劉璐，郭玉瑩，楊惠林，徐士欣*

（1.天津市濱海新區(qū)中醫(yī)醫(yī)院（暨天津中醫(yī)藥大學(xué)第四附屬醫(yī)院）,天津 300451；2.天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院,天津 300112；3.周口市第二人民醫(yī)院，河南 周口 466000）

0 引言

中風(fēng)是世界范圍內(nèi)造成死亡和長(zhǎng)期殘疾的主要原因之一，其中缺血性腦卒中約80%[1-2]。組織纖溶酶原激活劑 (tPA)治療中風(fēng)的最佳時(shí)間窗為3-4.5h，只有少部分患者從中受益，同時(shí)因其增加了腦出血的風(fēng)險(xiǎn)，臨床尚未廣泛使用。腦特定區(qū)域短暫或永久的缺血和缺氧會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡和死亡，導(dǎo)致局部腦損傷和功能缺陷。針對(duì)中風(fēng)后神經(jīng)損傷修復(fù)，目前臨床仍然缺乏安全、高效的治療方法。

間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)已成為改善中風(fēng)恢復(fù)的重要途徑[3]。研究表明，從骨髓和脂肪組織中獲得的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）可促進(jìn)大鼠腦卒中模型的功能恢復(fù)和神經(jīng)再生[4-5]。干細(xì)胞主要通過(guò)旁分泌的功能發(fā)揮治療作用，其中外泌體是細(xì)胞發(fā)揮旁分泌作用的關(guān)鍵載體[6]。外泌體具有穿過(guò)血腦屏障[7]，低免疫原性[8]，半衰期長(zhǎng)等優(yōu)點(diǎn)[9]，可將囊泡內(nèi)物質(zhì)轉(zhuǎn)移到靶細(xì)胞，從而介導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞間信息交流和調(diào)節(jié)生命活動(dòng)[10]。研究表明[11-13]，MSCs生成的外泌體可以通過(guò)促進(jìn)神經(jīng)重塑以提高中風(fēng)的恢復(fù)過(guò)程。

miR-17-92 基因簇是脊椎動(dòng)物的一個(gè)保守miRNA基因簇，在細(xì)胞增殖、分化、凋亡及發(fā)育等多種生物學(xué)過(guò)程中起重要的調(diào)控作用。在小鼠大腦皮層發(fā)育過(guò)程中，miR17-92 簇通過(guò)抑制下游靶基因 PTEN 的表達(dá)可調(diào)節(jié)皮層中神經(jīng)干細(xì)胞增殖及分化形成中間祖細(xì)胞[14]。PTEN 是具有雙特異磷酸酶活性的重要抑癌基因，通過(guò)其脂質(zhì)磷酸酶活性作用于下游 PI3K的下游靶分子 PIP3，從而使 PIP3 脫磷酸化生成 PIP2 阻斷 AKT 及其下游激酶的活性。本研究轉(zhuǎn)染miR17-92的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體與缺氧損傷的神經(jīng)元共培養(yǎng)，探討其是否可以負(fù)調(diào)控PTEN表達(dá)促進(jìn)軸突生長(zhǎng)及其可能的作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及細(xì)胞

健康4 周雄性清潔級(jí)S D 大鼠，體重在140～160 g；健康雌性SD大鼠，孕16d，以上均購(gòu)自北京華阜康生物科技股份有限公司，許可證號(hào)：SCXK（京）2014-0004；原代皮質(zhì)神經(jīng)元，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（Bone Mesenchymal stem cells,BMSCs）。

