周夢君，周 舒，黃小林，李響敏, ，熊勇華

（1.南昌大學 食品科學與技術國家重點實驗室，江西 南昌 330047；2.南昌大學食品學院，江西 南昌 330031）

膠體金免疫層析試紙條（gold nanoparticles-based immunochromatographic assay，AuNPs-ICA）是最常用的快速檢測方法之一。膠體金探針的生物活性與AuNPs-ICA的檢測性能密切相關。目前，制備膠體金探針的方法有物理吸附法、共價偶聯(lián)法和蛋白A/G介導的定向偶聯(lián)法。物理吸附法偶聯(lián)效率高、操作簡單，但是該方法在檢測一些含復雜基質的樣本時，因探針的穩(wěn)定性差而不能達到檢測要求。采用配基交換方式可使AuNPs表面富含羧基功能團，進一步可通過碳二亞胺法介導抗體的共價偶聯(lián)。與物理吸附法相比，該方法可以有效提高膠體金探針的穩(wěn)定性，從而擴展免疫層析試紙條的應用場景。然而，碳二亞胺法介導的抗體偶聯(lián)因抗體分子上不同部位的氨基都可能與活化的羧基發(fā)生偶聯(lián)反應，導致抗體在AuNPs表面可能出現(xiàn)端對、正對、側對或平對的取向，從而導致抗體中Fab片段與抗原結合的生物活性下降。通過控制抗體的取向（特異性偶聯(lián)Fc區(qū)域）使抗體Fab片段充分暴露，是提高抗體生物活性的有效手段。之前一些研究表明，蛋白A/G也可以特異性結合抗體的Fc片段，使得抗體豎立在AuNPs表面，可以最大限度地提高抗體的生物活性。然而，蛋白A/G必須首先通過共價偶聯(lián)的方法固定在AuNPs表面，這增加了膠體金探針合成的操作復雜度和生產成本。

本研究提出了一種基于酰肼基團共價定向偶聯(lián)抗體的新策略。該策略利用了部分抗體的Fc片段天然含有醛基的特性（或通過高碘酸鈉氧化抗體Fc片段糖基側鏈生成醛基），在弱酸條件下，醛基與酰肼基團通過親核加成反應形成共價鍵，從而實現(xiàn)抗體在AuNPs表面的定向偶聯(lián)。首先，采用種子生長法制備100 nm的AuNPs，自主合成羧基配體和酰肼配體，通過配基交換制備了羧基化膠體金（carboxylated gold nanoparticles，cAuNPs）以及酰肼化膠體金（hydrazided gold nanoparticles，hAuNPs）；進一步將抗玉米赤霉烯酮（zearalenone，ZEN）單克隆抗體與cAuNPs及hAuNPs共價偶聯(lián)，得到兩種膠體金探針；在此基礎上，比較兩種偶聯(lián)方法所需抗體標記量以及偶聯(lián)反應時間的差異；同時以兩種膠體金抗體偶聯(lián)物為探針制備試紙條，比較兩種試紙條檢測ZEN靈敏度的差異；此外，進一步評價酰肼介導的定向偶聯(lián)策略對試紙條檢測實際玉米樣本中ZEN的性能影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

檸檬酸三鈉 天津市大茂化學試劑廠；1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺（1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride，EDC）、對苯二酚、氯金酸、三氟乙酸（trifluoroacetic acid，TFA）、三異丙基硅烷（triisopropyl silane，TIPS）、二異丙基碳二亞胺（diisopropylcarbodiimide，DIC） 美國Sigma公司；,-二甲基乙酰胺（dimethylacetamide，DMA） 西隴科學股份有限公司；ZEN標準品、赭曲霉毒素標準品、伏馬毒素標準品、橘青霉素標準品、黃曲霉毒素G標準品、黃曲霉毒素B標準品、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇標準品、黃曲霉毒素B標準品 青島普瑞邦生物工程有限公司；豬血清 江西寶靈科技發(fā)展有限公司；山羊抗鼠IgG抗體 北京中杉生物技術有限公司；硝酸纖維素膜（NC膜） 德國Sartorius公司；吸水紙、PVC黏性底板上海捷寧生物技術有限公司；5-氧代-6,9,12,15,18-五氧雜-30-硫雜-31,31,31-三苯基-三十一碳酸由實驗室自主合成；實驗中所用試劑均為分析純；實驗用水為超純水。

