(zhuǎn)化[38]。

另外, 氯化處理和臭氧處理能夠有效促進水體中的PSTs轉(zhuǎn)化為無毒性的物質(zhì)[40-42], 其機理是促進PSTs的氧化降解, 這一原理被廣泛應(yīng)用于水源受PSTs污染的飲用水處理中。

3 PSTs的生物合成

關(guān)于甲藻中PSTs合成轉(zhuǎn)化途徑, 主要存在兩種學(xué)術(shù)觀點: 一種是Sako等提出的“STX-GTX-C”合成路線, 即在甲藻細(xì)胞中首先由前體物合成STX, 在磺基轉(zhuǎn)移酶的作用下轉(zhuǎn)化GTX2&3, 并進一步轉(zhuǎn)化生成C1&2毒素[43]; 另一種是Taroncher-Oldenburg等提出的“C-GTX-STX”合成路線, 即甲藻細(xì)胞中前體物首先構(gòu)建C1&2毒素, 并在酶的作用下轉(zhuǎn)化生成GTX2&3, GTX2&3進一步發(fā)生酶促反應(yīng)轉(zhuǎn)化為STX[6]。近年來, 隨著基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)的迅速發(fā)展, 學(xué)者們發(fā)現(xiàn)了藻細(xì)胞中與PSTs生物合成相關(guān)的基因簇, 并對由基因編碼的多種酶的功能進行了推定, 從分子水平上佐證了甲藻細(xì)胞中“STX- GTX-C”合成轉(zhuǎn)化路線的存在。

3.1 STX-GTX-C生物合成途徑

Shimizu利用同位素標(biāo)記前體物進行產(chǎn)毒甲藻的培養(yǎng)實驗, 提出了精氨酸、乙酸鹽與甲硫氨酸作合成前體的推測, 首次提出了STX生物合成路線[44]。STX在一系列修飾酶的作用下, 通過轉(zhuǎn)移羥基、氨基甲酰、磺酰等基團, 轉(zhuǎn)化為其他PSTs毒素。Shimizu等還提出了一個可能的關(guān)鍵步驟: PSTs的骨架是由一個乙酸單元或衍生物與精氨酸或其前體在α碳上經(jīng)過克萊森縮合反應(yīng)形成的[45]。

Yoshida等在鏈狀亞歷山大藻()中分離純化到一種硫轉(zhuǎn)運酶(sulfotransferase, ST), 該酶通過催化磺酸化過程, 將STX轉(zhuǎn)化為GTX5, 將GTX2&3轉(zhuǎn)化為C1&2[46]。Sako 等在一種裸甲藻()中報道了兩種硫轉(zhuǎn)運酶: N-ST和O-ST。N-ST可以將STX轉(zhuǎn)化為GTX5, GTX2&3轉(zhuǎn)化為C1&2; O-ST可以將11-α, β羥基石房蛤毒素轉(zhuǎn)化為GTX2&3[43]。同時, Sako等在研究中發(fā)現(xiàn),藻細(xì)胞中C1&2毒素約占毒素總含量的65%, GTX5和GTX1&4分別占毒素總含量的25%和10%, 而未檢測到STX、neoSTX、11-α, β羥基石房蛤毒素的存在, 由此推測硫轉(zhuǎn)運酶將大量其他毒素轉(zhuǎn)化為C毒素。Sako等在此基礎(chǔ)上提出了毒素的生物合成與轉(zhuǎn)化途徑: 前體物首先合成STX, STX的11位C原子上發(fā)生氧化反應(yīng)生成11-α, β羥基石房蛤毒素, 并在O-ST的作用下轉(zhuǎn)化為GTX2&3, 而后經(jīng)過N-ST的催化以PAPS為磺基供體發(fā)生磺酸化反應(yīng)生成C1&2; 或者STX在N-ST的作用下直接發(fā)生磺酸化反應(yīng)轉(zhuǎn)化為GTX5[43]。

然而在上述對于PSTs合成轉(zhuǎn)化途徑的推測中, 未能對毒素合成的直接前體物、參與毒素合成轉(zhuǎn)化的基因和功能酶等進行系統(tǒng)的闡述, 因此該PSTs的生物合成轉(zhuǎn)化途徑未能形成定論。而在此前, Taroncher- Oldenburg等通過研究細(xì)胞周期不同階段的產(chǎn)毒情況, 提出了與之相反的“C-GTX-STX”合成轉(zhuǎn)化路線[6], 難以判定這兩種途徑哪一種更接近實際情況。直到近年來, 學(xué)者們發(fā)現(xiàn)了藻細(xì)胞中與PSTs生物合成與轉(zhuǎn)化相關(guān)的基因簇和多種功能酶, 為藻細(xì)胞中STX-GTX-C合成轉(zhuǎn)化途徑的存在提供了直接證據(jù)。

