曹子岳，董永貞，彭雪雯，陳 瑞，江 豐，范志勇，俞曉平，陳翊平,

（1.華中農(nóng)業(yè)大學食品科學技術(shù)學院，湖北 武漢 430070；2.湖北省食品質(zhì)量安全監(jiān)督檢驗研究院，湖北 武漢 430074；3.中國計量大學生命科學學院，浙江 杭州 310018）

魚肉含有豐富的蛋白質(zhì)、不飽和脂肪酸、微量元素等營養(yǎng)物質(zhì)，受到消費者的普遍喜愛。但魚肉在加工貯存過程中，會發(fā)生一系列的化學、物理和生物變化（例如糖酵解、蛋白質(zhì)水解和脂肪降解），導致其腐敗變質(zhì)，營養(yǎng)價值降低，甚至產(chǎn)生有毒物質(zhì)，威脅人體健康。其中，魚肌肉中三磷酸腺苷的降解為主要的反應之一，其發(fā)生順序如下：三磷酸腺苷→二磷酸腺苷→單磷酸腺苷→單磷酸肌苷→肌苷→次黃嘌呤→黃嘌呤→尿酸。在此反應中，次黃嘌呤是主要的分解產(chǎn)物，在魚被宰殺后會立即積累，并被黃嘌呤氧化酶（xanthine oxidase，XOD）催化分解生成黃嘌呤和尿酸。研究表明，當魚肉中的次黃嘌呤含量超過102 mg/kg時，魚肉初步腐敗；當魚肉中的次黃嘌呤含量超過144 mg/kg時，魚肉完全腐敗。此外，在魚類及其產(chǎn)品生產(chǎn)、運輸和貯存過程中，組胺通常也是質(zhì)量監(jiān)控的生物標志物之一，若人體攝入過量的組胺將引發(fā)特定的生理毒害作用，如運動神經(jīng)元損傷、心臟損害等。歐盟頒布的標準法規(guī)中規(guī)定魚和魚產(chǎn)品中組胺的限量為100 mg/kg。因此，針對次黃嘌呤和組胺進行快速分析，對評定魚肉新鮮度和魚產(chǎn)品品質(zhì)以及保障人體健康具有重要意義。

目前，次黃嘌呤和組胺的檢測方法主要包括傳統(tǒng)方法和生物傳感器法。傳統(tǒng)方法例如薄層色譜法、毛細管電泳法和高效液相色譜法。其中薄層色譜法操作方便、設備簡單，但靈敏度較低；毛細管電泳法靈敏度高、成本低，但穩(wěn)定性和重現(xiàn)性較差；高效液相色譜法靈敏度高、準確性好，但需要復雜的前處理步驟和昂貴的儀器設備，限制了它們的進一步應用。生物傳感器法是一種較為新穎的檢測方法。研究人員已經(jīng)開發(fā)了一系列生物傳感器檢測次黃嘌呤和組胺，例如比色生物傳感器、電化學生物傳感器等。但這些生物傳感器大多仍受限于靈敏度低、成本高、操作流程復雜等因素，難以應用到次黃嘌呤和組胺的快速檢測中。

磁弛豫生物傳感器是一種新型的生物傳感器，通過納米磁顆?；蝽槾烹x子改變水分子的弛豫行為，以弛豫時間作為信號對目標物質(zhì)進行定量分析。如圖1A所示，Mn（II）具有多個不成對軌道電子（1s2s2p3s3p3d，5 個未成對軌道電子），由于電子偶極子與質(zhì)子偶極子的相互作用，改變水分子的弛豫行為，具有較長的電子自旋共振（electron spin resonance，ESR）信號，磁信號更強，橫向弛豫時間（transverse relaxation time，）更短，而Mn（VII）無未成對軌道電子（1s2s2p3s3p3d），因此具有較短的ESR信號，磁信號可忽略，更長；與之類似，F(xiàn)e（II）具有較少的未成對軌道電子（1s2s2p3s3p3d，4 個未成對軌道電子），具有較短的ESR信號，磁信號弱，值高，而Fe（III）具有較多的未成對軌道電子（1s2s2p3s3p3d，5 個未成對軌道電子），具有較長的ESR信號，磁信號強，值低。因此，可通過Mn（VII）/Mn（II）和Fe（III）/Fe（II）的價態(tài)轉(zhuǎn)換，實現(xiàn)生物傳感信號的讀出。