1.2 儀器與設備

JEOL Model JEM-2100透射電子顯微鏡 日本日立高新技術有限公司；U-3900型紫外-可見分光光度計日本株式會社日立高新技術科學事務所；HGS201可編程切條機、HGS510劃膜噴金標機 杭州峰航科學儀器有限公司；膠體金試紙條讀取儀 無錫中德伯爾生物有限公司；DHP-9082電熱恒溫鼓風干燥箱 上海福瑪實驗設備有限公司；TGL-16K臺式高速冷凍離心機 湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；Nano ZSE粒度分析儀英國馬爾文公司；液相色譜-串聯(lián)質譜（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）儀、超高效液相色譜（ultra-high performance liquid chromatography，UPLC）儀 安捷倫科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 100 nm AuNPs的合成

采用檸檬酸還原法制備20 nm的種子金，具體方案如下：取1 mL 質量分數(shù)1%的氯金酸溶液加入裝有99 mL超純水的錐形瓶中，緩慢勻速攪拌條件下加熱至沸騰，迅速加入2.7 mL質量分數(shù)1%的檸檬酸三鈉溶液，快速攪拌10 min，待溶液顏色變?yōu)榫萍t色并且不再發(fā)生變化時，停止加熱，在攪拌條件下冷卻至室溫，置于4 ℃保存?zhèn)溆谩２捎梅N子生長法合成100 nm的AuNPs，具體方案如下：將1.0 mL上述方法合成的20 nm種子金溶液加入至裝有99 mL超純水的錐形瓶中，然后快速加入2.4 mL質量分數(shù)1%的氯金酸溶液，待攪拌均勻后，每隔10 min加入400 μL質量分數(shù)1%的檸檬酸三鈉溶液和200 μL對苯二酚溶液（30 mol/L），重復8 次。繼續(xù)反應1 h后，將所合成的膠體金溶液離心、棄上清液、沉淀復溶于10 mL質量分數(shù)0.02%的檸檬酸三鈉溶液中，置于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 配體的制備

1.3.2.1 羧基配體制備

參照Zhou Yaofeng等的方案并略作修改，羧基配體的制備方案如圖1所示：將300 mg 5-氧代-6,9,12,15,18-五氧雜-30-硫雜-31,31,31-三苯基-三十一碳酸溶于3 mL二氯甲烷中，加入2 mL TFA，瓶內溶液立即變成棕紅色，加入1 mL TIPS，溶液顏色變淺，于氮氣保護下室溫攪拌反應3 h。反應結束后，真空濃縮，黃色殘留油狀液體用正己烷攪洗4 次，每次5 mL，殘余物再通過真空干燥得到羧基配體。

圖1 羧基配體的合成方案Fig.1 Synthesis of the carboxyl ligand

1.3.2.2 酰肼配體制備

參照Zhou Yaofeng等的方案并進行衍生，酰肼配體的制備方案如圖2所示。將700 mg 5-氧代-6,9,12,15,18-五氧雜-30-硫雜-31,31,31-三苯基-三十一碳酸和330 mg己二酸二酰肼溶于25 mL DMA中，加入240 mg DIC，50 ℃攪拌反應18 h，反應結束后，真空濃縮，柱層析提純后，得到770 mg中間體，將其用5 mL二氯甲烷溶解，加入3 mL TFA和1.5 mL TIPS，于氮氣保護下室溫攪拌反應3 h。真空濃縮，黃色殘留油狀液體用正己烷攪洗6 次，每次6 mL，殘余物再通過真空干燥得到酰肼配體。