3.2 與PSTs合成相關(guān)的基因和蛋白質(zhì)

隨著基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)的迅速發(fā)展, 對于PSTs合成機制的研究逐漸深入到基因和蛋白質(zhì)的水平, 為研究PSTs的生物合成轉(zhuǎn)化途徑提供了新的證據(jù)。

與藍(lán)藻相比, 甲藻的基因組更為龐大, 基因調(diào)控更為復(fù)雜, 因此PSTs生物合成分子水平的研究在藍(lán)藻中起步較早。2008年, Kellmann等率先在藍(lán)藻T3中發(fā)現(xiàn)了用于STX生物合成的基因簇, 提出了由功能酶系催化的 PSTs 生物合成途徑[47], 為闡明甲藻中PSTs的產(chǎn)生機制和生物合成途徑奠定了基石。在該合成途徑中, 首先在的參與下, 精氨酸與乙酰基發(fā)生克萊森縮合反應(yīng), 產(chǎn)生中間產(chǎn)物 A; 然后編碼脒基轉(zhuǎn)移酶, 將另一分子精氨酸的脒基轉(zhuǎn)移到上述產(chǎn)物A上, 得到中間產(chǎn)物B; 新產(chǎn)物B經(jīng)過由編碼的胞嘧啶核苷脫氨酶的作用, 形成含有雜環(huán)的化合物C; 隨后在編碼的甾醇脫飽和酶類作用下, 產(chǎn)物C末端兩個碳原子間形成雙鍵, 然后編碼產(chǎn)生酮戊二酸依賴的雙加氧酶, 在其催化下雙鍵兩端的碳原子發(fā)生環(huán)氧化反應(yīng)形成環(huán)氧基團, 該環(huán)氧基團在上述酶作用下繼而形成醛基。經(jīng)過所編碼的乙醛還原酶的作用, 醛基被還原為羥基, 至此完成PSTs基本骨架的構(gòu)建。隨后在編碼的末端加氧酶、編碼的O-氨甲酰轉(zhuǎn)移酶等酶的催化下發(fā)生一系列反應(yīng), 形成目標(biāo)產(chǎn)物STX。在此基礎(chǔ)上, 產(chǎn)物STX在、、、等多種基因的參與下發(fā)生一系列反應(yīng), 完成向neoSTX、GTX2&3等多種PSTs的轉(zhuǎn)化。

隨后基因簇在其他幾種合成PSTs的藍(lán)藻中相繼被鑒定出來[48-50], 這種PSTs的合成路線得到了廣泛認(rèn)可與接受, 但針對甲藻中PSTs產(chǎn)生機制與合成途徑的研究, 受限于甲藻龐大的基因組和較高的基因拷貝數(shù), 目前仍然處于起步階段。

2011年, Stüken等發(fā)現(xiàn)了甲藻中第一個與PSTs合成相關(guān)的基因——, 驗證了STX生物合成途徑在甲藻中的存在[51]。同時發(fā)現(xiàn)中存在的長短兩種轉(zhuǎn)錄本, 長轉(zhuǎn)錄本與藍(lán)藻一樣包含全部功能位點(: 活性腺苷甲硫氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶;: 乙?；D(zhuǎn)移酶;: 乙?；d體蛋白;: 氨基轉(zhuǎn)移酶), 而短轉(zhuǎn)錄本只包含的功能位點; 通過對產(chǎn)毒甲藻和無毒甲藻進行比較, 發(fā)現(xiàn)和與甲藻中PSTs毒素的合成密切相關(guān)[51]。另一個與PSTs合成相關(guān)的基因——也在甲藻中被成功鑒定出來[52]。值得注意的是在一些無毒甲藻中也存在, 因此推測在細(xì)胞內(nèi)除了參與毒素合成外可能還參與其他一些生物學(xué)過程。隨后, Hackett等在中鑒定出多種與PSTs合成相關(guān)的基因, 如直接參與STX合成的基因、、、、、, 參與STX向其他結(jié)構(gòu)PSTs轉(zhuǎn)化的基因, 如、、, 以及PSTs轉(zhuǎn)運相關(guān)的基因等[53]。Zhang等在針對及其無毒突變體的研究中, 成功鑒定到與PSTs轉(zhuǎn)化相關(guān)的基因和PSTs合成的調(diào)控基因, 為更清晰的認(rèn)識甲藻中PSTs的合成路徑做了進一步的補充與完善[54](見圖3)。