次黃嘌呤和組胺分別能被XOD 和二胺氧化酶（diamine oxidase，DAO）催化分解產(chǎn)生過氧化氫（如式（1）～（3））。本研究通過利用HO的還原性和氧化性，誘導不同價態(tài)順磁離子（Mn（VII）/Mn（II）和Fe（II）/Fe（III））的轉(zhuǎn)化（式（4）、（5）），使磁信號發(fā)生變化，進而改變周圍水分子的值，以實現(xiàn)次黃嘌呤和組胺的定量分析。建立的磁弛豫生物傳感器的測定原理如式（1）～（5）和圖1所示。

圖1 順磁離子介導的磁弛豫生物傳感器的構(gòu)建原理圖Fig.1 Schematic diagram of the construction of paramagnetic ionsmediated magnetic relaxation switching biosensor

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

從當?shù)厥袌鲑徺I鯽魚作為實際樣品，收集魚肉并用絞肉機絞碎后保存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

次黃嘌呤、XOD 上海源葉生物科技有限公司；組胺上海麥克林生化科技有限公司；DAO 上海鼓臣生物技術(shù)有限公司；HO溶液（質(zhì)量分數(shù)30%）、高錳酸鉀、四水合二氯化錳、七水合硫酸亞鐵、六水合氯化鐵、NaOH、三氯乙酸、HSO溶液（質(zhì)量分數(shù)98%）、HCl溶液（質(zhì)量分數(shù)36.0%～38.0%）（均為分析純） 國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

0.47 T低場核磁共振（low field-nuclear magnetic resonance，LF-NMR）儀 上海紐邁電子科技有限公司；D-37520離心機 美國貝克曼公司；ME104E電子分析天平 梅特勒-托利多國際貿(mào)易（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 順磁離子溶液的值測定

用去離子水制備梯度濃度的M n（VII）、Mn（II）溶液（1.95、3.9、7.81、15.63、31.25、62.5、125、250、500、1 000 μmol/L）和Fe（III）、Fe（II）溶液（156.3、312.5、625、1 250、2 500、5 000、10 000 μmol/L），去離子水作為空白對照。用LF-NMR儀對制備好的順磁離子溶液進行的測定，用CPMG脈沖序列進行的測定，參數(shù)如下：NMR頻率19.00 MHz；重復采樣等待時間5 000 ms；回波時間1 ms；前置放大增益3；回波個數(shù)18 000；采樣頻率100 kHz。計算值的變化值：Δ＝去離子水-順磁離子溶液。

1.3.2 順磁離子溶液濃度的優(yōu)化

將200 μL不同濃度的KMnO溶液（0.2、0.5、1.0 mmol/L）分別加入到200 μL梯度濃度的HO溶液（0、20、50、100、200、500、1 000 μmol/L）和100 μL 0.1 mol/L HSO溶液的混合溶液中，室溫下靜置反應5 min，對反應后溶液進行的測定。

將200 μL不同濃度FeSO溶液（1、2、5 mmol/L）分別加入到200 μL梯度濃度的HO溶液（0、0.1、0.2、0.5、1 mmol/L）和100 μL 0.2 mol/L HCl溶液的混合溶液中，室溫下靜置反應5 min，進行氧化還原反應，對反應后溶液進行的測定。

1.3.3 順磁離子介導系統(tǒng)對HO的響應測定

將200 μL梯度濃度的HO溶液（0、1.95、3.9、7.81、15.63、31.25、62.5、125、250、500、1 000、2 500 μmol/L）分別加入到200 μL 0.5 mmol/L KMnO溶液和100 μL 0.1 mol/L HSO溶液的混合溶液中，室溫下靜置反應5 min，對反應后溶液進行的測定。

將200 μL梯度濃度的HO溶液（0、10、20、50、100、200、500、1 000 μmol/L）分別加入到200 μL 2 mmol/L FeSO溶液和100 μL 0.2 mol/L HCl溶液的混合溶液中，在室溫下靜置反應5 min，進行氧化還原反應，對反應后溶液進行的測定。

1.3.4 順磁離子介導磁弛豫生物傳感器檢測次黃嘌呤和組胺的可性行測定

將100 μL 0.5 mg/mL DAO加入到200 μL 0.5 mmol/L KMnO溶液和100 μL 0.1 mol/L HSO溶液的混合溶液中進行氧化還原反應。

將100 μL 1.05 mmol/L次黃嘌呤溶液與100 μL 1 mg/mL XOD混合均勻，在37 ℃下酶催化反應30 min。反應后，在上述反應溶液中加入200 μL 0.5 mmol/L KMnO溶液和100 μL 0.1 mol/L HSO溶液的混合液中，室溫下反應5 min，反應后測定其值。