圖2 酰肼配體的合成方案Fig.2 Synthesis of the hydrazide ligand

1.3.3 羧基化膠體金探針（cAuNPs@mAbs）和酰肼化膠體金探針（hAuNPs@mAbs）的制備

1.3.3.1 cAuNPs@mAbs制備

利用羧基配體修飾AuNPs，制備cAuNPs。具體步驟如下：將10 mL膠體金（100 nm）溶液以4 000 r/min離心10 min，棄上清液，沉淀復溶于10 mL堿性超純水（pH 9）中，加入0.2 mg羧基配體，室溫緩慢振蕩反應4 h，反應混合物離心去除游離的配體，沉淀復溶于10 mL超純水中，置于4 ℃保存?zhèn)溆茫藭rcAuNPs濃度為0.11 pmol/L。然后，在EDC存在的情況下，將所合成的cAuNPs與抗ZEN單克隆抗體的氨基偶聯(lián)，制備cAuNPs@mAbs。具體步驟如下：在0.9 mL 0.01 mol/L磷酸緩沖液（phosphate buffer，PB，pH 7.0）中加入100 μL cAuNPs（0.011 pmol），再將2.53 μg抗ZEN單克隆抗體和4 μL EDC（10ng/mL）加入到上述混合溶液中，室溫攪拌反應90 min。加入100 μL的質量分數(shù)10% BSA溶液，封閉反應30 min。制備的膠體金探針以4 000 r/min離心10 min，沉淀重懸分散于100 μL PB溶液中，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3.2 hAuNPs@mAbs制備

將等比例的酰肼配體和羧基配體共修飾AuNPs，制備hAuNPs。具體步驟如下：將10 mL膠體金（100 nm）溶液以4 000 r/min離心10 min，棄上清液，沉淀復溶于10 mL堿性超純水（pH 9）中，再加入0.2 mg酰肼配體與0.2 mg羧基配體，室溫緩慢振蕩反應4 h，反應混合物離心去除游離的配體，沉淀復溶于10 mL超純水中，置于4 ℃保存?zhèn)溆?，此時hAuNPs濃度為0.11 pmol/L。然后，將所合成的hAuNPs與抗ZEN單克隆抗體的醛基偶聯(lián)，制備hAuNPs@mAbs。具體步驟如下：在0.9 mL 0.01 mol/L PB溶液（pH 6.5）中加入100 μL hAuNPs（0.011 pmol），再將1.32 μg抗ZEN單克隆抗體加入到上述混合溶液中反應10 min。加入20 μL豬血清溶液封閉30 min后，離心去除上清液，沉淀重懸分散于100 μL PB溶液中，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4 羧基化膠體金試紙條（cAuNPs-ICA）和酰肼化膠體金試紙條（hAuNPs-ICA）的制備及免疫層析檢測流程

試紙條由四部分組成：樣本墊、NC膜、吸水紙、PVC底板。使用劃膜儀將一定濃度的ZEN-BSA和羊抗鼠抗體（10ng/mL）噴涂到NC膜上，分別作為試紙條的T線和C線，37 ℃干燥6 h。將制備好的NC膜貼在底板上，再將吸水紙和樣本墊依次貼在底板的其余兩個部分，并與NC膜重疊1.0 mm左右，最后將組裝好的cAuNPs-ICA和hAuNPs-ICA切割成每條3.9 mm，密封干燥條件下保存。樣品中ZEN的檢測流程如圖3所示：取4 μL cAuNPs@mAbs或5 μL hAuNPs@mAbs與70 μL待測樣品提取液充分混合孵育5 min后，再加入到試紙條的加樣孔中，15 min后用膠體金讀取儀測定T線光密度（OD）和C線光密度（OD）。每個實驗做3 個平行。如果C線顯色T線不顯色，則為陽性結果；若T、C線都顯色，則為陰性結果；若C線不顯色，則結果無效。

圖3 cAuNPs-ICA和hAuNPs-ICA檢測ZEN的原理圖Fig.3 Schematic diagrams of the cAuNPs-ICA and hAuNPs-ICA for the detection of zearalenone

1.3.5 兩種膠體金試紙條檢測ZEN的標準曲線

將ZEN標準品用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS，pH 7.4）（0.01 mol/L）稀釋成終質量濃度為0～1 500 ng/mL的標準溶液，每個質量濃度取70 μL與5 μL cAuNPs@mAbs或4 μL hAuNPs@mAbs充分混勻后，移取70 μL混合物至樣品孔中（每個質量濃度重復3 次測定），15 min后使用讀取儀記錄試紙條T線與C線的讀值。以/為縱坐標（代表試紙條檢測系列標準品的OD/OD值，代表試紙條檢測陰性對照樣品的OD/OD值），ZEN溶液質量濃度的對數(shù)值為橫坐標，繪制定量檢測ZEN的試紙條標準曲線，確定線性定量范圍，并計算試紙條的IC以及檢出限（limit of detection，LOD），IC定義為抑制率為50%時所對應的ZEN質量濃度，LOD定義為抑制率為10%時所對應的ZEN質量濃度。