1.1.2 主要試劑

B27、Neurobasal-A 神經(jīng)元培養(yǎng)基（Gibco公司），胎牛血清（以色列 BI 公司），免疫染色封閉液（上海碧云天科技有限公司，批號(hào)：P0260），MAP2、DAPI、DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基（上海碧云天科技有限公司），0.25%胰蛋白酶、多聚賴(lài)氨酸（北京索萊寶科技有限公司），Tublin（北京博奧森科技有限公司），青霉素及鏈霉素混合液美國(guó)，D-Hanks平衡鹽溶液（北京索萊寶科技有限公司），CD90.1-PE(美天旎，批號(hào)：130-112-873)、CD29-APC(美天旎，批號(hào)：130-119-166)、CD31-VioBright FITC(美天旎，批號(hào)：130-105-938)、CD45-PerCP-Vio700(美天旎，批號(hào)：130-107-846)、REA control-PE(美天旎，批號(hào)：130-113-450)、REA control-APC(美天旎，批號(hào)：130-113-446)、REA control-VioBright FITC(美天旎，批號(hào)：130-113-455)、REA-control-PerCP-Vio700(美天旎，批號(hào)：130-113-453)、mimics（蘇州吉瑪基因股份有限公司）、PTEN(美國(guó)abcam公司，批號(hào)：ab32199)、PI3K（美國(guó)abcam公司，批號(hào)：ab86714）、p-PI3K（美國(guó)abcam公司，批號(hào)：ab182651）、AKT（美國(guó)abcam公司，批號(hào)：ab8805）、p-AKT（美國(guó)abcam公司，批號(hào)：ab38449、mTOR（美國(guó)abcam公司，批號(hào)：20657-1AP）、p-mTOR（美國(guó)abcam公司，批號(hào)：#5336）。

1.1.3 主要儀器

倒置熒光相差顯微鏡(DM3000，德國(guó)LEICA 公司)；電子天平(AE100，瑞士METTLER TOLEDO公司)；二氧化碳恒溫孵育箱(Hera cell 150i型，德國(guó)Thermo公司)；超凈工作臺(tái)(DL-CJ-2NDI型，北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司)；多功能酶標(biāo)儀(ThermoVarioskan? LUX，德國(guó)Thermo公司)；低速自動(dòng)平衡離心機(jī)(LDZ5-2，北京醫(yī)用離心機(jī)廠)。

1.2 方法

1.2.1 BMSCs培養(yǎng)及鑒定

脫頸法處死雄性SD大鼠，無(wú)菌操作分離大鼠股骨和后肢脛骨。用1mL注射器吸取適量DMEM培養(yǎng)基，反復(fù)沖洗骨髓腔。收集沖洗液于無(wú)菌培養(yǎng)皿中，使用200目篩網(wǎng)過(guò)濾沖洗液，將過(guò)濾后的細(xì)胞懸液收集于15mL無(wú)菌離心管，在4℃條件下以1000r/min離心10min。棄去上清，用含有10%胎牛血清和1%雙抗的完全培養(yǎng)基重懸沉淀的細(xì)胞，按2×106個(gè)細(xì)胞接種到25cm2培養(yǎng)瓶中置于37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至第 3 代。細(xì)胞離心后棄去上清，留取細(xì)胞沉淀，加入800ulPBS重懸細(xì)胞，流式管各加200μL單細(xì)胞懸液，分別滴加熒光標(biāo)記抗體CD90.1-PE，CD29-APC，CD31-VioBright FITC，CD45-PerCP-Vio700各10μL，室溫下避光孵育30min，加入10g/L多聚甲醛（500 μL）重懸固定，在流式細(xì)胞儀上檢測(cè)陽(yáng)性細(xì)胞構(gòu)成比，根據(jù)多數(shù)文獻(xiàn)報(bào)道表現(xiàn)為 CD90陽(yáng)性而同時(shí)具備CD31陰性的細(xì)胞為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。

1.2.2 原代皮質(zhì)神經(jīng)元的培養(yǎng)及鑒定

頸椎脫位法處死孕鼠，迅速解剖孕鼠腹部取出胎鼠，分離腦組織，將皮質(zhì)剪碎放入盛有0.25%胰蛋白酶消化培養(yǎng)皿中至組織塊拉絲成團(tuán)。加入含10%FBS的DMEM 培養(yǎng)基終止消化，使用200目篩網(wǎng)過(guò)濾細(xì)胞懸液，將濾液在4℃條件下以1000r/min離心5min。棄去上清液，加入含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基吹打均勻細(xì)胞沉淀，以2×105個(gè)/mL接種在提前包被過(guò)L-多聚賴(lài)氨酸的24孔板。置于37℃，5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4h后，換為Neurobasal-A(含2%B27)無(wú)血清培養(yǎng)基，每隔48 h半量換液。于第7d的神經(jīng)元加入4%多聚甲醛，固定細(xì)胞30 min，使用PBS清洗3次。加入免疫染色封閉液，于4℃冰箱中避光靜置30min，使用PBS清洗3遍。加入MAP2（1:100），Tublin3(1:400)，用PBS稀釋兩種抗體混勻，100μL/孔，置于4℃冰箱中避光過(guò)夜。加入Ⅱ抗，100μL/孔，置于4℃冰箱中，避光1h。吸棄Ⅱ抗，每孔加入500μLPBS，清洗3次。加入DAPI（100ng/mL）對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行染色，用甘油對(duì)細(xì)胞爬片進(jìn)行封片，置于熒光顯微鏡下，隨機(jī)取6個(gè)視野，200倍鏡下觀察并拍照分析。