目前, 關(guān)于產(chǎn)毒甲藻中PSTs合成機制的研究在基因水平已取得了較大進展, 但PSTs合成過程中直接發(fā)揮作用的是其翻譯后的蛋白質(zhì), 且細(xì)胞內(nèi)包括毒素合成在內(nèi)的許多生理生化過程是由轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的。因此, 蛋白質(zhì)水平的研究對揭示細(xì)胞中PSTs的合成機制具有更為直接的意義。

學(xué)者利用2-DE技術(shù)對比研究了亞歷山大藻產(chǎn)毒株和不產(chǎn)毒株, 鑒定到毒素指示蛋白——T1, 然而這一蛋白在毒素合成中的具體功能和作用尚不清晰[55-56]。Wang等對比了亞歷山大藻產(chǎn)毒株和不產(chǎn)毒株的蛋白質(zhì)特征, 發(fā)現(xiàn)與產(chǎn)毒株相比有34種蛋白質(zhì)在不產(chǎn)毒株表現(xiàn)為下調(diào), 56種蛋白質(zhì)表現(xiàn)為上調(diào); 在這些差異表達(dá)蛋白中有多個可能與毒素合成直接相關(guān), 如表達(dá)的聚酮合酶(polyketide synthase)、表達(dá)的組氨酸激酶(histidine kinase)以及表達(dá)的分子伴侶類似蛋白(chaperone-like protein)等蛋白質(zhì)在不產(chǎn)毒株中的表達(dá)被顯著抑制[57]。另外, Wang等通過比較不同時期產(chǎn)毒亞歷山大藻的蛋白質(zhì)組,篩選出了9個可能與甲藻PSTs合成相關(guān)的蛋白質(zhì), 分別為: 甲硫氨酸S-腺苷轉(zhuǎn)移酶(methionine S-adenosyltransferase, MAT)、S-腺苷高半胱氨酸酶(S-adenosylhomocysteinase, SAH)、腺苷高半胱氨酸酶(adenosylhomocysteinase, AdoHcy)、無機焦磷酸酶(inorganic pyrophosphatase, PPi)、鳥氨酸氨甲酰基轉(zhuǎn)移酶(ornithine carbamoyltransferase, OTC)、磺基轉(zhuǎn)移酶(sulfotransferase, SULT)、醇脫氫酶(alcohol dehydrogenase, ADH)、鐵氧還蛋白-NADP+還原酶(ferredoxin-NADP+reductase, FNR)、精氨酸脫亞胺酶(arginine deiminase, ADI)[58]。

然而, 盡管蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的發(fā)展為甲藻PSTs合成途徑的研究提供了更為直接的工具, 但這些產(chǎn)毒相關(guān)蛋白質(zhì)與基因的關(guān)系及它們在PSTs合成中的具體功能及作用尚待確定, 甲藻PSTs合成的具體途徑仍待進一步完善。

4 影響PSTs合成的環(huán)境調(diào)控因素

甲藻PSTs的生物合成過程會受到溫度、營養(yǎng)鹽、光照等多種外界環(huán)境因素的影響, 環(huán)境條件的改變會引起藻細(xì)胞毒素的組成和含量發(fā)生不同程度的變化。目前受限于對PSTs生物合成機制的了解不足, 對于環(huán)境因素對藻細(xì)胞毒素合成的影響, 雖然國內(nèi)外有較多的報道, 但在具體的調(diào)控機制方面尚需進一步研究。

4.1 溫度對PSTs合成的影響

許多研究考察了溫度對PSTs生物合成的影響。如Anderson等對比了在8 ℃和15 ℃下的生長情況和毒素含量, 發(fā)現(xiàn)在8 ℃下細(xì)胞內(nèi)毒素含量、精氨酸含量均顯著升高, 且毒素含量與精氨酸含量隨著時間呈現(xiàn)出相反的變化趨勢[59]。因此, 推測低溫一方面可能通過抑制藻細(xì)胞蛋白質(zhì)合成, 使細(xì)胞內(nèi)積累了大量精氨酸, 而大量精氨酸的積累可能促進藻細(xì)胞毒素的合成; 另一方面低溫降低了藻細(xì)胞分裂速率, 細(xì)胞在生長周期中有更長的時間用于毒素的合成, 有利于藻細(xì)胞內(nèi)毒素的積累[59]。然而, Hwang等對不同溫度下的生長和產(chǎn)毒情況進行了研究, 發(fā)現(xiàn)在25 ℃生長的藻細(xì)胞總毒素含量和單細(xì)胞毒力水平均遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于10 ℃和30 ℃下生長的微藻, 有關(guān)作用機制尚不清楚[60]。