1.3.6 hAuNPs-ICA檢測性能的評價

1.3.6.1 玉米中ZEN的提取

采用GB 5009.209—2016《食品中玉米赤霉烯酮的測定》的方法提取玉米中ZEN。具體步驟如下：稱取40.0 g玉米粉碎試樣（精確到0.1 g）于均質杯中，加入4 g氯化鈉和100 mL乙腈-水（9∶1，/），以均質器高速攪拌2 min，定量濾紙過濾，濾液置于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.6.2 檢測條件優(yōu)化

移取5.0 mL經LC-MS/MS測定為陰性的玉米提取液，加入85 mL水稀釋混勻，定量濾紙過濾，濾液同時添加ZEN儲備液至終質量濃度為1 ng/mL。使用濃度為1 mol/L的HCl或NaOH溶液將陰性及陽性添加玉米稀釋液的pH值調成5.0、6.0、7.0、8.0。分別取70 μL不同pH值的玉米稀釋液與4 μL hAuNPs@mAbs反應5 min后，將上述溶液加到試紙條樣品孔中，每個梯度pH值重復3 次，15 min后使用讀取儀記錄試紙條T線與C線的讀值。競爭抑制率/%＝（1-/）×100，通過競爭抑制率確定試紙條最佳反應pH值。進一步將玉米提取液乙腈含量稀釋至體積分數(shù)0%、2.5%、5%、10%、15%、20%，按照上述方法評價溶液中乙腈含量對試紙條檢測性能的影響。

1.3.6.3 玉米樣本中ZEN的靈敏度檢測

在最佳檢測條件下，用陰性玉米稀釋液將ZEN標準品配制成若干個梯度標準溶液，各取70 μL上述溶液與4 μL hAuNPs@mAbs孵育5 min后加入到試紙條加樣孔中，每個質量濃度分別重復3 次，15 min后用膠體金讀取儀獲得試紙條T線與C線的讀值。以/為縱坐標，ZEN質量濃度對數(shù)值為橫坐標繪制標準曲線，得到試紙條的檢測靈敏度以及線性定量范圍。

1.3.6.4 試紙條精密度、準確度及特異性評價

分別配制加標量為1、10、100 μg/kg的ZEN陽性樣本，用hAuNPs-ICA進行檢測。每個不同質量濃度的ZEN樣品，在同1 d內使用同一批次試紙條分別測定3 次，每隔3 d測定1 次，且每個質量濃度重復3 次，最后通過計算得到每個質量濃度的平均加標回收率和批內、批間回收率，評價試紙條的精密度與準確度。選取糧食污染中常見的7 種真菌毒素進行試紙條的特異性評價，包括赭曲霉毒素A、伏馬菌素B、黃曲霉毒素B、黃曲霉毒素B、黃曲霉毒素G、橘青霉毒素、嘔吐毒素，并將質量濃度配制為1 000 ng/mL。然后將上述溶液與hAuNPs@mAbs混合反應5 min后加入試紙條加樣孔中，每種溶液測定3 次，記錄試紙條T線和C線的讀值，并與ZEN陽性樣品的競爭抑制率進行比較。

1.3.6.5 與UPLC法的相關性評價

取17 份經商業(yè)化ELISA試劑盒檢測為陽性的玉米樣本，使用本法和UPLC法同時檢測。以hAuNPs-ICA測定結果為橫坐標，UPLC法測定結果為縱坐標，繪制二者的相關性曲線并計算相關系數(shù)。