1.2.3 外泌體提取

在4℃的環(huán)境下，將收集的培養(yǎng)上清300g離心10min，2000g離心20min，然后棄沉淀，去除細(xì)胞，將上清轉(zhuǎn)移至新的50mL離心管中。繼續(xù)在4 ℃條件下，10 000g離心30min，棄沉淀，去除亞細(xì)胞成分，將上清轉(zhuǎn)入超速離心管中。4℃條件下，100 000g離心60min，棄上清，所得沉淀即為exosome。使用PBS溶液重新懸浮沉淀物，混勻后再以100000g離心60min，棄上清液，沉淀物即為提純的exosome，將沉淀用400μLPBS重懸，裝入Ep管內(nèi)，4℃保存1-7d，或者用含10%DMSO的PBS重懸置于-80℃冰箱內(nèi)最多保存6個(gè)月。

1.2.4 BMSCs 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及分組

分別將miR-NCmimics、mi R17-92 mimics、anti-miR-NCmimics與anti-miR17-92mimics轉(zhuǎn)染至 BMSCs 中，具體步驟參照轉(zhuǎn)染試劑 Lipofectamine?2000 轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書(shū)操作。

1.2.5 qRT-PCR檢測(cè)各組神經(jīng)元細(xì)胞miR-17-92簇與PTEN靶向關(guān)系

將胎鼠皮質(zhì)神經(jīng)元隨機(jī)為正常組、缺氧模型組（缺氧2h）、缺氧模型組+miR-17-92簇過(guò)表達(dá)外泌體（共培養(yǎng)48h）、缺氧模型組+miR-17-92對(duì)照外泌體、缺氧模型組+miR-17-92簇inhibitor外泌體、缺氧模型組+miR-17-92inhibitor對(duì)照外泌體組。按照 TRIZOL 試劑盒說(shuō)明書(shū)提取各組細(xì)胞總 RNA。Superscript Ⅲ逆轉(zhuǎn)錄酶用于合成cDNA模板。用SYBR ExScriptqPCR試劑盒在以下條件下進(jìn)行：95℃預(yù)變性10min，95℃變性10s，56℃退火30s，在72℃延伸32s，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，95度 10s，65度60s，97度1s，1個(gè)循環(huán)Cooling37度 30 s，1個(gè)循環(huán)。依據(jù)2-ΔΔCt法計(jì)算各樣本相對(duì)表達(dá)量。RT-qPCR引物序列如下：

1.2.6 Western blotting 檢測(cè)蛋白表達(dá)

取各組胎鼠皮質(zhì)神經(jīng)元，RIPA 裂解液提取總蛋白，采用Brad-ford法檢測(cè)蛋白濃度，10%SDS-PAGE 分離蛋白，半干法轉(zhuǎn)移至P V DF膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，加入Cleavedcaspase-3(1∶1 000)、Bax(1∶1 000)一抗與β-actin(1∶3000) 抗體稀釋液在4°C條件下孵育24h，室溫條件下加入二抗稀釋液(1:5000)孵育2h，滴加ECL顯影液，將印跡膜置于凝膠成像系統(tǒng)中曝光顯影，采用 ImageJ軟件分析各條帶灰度值。以待測(cè)蛋白與內(nèi)參照β-actin的灰度值比值作為蛋白的相對(duì)表達(dá)量，灰度值越高，蛋白含量越高。