將100 μL 1 mmol/L組胺溶液與100 μL 2 mg/mL DAO混合均勻，在37 ℃下酶催化反應60 min。反應后，在上述反應溶液中加入200 μL 2 mmol/L FeSO溶液和100 μL 0.2 mol/L HCl溶液的混合液中，室溫下反應5 min，反應后測定其值。

1.3.5 最優(yōu)XOD與DAO質(zhì)量濃度的測定

將100 μL不同質(zhì)量濃度的XOD（0.1、1、2、5 mg/mL）與100 μL 1.05 mmol/L次黃嘌呤溶液混合均勻，在37 ℃下酶催化反應30 min。反應后，在上述反應溶液中加入200 μL 0.5 mmol/L KMnO溶液和100 μL 0.1 mol/L HSO溶液的混合液，室溫下反應5 min，反應后測定其值。

將100 μL不同質(zhì)量濃度的DAO（1、2、5、10 mg/mL）與100 μL 1 mmol/L組胺溶液混合均勻，并在37 ℃下酶催化反應60 min。反應后，在上述反應溶液中加入200 μL 2 mmol/L FeSO溶液和100 μL 0.2 mol/L HCl溶液的混合液，室溫下反應5 min，反應后測定其值。

1.3.6 Mn（VII）/Mn（II）介導磁弛豫生物傳感器檢測次黃嘌呤

將100 μL梯度濃度的次黃嘌呤溶液（0、0.105、0.525、1.05、5.25、10.5、26.3、52.5、105、263、394、525、630、1 050 μmol/L）與100 μL最優(yōu)質(zhì)量濃度的XOD混合均勻，在37 ℃下酶催化反應30 min。反應后，在上述反應溶液中加入200 μL最優(yōu)濃度的KMnO溶液和100 μL 0.1 mol/L HSO溶液的混合液，室溫下反應5 min，反應后測定其值。0 μmol/L次黃嘌呤溶液為空白樣品。

1.3.7 Fe（III）/Fe（II）介導磁弛豫生物傳感器檢測組胺

將100 μL梯度濃度的組胺溶液（0、1、2、5、10、20、50、100、200、500、1 000 μmol/L）與100 μL 最優(yōu)質(zhì)量濃度的DAO混合均勻，在37 ℃下酶催化反應60 min。反應后，在上述反應溶液中加入200 μL最優(yōu)濃度的FeSO溶液和100 μL 0.2 mol/L HCl溶液的混合液，室溫下反應5 min，反應后測定其值。0 μmol/L組胺溶液為空白樣品。

1.3.8 順磁離子介導磁弛豫生物傳感器的特異性測試

在最優(yōu)條件下，對Mn（VII）/Mn（II）介導磁弛豫生物傳感器檢測次黃嘌呤的特異性進行測試，使用263 μmol/L次黃嘌呤、500 μmol/L葡萄糖、150 μmol/L尿酸、25 μmol/L乳酸、25 μmol/L抗壞血酸混合溶液作為測試溶液。測試步驟和反應條件與1.3.6節(jié)一致。

在最優(yōu)條件下，對Fe（III）/Fe（II）介導磁弛豫生物傳感器檢測組胺的特異性進行測試，使用100 μmol/L組胺、500 μmol/L葡萄糖、263 μmol/L次黃嘌呤、25 μmol/L乳酸、25 μmol/L抗壞血酸混合溶液作為測試溶液。測試步驟和反應條件與1.3.7節(jié)一致。

1.3.9 順磁離子介導磁弛豫生物傳感器的實際樣品測試

1.3.9.1 加標回收率測試

向鯽魚樣品中分別加入不同濃度次黃嘌呤標準品（80、250、750 μmol/L）和10 mL 1 mol/L三氯乙酸溶液，超聲15 min，在10 000 r/min下離心10 min，收集上清液。用1 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)上清液至pH 6.5得到待測液，取100 μL待測液用Mn（VII）/Mn（II）介導磁弛豫生物傳感器在最優(yōu)條件下進行檢測，測試步驟和反應條件與1.3.6節(jié)一致。

向鯽魚樣品中加入不同濃度組胺標準品（10、200、1 000 μmol/L），加入45 mL去離子水，超聲15 min，在10 000 r/min下離心10 min，收集上清液為待測液。取100 μL待測液用Fe（III）/Fe（II）介導磁弛豫生物傳感器最優(yōu)條件下進行檢測，測試步驟和反應條件與1.3.7節(jié)一致。