1.4 數(shù)據(jù)處理及分析

2 結果與分析

2.1 AuNPs、cAuNPs及hAuNPs的表征

根據(jù)實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)，大粒徑膠體金有利于提高競爭模式免疫層析方法的檢測靈敏度，因此本研究采用種子法合成了大粒徑的AuNPs。圖4 A表明，制備的AuNPs具有規(guī)則的球形形狀，尺寸為（100±4.3）nm（=50）。如圖4B所示，羧基配體在傅里葉紅外光譜中1 710 cm處出現(xiàn)羧基C＝O的伸縮振動峰，酰肼配體在1 654 cm處出現(xiàn)了明顯的酰胺鍵C＝O的伸縮振動峰，表明兩種配體已經成功合成。利用配基置換的方法制備cAuNPs和hAuNPs。相對于原始AuNPs，cAuNPs的Zeta電位從-36.8 mV略微增加到-32 mV，而hAuNPs的Zeta電位從-36.8 mV顯著增加到-16 mV（圖4C）。此外，與原始AuNPs相比，合成的cAuNPs和hAuNPs的紫外-可見吸收光譜出現(xiàn)明顯的紅移，cAuNPs和hAuNPs的紅移分別從566 nm到570 nm和573 nm（圖4D），而水化粒徑分別從99 nm增加到108 nm和111 nm（圖4E）。這些結果表明羧基和酰肼配體已經成功修飾到AuNPs表面。

圖4 AuNPs、cAuNPs和hAuNPs的表征Fig.4 Characterization of AuNPs,cAuNPs and hAuNPs

2.2 cAuNPs@mAbs和hAuNPs@mAbs的合成及表征

2.2.1 cAuNPs@mAbs合成及表征

通過EDC活化cAuNPs表面羧基與抗ZEN單克隆抗體上的氨基形成酰胺鍵制備cAuNPs@mAbs。為了獲得探針的最佳活性，對影響抗體活性的幾個關鍵偶聯(lián)參數(shù)進行優(yōu)化，具體包括緩沖液pH值、EDC用量、偶聯(lián)反應時間以及抗體飽和標記量。將制備的膠體金探針進行試紙條檢測，以試紙條T線顯色信號強弱確認最佳標記參數(shù)。如圖5A所示，當溶液pH 7.0時，試紙條T線顯色值（OD）最大，因此選取pH 7.0的緩沖液用于后續(xù)偶聯(lián)實驗。圖5B顯示，當EDC用量為0.364 mg/pmol時，試紙條OD值最高。圖5C顯示，T線讀值隨著偶聯(lián)時間的延長而增大，在偶聯(lián)反應90 min時，T線讀值達到最大，之后OD值保持穩(wěn)定，說明最佳偶聯(lián)反應時間為90 min?？贵w飽和標記量結果如圖5D所示，OD值隨著抗體用量的增加而增加，當抗體標記量達到0.23 mg/pmol時OD值最大，表明抗體最佳標記量為0.23 mg/pmol。在上述最優(yōu)條件下制備cAuNPs@mAbs并表征其水化粒徑，結果如圖5E所示，探針合成前后水化粒徑發(fā)生明顯改變，cAuNPs的粒徑從108 nm增加到145 nm，表明成功制備了cAuNPs@mAbs。

圖5 cAuNPs@mAbs的合成條件優(yōu)化Fig.5 Parameter optimization for synthesis of cAuNPs@mAbs

2.2.2 hAuNPs@mAbs合成及表征

溶液pH值和偶聯(lián)反應時間是影響酰肼定向偶聯(lián)效率的兩個關鍵參數(shù)。理論上，弱酸性條件有利于促進抗體Fc片段上醛基與hAuNPs酰肼基團發(fā)生親核加成反應。但是當溶液pH值接近抗體的等電點時，由于抗體溶解度下降反而會降低偶聯(lián)效率，甚至導致探針出現(xiàn)沉淀反應。如圖6A所示，當緩沖溶液pH 6.5時，OD值達到最大，表明此時探針具有最高的生物活性。在最佳的反應pH值條件下，將抗ZEN單克隆抗體與hAuNPs分別孵育1、3、5、7、10、30、50、70、90、120 min。圖6B顯示，抗體與hAuNPs孵育10 min后，試紙條OD值已經達到最大值，表明酰肼介導的親核加成反應在10 min內即可快速完成偶聯(lián)反應。相比于碳二亞胺介導的共價偶聯(lián)反應（90 min），酰肼介導的定向偶聯(lián)策略大大減少了探針的制備時間。在最佳的反應pH值下，使用不同量的抗ZEN單克隆抗體偶聯(lián)hAuNPs制備免疫探針。如圖6C所示，隨著ZEN抗體用量的增加，試紙條OD值也逐漸增加，當抗體標記量超過0.12 mg/pmol hAuNPs時，由于位阻效應試紙條OD值反而呈現(xiàn)降低趨勢。所以酰肼法介導的定向偶聯(lián)最佳抗體標記量為0.12 mg/pmol hAuNPs，較碳二亞胺介導的共價偶聯(lián)抗體用量降低接近一倍左右，表明定向偶聯(lián)策略能有效降低抗體的用量，從而減少試紙條的制作成本。在上述最優(yōu)條件下制備hAuNPs@mAbs并表征其水化粒徑，結果如圖6D所示，探針合成前后水化粒徑發(fā)生明顯改變，hAuNPs的粒徑從111 nm增加到136 nm，表明成功合成了hAuNPs@mAbs。