2 結(jié)果

2.1 BMSC培養(yǎng)、特征鑒定及BMSC-exo提取、鑒定

2.1.1 BMSC培養(yǎng)、特征鑒定

將全骨髓細(xì)胞液懸液接種于培養(yǎng)瓶中，24h可見(jiàn)部分原代細(xì)胞逐漸貼壁。BMSCs核居中，胞體較小，形狀為均和的圓形或者梭形。BMSCs培養(yǎng)10d，細(xì)胞基本融合，可進(jìn)行傳代。BMSCs培養(yǎng)至第3代，可見(jiàn)細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形，細(xì)胞形態(tài)較一致。流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示BMSCs的CD90陽(yáng)性表達(dá)率為98.8%，CD29陽(yáng)性表達(dá)率為 96.7%，因此 CD90和CD29呈陽(yáng)性表達(dá)。而CD31陽(yáng)性表達(dá)率為 0.97%，CD45陽(yáng)性表達(dá)率為1.37%，因此CD31和CD45呈陰性達(dá)。說(shuō)明本試驗(yàn)提取的BMSCs純度較高，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。見(jiàn)圖1。

2.1.2 BMSC-exo鑒定

電子顯微鏡下exsomes雙層脂膜結(jié)構(gòu)，WB檢測(cè)外泌體陽(yáng)性標(biāo)記物-CD63、TSG101，見(jiàn)圖2。

2.2 神經(jīng)元的培養(yǎng)、鑒定

原代皮質(zhì)神經(jīng)元接種4h后貼壁良好，細(xì)胞呈圓形，表面光滑，雜細(xì)胞較多；神經(jīng)元培養(yǎng)24h后逐漸長(zhǎng)出軸突與樹(shù)突；神經(jīng)元培養(yǎng)3d，可見(jiàn)軸突、樹(shù)突相互交織形成神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)。經(jīng)染色發(fā)現(xiàn)神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)完整，染色質(zhì)均勻。微管相關(guān)蛋2（micotubule associated protein2，MAP2）集中表達(dá)在在神經(jīng)元的胞體和樹(shù)突上，Tubline-1主要在細(xì)胞軸突上高表達(dá)，根據(jù)多數(shù)文獻(xiàn)報(bào)道二者是鑒定神經(jīng)元細(xì)胞的重要標(biāo)志，見(jiàn)圖3。

圖1 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)及鑒定

圖2 外泌體鑒定

2.3 RT-PCR檢測(cè)miR17-92簇轉(zhuǎn)染至BMSC的水平表達(dá)

將miR-NC、miR17-92 mimics、antimiR-NC與anti-miR17-92轉(zhuǎn)染至 BMSCs，與miR-NC組比較 miR17-5p，miR18a-5p，miR19a-3p，miR19b-3p，miR20a-5p，miR92a-3p基因高表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)，其中miR17-92 mimics組高表達(dá)最顯著，見(jiàn)圖4。

圖3 原代皮質(zhì)神經(jīng)元形態(tài)學(xué)觀察及鑒定

圖4 RT-PCR 法檢測(cè)miR-17-92 轉(zhuǎn)染至BMSCs 情況(＊P＜0.05,＊＊P＜0.01)

2.4 RT-PCR法檢測(cè)各組神經(jīng)元miR-17-92簇的變化

各組 BMSCs-exosomes 干預(yù)神經(jīng)元細(xì)胞后，與正常組比較，miR-17-92 簇在缺氧+mimics control exosomes組及缺氧+ASONC-e xosomes 組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P ＞0.05)，其余組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)，其中缺氧+miR-17-92 cluster exosome組表達(dá)最高，見(jiàn)圖5。

2.5 檢測(cè)各組神經(jīng)元中PTEN(mRNA,Proten)表達(dá)

圖5 RT-PCR 法檢測(cè)各組神經(jīng)元miR-17-92 簇的變化(＊P＜0.05,＊＊P＜0.01)

各組BMSCs-exosomes干預(yù)神經(jīng)元細(xì)胞后，RT-PCR法檢測(cè)各組神經(jīng)元PTEN表達(dá)，與缺氧組對(duì)比，缺氧+miR17-92 cluster exosome組PTEN值最低(P ＜0.01)，缺氧+ASO miR17-92exosomes組表達(dá)最高(P ＜0.01)；WB法測(cè)各組神經(jīng)元PTEN表達(dá)，與缺氧組對(duì)比，缺氧+miR17-92 cluster exosome組PTEN值最低(P ＜0.01)，缺氧+ASO miR17-92exosomes組表達(dá)最高(P ＜0.01)，說(shuō)明 miR-17-92上調(diào)表達(dá)，PTEN下調(diào)表達(dá)，二者呈負(fù)相關(guān)，見(jiàn)圖6。