注: 紅色實線框表示基因編碼的催化酶或結(jié)構(gòu)域; 黑色球形表示PSTs組分; SAM: S-腺苷甲硫氨酸; SAH: S-腺苷高半胱氨酸; arginine: 精氨酸; ornitine: 鳥氨酸; adenylylsulfate: 腺苷酰硫酸; PAPS: 3’-磷酸腺苷-5’-磷酰硫酸; STX: 石房蛤毒素; GTX: 膝溝藻毒素; dcSTX: 脫氨甲?；扛蚨舅? C: N-磺酰氨甲?；显宥舅?/p>

此后, 多項研究結(jié)果也均表明產(chǎn)毒亞歷山大藻在某一適當(dāng)溫度條件下會產(chǎn)生大量PSTs, 過高或過低的溫度條件均會導(dǎo)致毒素含量的降低[61-62]。溫度對藻細(xì)胞產(chǎn)毒的影響, 可能是因為過高或過低的溫度會影響產(chǎn)毒藻的生長及體內(nèi)的產(chǎn)毒酶促反應(yīng), 從而引起產(chǎn)毒的變化。

4.2 氮對PSTs合成的影響

從PSTs的化學(xué)結(jié)構(gòu)可以看出, N是構(gòu)成PSTs的主要元素, 占其分子量的30%。充足的N有利于藻細(xì)胞積累大量精氨酸, 作為毒素合成的前體物, 有利于藻細(xì)胞毒素的合成; 而N限制時, 轉(zhuǎn)運蛋白和酶等富含氮的細(xì)胞化合物的合成減少, 藻細(xì)胞內(nèi)的精氨酸含量也大量減少, 這些精氨酸主要被藻細(xì)胞的生長等代謝活動所利用, 無法參與毒素的合成, 因此氮限制將同時減少藻細(xì)胞分裂和毒素的合成。

多項研究結(jié)果表明, 隨著N濃度的升高, 亞歷山大藻單位細(xì)胞毒素含量升高[63-65]。Anderson等指出與氮限制的培養(yǎng)環(huán)境相比, 在氮營養(yǎng)鹽充足時,藻細(xì)胞密度和單位細(xì)胞的毒素含量明顯升高[59]。Leong等的研究也發(fā)現(xiàn), 隨著硝酸鹽濃度從6 μmol/L增加到100 μmol/L,的單細(xì)胞毒素含量也隨之增加[65]。Waal等分別在氮限制和營養(yǎng)鹽充足的環(huán)境對進行了培養(yǎng), 結(jié)果表明, 氮限制環(huán)境下生長的微藻毒素含量與氨基酸的含量均明顯低于對照組, 且PSTs含量與細(xì)胞N∶P比值、細(xì)胞精氨酸含量均有很好的相關(guān)性, 因此PSTs的合成與細(xì)胞內(nèi)的氨基酸含量尤其是精氨酸的含量密切相關(guān), 而精氨酸的合成依賴于氮的同化[66]。

另外, 研究表明銨鹽和硝酸鹽這兩種不同類型的N營養(yǎng)鹽對亞歷山大藻產(chǎn)生PSTs的影響有一定差異[67-68]。以銨鹽為氮源的亞歷山大藻的毒素含量要明顯高于以硝酸鹽為氮源, 這可能是因為在硝酸鹽下生長的藻細(xì)胞, 其胞內(nèi)毒素合成對于N的利用還要受到硝酸還原酶的限制。但以銨鹽為氮源培養(yǎng)的藻細(xì)胞內(nèi), 氮含量與毒素含量無明顯關(guān)系, 而以硝酸鹽為氮源培養(yǎng)的藻細(xì)胞內(nèi), 氮含量與毒素含量成明顯正相關(guān)關(guān)系, 毒素生物合成速率受硝酸鹽還原速率的限制。