圖6 hAuNPs@mAbs制備條件優(yōu)化Fig.6 Parameter optimization for preparation of hAuNPs@mAbs

2.3 cAuNPs-ICA和hAuNPs-ICA制備

膠體金探針用量與T線ZEN-BSA噴涂質量濃度是影響試紙條靈敏度的兩個重要因素。為了獲得試紙條最佳檢測性能，本研究通過2因素3水平正交試驗優(yōu)化以上參數(shù)。如表1、2所示，當T線ZEN-BSA質量濃度為2.5×10ng/mL，cAuNPs@mAbs用量為5 μL/條，試紙條檢測1 ng/mL的ZEN樣品時，抑制率達到27.89%；當T線ZEN-BSA質量濃度為10ng/mL，hAuNPs@mAbs用量為4 μL/條，檢測1 ng/mL的ZEN樣品時，抑制率達到43.8%。此時，兩種膠體金試紙條T線與C線均具有合適的顯色信號（cAuNPs-ICA：OD=977±10，OD=183±16；hAuNPs-ICA：OD=801±17，OD=850±30）。因此，cAuNPs-ICA的最佳制備工藝為T線抗原噴涂質量濃度2.5×10ng/mL，探針用量5 μL/條。hAuNPs-ICA的最佳制備工藝為T線抗原噴涂質量濃度10ng/mL、探針用量4 μL/條。

表1 cAuNPs-ICA制備參數(shù)2因素3水平正交試驗優(yōu)化Table 1 Orthogonal array design and experimental results for parameter optimization for preparation of cAuNPs-ICA

表2 hAuNPs-ICA制備參數(shù)2因素3水平正交試驗優(yōu)化Table 2 Orthogonal array design and experimental results for parameter optimization for preparation of hAuNPs-ICA

2.4 兩種膠體金試紙條檢測ZEN的標準曲線

在最優(yōu)條件下，用兩種膠體金試紙條檢測PBS 7.4（0.01 mol/L）配制質量濃度為0～1 500 ng/mL的ZEN樣品。如圖7A所示，cAuNP-ICA與hAuNP-ICA定量檢測ZEN均呈良好的線性相關。如圖7B所示，當ZEN質量濃度介于0.488～31.253 ng/mL時，滿足線性回歸方程=-0.153ln+0.864（=0.978 8），經計算得cAuNPICA的IC為10.795 1 ng/mL，LOD為0.843 7 ng/mL；酰肼方法的線性回歸方程為=-0.124ln+0.701 5（=0.990 1），檢測范圍為0.2～100 ng/mL，IC為5.078 ng/mL，LOD為0.201 7 ng/mL。以上結果表明酰肼介導的定向偶聯(lián)抗體策略有助于提高試紙條的檢測靈敏度。因此，本研究選用該法用于后續(xù)實際玉米樣本中ZEN的檢測。

圖7 cAuNPs-ICA和hAuNPs-ICA在PBS中檢測ZEN的標準曲線Fig.7 Calibration curves for ZEN detection based on cAuNPs-ICA and hAuNPs-ICA