1.3.9.2 鯽魚樣品中次黃嘌呤的測定

將鯽魚樣品在25 ℃下分別貯藏0、1、3、6、10、20 h。分別取5 g不同貯藏時間的魚肉樣品于離心管中，加入10 mL 1 mol/L三氯乙酸，超聲15 min，在10 000 r/min下離心10 min，收集上清液。用1 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)上清液至pH 6.5得到待測液，取100 μL待測液用Mn（VII）/Mn（II）介導磁弛豫生物傳感器在最優(yōu)條件下進行檢測，測試步驟和反應條件與1.3.6節(jié)一致。為保證磁弛豫生物傳感器的準確性，使用葛倩倩報道的高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法確定鯽魚樣品中的次黃嘌呤含量。

1.3.9.3 鯽魚樣品中組胺的測定

取5 g 1.3.9.2節(jié)中不同貯藏時間的鯽魚樣品于離心管中，加入45 mL去離子水，超聲15 min，在10 000 r/min下離心10 min，收集上清液為待測液。取100 μL待測液用Fe（III）/Fe（II）介導磁弛豫生物傳感器在最優(yōu)條件下進行檢測，測試步驟和反應條件與1.3.7節(jié)一致。為保證磁弛豫生物傳感器的準確性，使用郭慧等報道的HPLC法確定鯽魚樣品中的組胺含量。

1.3.9.4 順磁離子介導的磁弛豫生物傳感器用于指導魚肉貯藏方式

采用常規(guī)包裝4 ℃貯藏、真空包裝25 ℃貯藏、真空包裝4 ℃貯藏3 種方式對魚肉樣品進行處理并貯藏20 h，貯藏完成后使用1.3.9.2節(jié)和1.3.9.3節(jié)步驟分別對不同貯藏方式魚肉樣品中的次黃嘌呤和組胺進行檢測。

1.4 數(shù)據(jù)處理

實驗均重復3 次，數(shù)據(jù)由Origin 2018軟件處理并繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 順磁離子磁信號的分析

為驗證磁弛豫信號讀出系統(tǒng)的可用性，首先對Mn（VII）、Mn（II）、Fe（III）和Fe（II）溶液的值進行比較。如圖2A所示，Mn（VII）的Δ值可以忽略不計，磁信號接近于水，而Mn（II）具有很強的磁信號，兩者轉(zhuǎn)換產(chǎn)生的傳感信號是一種從無到有的過程。如圖2B所示，相同濃度下，F(xiàn)e（III）具有更強的磁信號，且兩者磁信號差異明顯，兩者轉(zhuǎn)換產(chǎn)生的傳感信號是一種從弱到強的過程。因此，Mn（VII）/Mn（II）和Fe（III）/Fe（II）的價態(tài)轉(zhuǎn)換可用于開發(fā)磁弛豫生物傳感器的讀出系統(tǒng)，用于氧化還原底物如HO的定量分析。

圖2 Mn（VII）/Mn（II）（A）和Fe（II）/Fe（III）（B）的T2信號測定值Fig.2 T2 signals of Mn (VII)/Mn (II) (A) and Fe (II)/Fe (III) (B)

2.2 順磁離子介導磁弛豫生物傳感信號讀出系統(tǒng)的構(gòu)建

2.2.1 順磁離子溶液濃度的優(yōu)化

以HO誘導的順磁離子價態(tài)轉(zhuǎn)化作為磁弛豫生物傳感器的信號讀出系統(tǒng)，研究不同的Mn（VII）和Fe（II）濃度下，順磁離子系統(tǒng)對HO的響應性能。如圖3A所示，在HO濃度較低時，0.2 mmol/L Mn（VII）溶液與0.5 mmol/L Mn（VII）溶液具有相近的Δ值；在HO濃度較高時，0.2 mmol/L Mn（VII）溶液的響應趨于平緩；當Mn（VII）濃度為1.0 mmol/L時，對HO的響應強度低。當Mn（VII）濃度為0.5 mmol/L時，具有更好的響應性能和趨勢。因此，選擇0.5 mmol/L的Mn（VII）濃度用于后續(xù)實驗。如圖3B所示，當Fe（II）濃度為1 mmol/L時，在HO濃度大于0.5 mmol/L后，Δ值不再改變；當Fe（II）濃度為5 mmol/L時，對HO響應強度變化較小。因此，選擇2 mmol/L的Fe（II）濃度用于后續(xù)實驗。