4.3 磷對PSTs合成的影響

磷營養(yǎng)鹽在甲藻細(xì)胞代謝和生長中起著重要的作用, 充足的磷有利于促進藻細(xì)胞分裂和生長。環(huán)境中的磷濃度也可間接影響藻類PSTs毒素合成, 很多研究表明, 藻細(xì)胞內(nèi)毒素含量隨著環(huán)境中磷含量的升高而降低, 磷限制可以導(dǎo)致亞歷山大藻細(xì)胞內(nèi)毒素含量顯著增加[69-71]。因為磷含量的升高會導(dǎo)致細(xì)胞N∶P比率暫時下降, 當(dāng)環(huán)境中磷含量較高時, 細(xì)胞可能會將大多數(shù)氮優(yōu)先分配給含磷化合物的合成, 因此, 可以用于PSTs合成的N減少, 從而導(dǎo)致在磷充足的條件下藻細(xì)胞內(nèi)毒素含量降低這一現(xiàn)象的出現(xiàn)。

而當(dāng)環(huán)境中磷限制時, 藻細(xì)胞的分裂活動減慢或停止, 藻細(xì)胞內(nèi)會出現(xiàn)大量氮過剩的現(xiàn)象, 毒素的合成過程在氮源充足的情況仍可繼續(xù)進行, 合成的毒素在細(xì)胞內(nèi)持續(xù)積累, 從而導(dǎo)致磷限制時細(xì)胞內(nèi)的毒素含量顯著升高。另外, 研究發(fā)現(xiàn), 在磷限制的環(huán)境條件下, 藻細(xì)胞內(nèi)過剩的氮主要以銨鹽的形式存在。過量的銨鹽積累對藻細(xì)胞自身造成毒害作用, 藻細(xì)胞為了緩解對自身的毒害作用, 會激活精氨酸的合成[72]。而精氨酸是PSTs生物合成的重要前體物質(zhì), 這也是導(dǎo)致在磷限制環(huán)境條件下藻細(xì)胞內(nèi)毒素含量升高的原因之一。

4.4 其他因素對PSTs合成的影響

多項研究表明, 藻細(xì)胞毒素含量與光照強度呈現(xiàn)出正相關(guān)關(guān)系[60-61, 73-74], 足夠的光照對于甲藻細(xì)胞內(nèi)PSTs的合成至關(guān)重要。Hwang等通過研究不同光照條件下的產(chǎn)毒情況, 發(fā)現(xiàn)在240 μE?m–2?s–1光照強度下, 單細(xì)胞毒素含量明顯高于120 μE?m–2?s–1下單細(xì)胞毒素含量[60]。這是因為很多甲藻作為光合自養(yǎng)生物, 毒素及其前體物質(zhì)的合成需要足夠的光照為其提供能量[73]。

另外, 還有研究表明, 秋水仙素能夠抑制亞歷山大藻細(xì)胞分裂和PSTs產(chǎn)生, 但其分子機理尚不清楚。Zhang等利用iTRAQ技術(shù)進一步研究秋水仙素處理后藻細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)組的變化, 結(jié)果同樣表明, 經(jīng)過秋水仙素處理的藻細(xì)胞內(nèi)毒素含量明顯低于對照組毒素含量, 且細(xì)胞內(nèi)多種蛋白質(zhì)發(fā)生差異表達(dá)[75]。然而, 有趣的是經(jīng)秋水仙素處理的藻細(xì)胞內(nèi)與毒素合成有關(guān)的蛋白質(zhì)表達(dá)量與空白組相比無明顯差異, 這說明毒素的合成可能受到翻譯后調(diào)控[75]。

5 結(jié)語與展望

PSTs毒素在海洋中分布廣、危害大, 對海洋生物乃至人類健康與安全構(gòu)成了嚴(yán)重威脅, 其毒性大小隨種類和結(jié)構(gòu)的不同有較大差異。不同結(jié)構(gòu)PSTs毒素在一定條件下可以發(fā)生相互轉(zhuǎn)化, 了解產(chǎn)毒藻和其他海洋生物體內(nèi)PSTs種類、結(jié)構(gòu)的動態(tài)變化, 對于評估有害藻華暴發(fā)海域PSTs毒素污染的危害性至關(guān)重要。另外, 甲藻中PSTs毒素的生物合成是一個非常復(fù)雜的過程, 受到環(huán)境脅迫、基因調(diào)控等多種外界因素和內(nèi)在因素的共同作用, 目前對于藻細(xì)胞產(chǎn)毒的生物合成途徑、遺傳學(xué)特征及其環(huán)境調(diào)控機理等研究仍處于起步階段。深入了解PSTs合成機制及其影響因素, 將為有害藻華的監(jiān)測與防治提供新思路, 對減少有害藻華的危害、保障人類健康和海洋生態(tài)安全具有重要意義。