2.5 hAuNPs-ICA的性能評價

2.5.1 檢測參數(shù)的優(yōu)化

將hAuNPs-ICA應用于玉米樣本中ZEN的檢測，以評價其在實際樣本中的檢測性能。由于ZEN是一種脂溶性真菌毒素，在提取過程中通常需要添加較高濃度的乙腈或甲醇以提高ZEN的提取得率，而高濃度的有機溶劑會極大地破壞抗原-抗體的親和力，因此，本研究首先優(yōu)化溶液中乙腈體積分數(shù)對試紙條檢測性能的影響。如圖8A所示，當溶液中乙腈體積分數(shù)逐漸增加，競爭抑制率由39%下降至15%。說明隨著乙腈體積分數(shù)的增加，抗體-抗原的反應效果越來越差，從而影響試紙條的檢測性能。綜合考慮試紙條靈敏度以及樣本稀釋倍數(shù)兩個因素，最終選取溶液中乙腈體積分數(shù)為5%作為后續(xù)實驗條件。其次，溶液的pH值也會影響抗原-抗體的反應效率，因此進一步優(yōu)化了檢測體系的pH值。如圖8B所示，試紙條檢測陰性樣本的ODT/ODC值隨著pH值的升高而降低（由1.2±0.06下降至0.84±0.04），說明抗原-抗體的結合效率在下降。當溶液pH 5.0時，試紙條的競爭抑制率達到最高（43%），因此確定最佳反應pH 5.0。

圖8 hAuNPs-ICA檢測參數(shù)的優(yōu)化Fig.8 Optimization of detection parameters of hAuNPs-ICA

2.5.2 玉米樣本中ZEN的標準曲線

為減少玉米樣本基質對檢測結果準確性的影響，采用陰性玉米提取液配制質量濃度為0～10 000 ng/mL的ZEN標準溶液。圖9顯示，ZEN質量濃度在0.25～250 ng/mL范圍內，hAuNPs-ICA定量檢測ZEN呈良好線性相關，其線性回歸方程為=-0.122ln+0.778 1（=0.984 5），根據(jù)方程計算出IC為9.4 ng/mL，LOD為0.32 ng/mL。

圖9 hAuNPs-ICA檢測玉米樣本中ZEN的標準曲線Fig.9 Calibration curves for ZEN detection in corn based on hAuNPs-ICA

2.5.3 試紙條精密度、準確度及特異性評價

在玉米陰性樣本中添加量分別為1、10、100 μg/kg的ZEN 標準品，進行批間及批內加標實驗，評價hAuNPs-ICA的準確度和精密度。如表3所示，試紙條批內和批間的回收率在83.1%～118.0%之間，變異系數(shù)在3.9%～13.1%之間，表明hAuNPs-ICA具有良好的準確度和精密度。進一步選取糧食污染中常見的7 種真菌毒素進行試紙條的特異性評價，包括赭曲霉毒素A、伏馬菌素B、黃曲霉毒素B、黃曲霉毒素B、黃曲霉毒素G、橘青霉毒素、嘔吐毒素，并將質量濃度配制為1 000 ng/mL。結果表明本研究建立的hAuNPs-ICA與以上7 種真菌毒素無交叉反應，表明本研究方法檢測ZEN具有良好的特異性。

表3 hAuNPs-ICA精密度與準確度評價Table 3 Precision and accuracy of hAuNPs-ICA

2.5.4 與UPLC方法的相關性評價

取17 份經商業(yè)化ELISA試劑盒檢測為陽性的玉米樣本，使用酰肼法和UPLC方法同時檢測。以hAuNPs-ICA測定結果為橫坐標，UPLC方法的測定結果為縱坐標，繪制二者的相關性曲線。如圖10所示，hAuNPs-ICA與UPLC的檢測結果有較好的相關性（=0.962 7），表明該方法可應用于真實玉米樣品中ZEN的定量檢測。

圖10 hAuNPs-ICA方法與UPLC方法對比（n=17）Fig.10 Correlation between the results of hAuNPs-ICA and UPLC (n=17)

3 結論

建立了一種利用膠體金納米粒子表面的酰肼基團與抗體Fc片段醛基發(fā)生親核反應，從而實現(xiàn)抗體在金納米粒子表面定向共價偶聯(lián)的新方法。該方法與常規(guī)碳二亞胺共價法相比具有以下優(yōu)勢：1）偶聯(lián)過程無需額外添加其他偶聯(lián)反應試劑；2）抗體飽和標記量更低（0.12 mg/pmol）；3）偶聯(lián)時間更短（10 min）；4）基于hAuNPs-mAbs探針制備的試紙條檢測ZEN具有更高的靈敏度（0.2 ng/mL），以及更寬的定量檢測范圍（0.2～100 ng/mL）。以上結果表明hAuNPs金作為一種新型標記材料在提高免疫層析方法檢測性能方面具有廣泛的開發(fā)應用價值。