圖3 不同濃度Mn（VII）（A）和Fe（II）（B）對H2O2的響應性能Fig.3 Response performance to H2O2 of different concentrations of Mn (VII) (A) and Fe (II) (B)

2.2.2 Mn（VII）/Mn（II）和Fe（III）/Fe（II）介導的系統(tǒng)對HO的響應分析

在最優(yōu)Mn（VII）和Fe（II）濃度下，構(gòu)建順磁離子介導的磁弛豫生物傳感信號讀出系統(tǒng)。如圖4A、C所示，隨著HO濃度的增加，Mn（VII）/Mn（II）和Fe（II）/Fe（III）系統(tǒng)的Δ值均逐漸增強，表明有更多的Mn（VII）被還原為Mn（II），更多的Fe（II）被氧化為Fe（III）。以HO濃度的對數(shù)為橫坐標（lg），建立標準曲線，分析其線性關(guān)系和方法的檢出限（limit of detection，LOD）（LOD由空白樣品標準偏差（standard deviation，SD）的3 倍與標準曲線在低濃度范圍斜率（）的比得到）。如圖4B所示，Mn（VII）/Mn（II）系統(tǒng)的線性范圍為7.81～1 000 μmol/L（＝841.22-466.08），線性相關(guān)系數(shù)（）為0.99，LOD為0.8 μmol/L（SD為6.97，為26.2）。如圖4D所示，F(xiàn)e（II）/Fe（III）系統(tǒng)的線性范圍為10～1 000 μmol/L（＝615.4+434.16），為0.994，LOD為1.42 μmol/L（SD為5.2，為10.98）。這些結(jié)果表明Mn（VII）/Mn（II）和Fe（II）/Fe（III）系統(tǒng)均對HO具有良好的響應，證明順磁離子價態(tài)轉(zhuǎn)化介導的磁弛豫信號讀出系統(tǒng)具有可行性。

圖4 Mn（VII）/Mn（II）（A、B）和Fe（II）/Fe（III）（C、D）介導磁弛豫信號讀出系統(tǒng)H2O2響應性能Fig.4 Response performance to H2O2 of Mn (VII)/Mn (II) (A and B)and Fe (II)/Fe (III) (C and D)-mediated readout systems for magnetic relaxation signals

2.3 順磁離子介導磁弛豫生物傳感器的構(gòu)建

2.3.1 順磁離子介導磁弛豫生物傳感器檢測次黃嘌呤和組胺的可性行分析

如圖5A所示，DAO能夠直接將Mn（VII）還原為Mn（II），磁信號變化明顯，因此選用Fe（II）/Fe（III）系統(tǒng)對組胺進行檢測。如圖5B、C所示，反應液的磁信號發(fā)生明顯變化，說明在此酶催化條件下（100 μL 1.05 mmol/L次黃嘌呤溶液中加入100 μL 1 mg/mL XOD；100 μL 1 mmol/L組胺溶液中加入100 μL 2 mg/mL DAO），反應體系能夠產(chǎn)生HO并使順磁離子價態(tài)發(fā)生轉(zhuǎn)化，證明順磁離子介導磁弛豫生物傳感器用于檢測次黃嘌呤和組胺具有可行性。

圖5 DAO對Mn（VII）/Mn（II）系統(tǒng)的影響（A）與Mn（VII）/Mn（II）（B）和Fe（II）/Fe（III）（C）介導磁弛豫生物傳感器檢測次黃嘌呤和組胺的可行性驗證Fig.5 Effect of DAO on the Mn (VII)/Mn (II) system (A) and feasibility of Mn (VII)/Mn (II) (B) and Fe (II)/Fe (III) (C)-mediated magnetic relaxation switching biosensor for the detection of hypoxanthine and histamine

2.3.2 酶質(zhì)量濃度的優(yōu)化

為了提高順磁離子介導磁弛豫生物傳感器的分析性能，對XOD和DAO的用量進行優(yōu)化。由圖6A可知，當XOD的質(zhì)量濃度高于1 mg/mL時，Δ值相近，表明1 mg/mL XOD可以完全催化100 μL 1.05 mmol/L次黃嘌呤。因此，選擇1 mg/mL XOD用于后續(xù)實驗。由圖6B可知，當DAO的質(zhì)量濃度高于2 mg/mL時，Δ值相近，表明2 mg/mL DAO可以完全催化100 μL 1 mmol/L組胺。因此，選擇2 mg/mL的DAO用于后續(xù)實驗。