總結(jié)已有研究成果, PSTs毒素還存在以下值得深入研究的方面:

1) PSTs毒素帶有正電荷的胍基基團可以與電壓門控Na+通道的羧基基團相互作用, 阻斷鈉離子通過神經(jīng)細(xì)胞膜, 進而阻斷神經(jīng)傳導(dǎo), 理論上具有麻醉、鎮(zhèn)痛的作用, 是一種具有醫(yī)學(xué)應(yīng)用潛力的鈉離子通道阻斷劑。在今后的研究中可以此特性為出發(fā)點, 深入挖掘其醫(yī)用價值。

2) 近年來針對PSTs生物合成途徑的研究已取得了一些進展, 發(fā)現(xiàn)了與毒素合成相關(guān)的部分基因, 但仍需要進一步研究與探討, 譬如這些基因在毒素合成過程中的具體功能和作用, 毒素的生物合成在分子水平上是如何運作的, 環(huán)境因素影響毒素合成的分子機理等, 這些問題需要進一步完善。

3) PSTs合成過程中直接發(fā)揮作用的是其翻譯后的蛋白質(zhì)。因此, 蛋白質(zhì)水平的研究對揭示細(xì)胞中PSTs的合成機制具有更為直接的意義。目前已經(jīng)鑒定出部分產(chǎn)毒相關(guān)的蛋白質(zhì), 但這些蛋白質(zhì)與基因的關(guān)系及它們在PSTs合成中的具體功能及作用尚待確定, 甲藻PSTs合成的具體途徑仍待完善。

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Research progress on the biosynthesis, transformation, and factors affecting paralytic shellfish toxins in the ocean

SONG Wei-jia1, 2, 3, 4, SONG Xiu-xian1, 2, 3, 4, YU Zhi-ming1, 2, 3, 4, LI Jing1, 2, 3,ZHANG Yue1, 2, 3

(1. Key Laboratory of Marine Ecology and Environmental Sciences, Institute of Oceanology, Chinese Academy of Sciences, Qingdao 266071, China; 2. Laboratory of Marine Ecology and Environmental Science, Pilot National Laboratory for Marine Science and Technology (Qingdao), Qingdao 266237, China; 3. Center for Ocean Mega-Science, Chinese Academy of Sciences, Qingdao 266071, China; 4. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China)

Paralytic shellfish toxins (PSTs) are highly toxic neurotoxins produced by dinoflagellates. They are widely distributed in the marine environment and can cause great harm to aquaculture animals and human health. The toxicity of PSTs varies greatly with type and structure. Many studies have been conducted on the source, distribution, transformation, biosynthesis and factors influencing paralytic shellfish toxins. However, studies on the environmental regulatory mechanism, the biosynthetic pathway, and the genetic characteristics of toxin production are still rare. The biosynthesis of PSTs is affected by many environmental factors, such as light, temperature, and nutrients. A change in environmental conditions will change the composition and content of the toxins to varying degrees. Some researchers have used genomics and proteomics techniques to screen and identify genes or proteins related to the biosynthesis of toxins in. It is important to understand the biosynthetic pathway oftoxins more clearly. Based on the toxin-producing physiology of, this study summarizes the biosynthesis and transformation of the PSTs inand the main factors affecting synthesis to provide new ideas for preventing and controlling harmful algal blooms, reducing the damage of harmful algal blooms, and ensuring human health and marine ecological security.

dinoflagellates; paralytic shellfish toxins; biosynthesis; environmental factors

Oct. 1, 2020

Q-1

A

1000-3096(2022)09-0117-13

10.11759/hykx20201001001

2020-10-01;

2020-11-28

國家自然科學(xué)基金項目(41976148); 山東省重大科技創(chuàng)新工程項目(2019JZZY010808); 2019年度“泰山學(xué)者攀登計劃”(泰山學(xué)者工程專項經(jīng)費資助)

[The National Natural Science Foundation of China, No. 41976148; the Key R&D Project of Shandong Province, No. 2019JZZY010808; The Taishan Scholars Climbing Program of Shandong Province of the Year 2019]

宋維佳(1997—), 女, 山東日照人, 碩士研究生, 主要從事海洋生態(tài)學(xué)研究, 電話: 0532-82898985, E-mail: songwj178@163.com; 宋秀賢,通信作者, 電話: 0532-82898587, E-mail: songxx@qdio.ac.cn

(本文編輯: 楊 悅)