圖6 檢測(cè)各組神經(jīng)元中PTEN(mRNA,Proten)表達(dá)

2.6 WB法檢測(cè)各組神經(jīng)元PI3K/AKT/mTOR的變化

與缺氧組對(duì)比，p-PI3K、p-AKT、p-mTOR在缺氧+miR17-92 cluster exosome組蛋白表達(dá)量最高（P ＜0.01），缺氧+ASO miR17-92 cluster exosome組蛋白表達(dá)最低（P ＜0.01），提示miR17-92可通過(guò)靶向PTEN調(diào)控PI3K/AKT/mTOR從而促進(jìn)神經(jīng)元軸突生長(zhǎng)，見(jiàn)圖7。

圖7 WB 法檢測(cè)各組神經(jīng)元PTEN/PI3K/AKT/mTOR 的變化(＊P＜0.05,＊＊P＜0.01)

3 討論

缺血性中風(fēng)具有高死亡率和高致殘率，目前的臨床治療方案仍不滿(mǎn)意。缺血性腦卒中后的神經(jīng)可塑性包括神經(jīng)再生、突觸發(fā)生、少突發(fā)育和軸突生長(zhǎng)等，其主要病理事件是血管阻塞引起的腦缺血及隨后出現(xiàn)的腦組織神經(jīng)元損傷[15]，因此神經(jīng)元修復(fù)對(duì)腦卒中后期功能的恢復(fù)有著重要意義[16-17]。

研究表明，MSCs-exosomes介導(dǎo)了細(xì)胞間通訊，從而調(diào)節(jié)了腦組織損傷后的內(nèi)源性修復(fù)[18-21]。miR17-92基因簇對(duì)于神經(jīng)細(xì)胞的增殖和分化具有調(diào)控作用。永久梗塞的 MCAO模型小鼠室管膜下區(qū)（Subventricular zone,SVZ）神經(jīng)前體細(xì)胞中 miR17-92 簇水平顯著升高，提示miR17-92簇參與了神經(jīng)前體細(xì)胞增殖的調(diào)節(jié)[22]。本研究表明，在BMSCs 中轉(zhuǎn)染miR17-92mimics，使其分泌的exosomes過(guò)表達(dá) miR17-92，可顯著抑制 PTEN 表達(dá)。磷酸酶和張力蛋白同源物（PTEN）是癌癥中最常見(jiàn)的突變或缺失的基因，存在于染色體10q23-24區(qū)域。PTEN 在神經(jīng)系統(tǒng)中也有廣泛表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)通過(guò)敲除 PTEN 能極大促進(jìn)損傷視神經(jīng)的軸突再生[23]。PTEN 對(duì)調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖分化的經(jīng)典 PI3K/Akt途徑具有負(fù)調(diào)控作用[24]。哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）是 PI3K/Akt信號(hào)通路下游的關(guān)鍵分子，可整合細(xì)胞內(nèi)外信號(hào)，包括來(lái)自生長(zhǎng)因子、營(yíng)養(yǎng)、能量水平及細(xì)胞應(yīng)激的信號(hào)，以調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、存活、凋亡、自噬以及細(xì)胞周期進(jìn)程、血管生成、代謝等過(guò)程。此外，mTOR是一種重要的神經(jīng)元生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，包括軸突生長(zhǎng)和引導(dǎo)和樹(shù)突生長(zhǎng)[25]。本研究證實(shí)，轉(zhuǎn)染miR17-92的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體與缺氧損傷的神經(jīng)元共培養(yǎng)，可以通過(guò)負(fù)調(diào)控PTEN表達(dá)水平；當(dāng)PTEN蛋白高表達(dá)時(shí)，p-PI3K、p-AKT、p-mTOR蛋白低表達(dá)，進(jìn)而激活PI3K/AKT/mTOR這一軸突再生的關(guān)鍵通路。