圖6 XOD（A）和DAO（B）質(zhì)量濃度的優(yōu)化Fig.6 Optimization of XOD (A) and DAO (B) concentrations

2.3.3 Mn（VII）/Mn（II）和Fe（III）/Fe（II）介導磁弛豫生物傳感器檢測次黃嘌呤和組胺分析

在最優(yōu)條件下，對梯度濃度的次黃嘌呤和組胺進行測定。如圖7A、C所示，隨著目標物質(zhì)（次黃嘌呤和組胺）濃度的增大，Δ值均逐漸增強。以次黃嘌呤或組胺濃度的對數(shù)為橫坐標，建立標準曲線。由圖7B可知，Mn（VII）/Mn（II）介導磁弛豫傳感器檢測次黃嘌呤的線性范圍是0.525～1 050 μmol/L，線性回歸方程＝473.77+762.38，為0.996，LOD為0.17 μmol/L（SD為23.36，為420.69）。由圖7D可知，F(xiàn)e（II）/Fe（III）介導磁弛豫傳感器檢測組胺的線性范圍是5～1 000 μmol/L，線性回歸方程＝187.93+838.86，為0.992，LOD為2.34 μmol/L（SD為8.32，為10.68）。這些結(jié)果表明，順磁離子介導磁弛豫生物傳感器能夠?qū)崿F(xiàn)次黃嘌呤和組胺的定量分析，并且檢測范圍寬，靈敏度高，可進一步用于魚肉新鮮度的評價。

圖7 Mn（VII）/Mn（II）（A、B）和Fe（II）/Fe（III）（C、D）介導磁弛豫傳感器檢測次黃嘌呤和組胺的性能Fig.7 Detection performance of Mn (VII)/Mn (II) (A and B) and Fe (II)/Fe (III) (C and D)-mediated magnetic relaxation sensor for hypoxanthine and histamine

2.4 順磁離子介導的磁弛豫生物傳感器的特異性和準確性

魚肉基質(zhì)復雜，能夠在一定程度上影響檢測方法的特異性和準確性。通過向魚肉樣品中分別添加不同濃度的干擾物質(zhì)研究磁弛豫生物傳感器檢測次黃嘌呤和組胺的特異性。如圖8A、B所示，僅次黃嘌呤或組胺存在時，反應液具有較高的Δ值且響應明顯，因此該順磁離子介導的磁弛豫生物傳感器檢測次黃嘌呤或組胺的特異性良好。

圖8 Mn（VII）/Mn（II）（A）和Fe（II）/Fe（III）（B）介導的磁弛豫生物傳感器檢測次黃嘌呤和組胺的特異性Fig.8 Specificity of Mn (VII)/Mn (II) (A) and F (II)/Fe (III) (B)-mediated magnetic relaxation switching biosensor for the detection of hypoxanthine and histamine

對方法的加標回收率進行考察如表1 所示，Mn（VII）/Mn（II）介導的磁弛豫傳感器對次黃嘌呤的回收率為76.26%～102.7 6%，變異系數(shù)為7.32%～10.15%；Fe（II）/Fe（III）介導的磁弛豫傳感器對組胺的回收率為70.73%～90.42%，變異系數(shù)為8.01%～13.36%，證明本方法具有良好的準確性。

表1 Mn（VII）/Mn（II）和Fe（II）/Fe（III）介導的磁弛豫生物傳感器檢測魚肉樣品中次黃嘌呤和組胺的回收率（n＝3）Table 1 Recoveries of Mn (VII)/Mn (II) and Fe (II)/Fe (III)-mediated magnetic relaxation switching biosensor for hypoxanthine and histamine in spiked fish samples (n=3)

如表2所示，與其他方法相比，本研究提出的方法對次黃嘌呤的檢測具有最低的LOD，且線性范圍寬于絕大多數(shù)方法；對組胺的檢測具有較低的LOD和較寬的線性范圍。雖然一些光學和電化學傳感器的LOD更低，但本研究建立的生物傳感器相較于光學傳感器，線性范圍不分段且明顯寬于電化學傳感器，因此在實際應用中具有更好的潛力。

表2 順磁離子介導磁弛豫生物傳感器檢測次黃嘌呤和組胺與其他方法的對比Table 2 Comparison of paramagnetic ions-mediated magnetic relaxation switching biosensor with other reported methods for the detection of hypoxanthine and histamine

2.5 順磁離子介導磁弛豫生物傳感器的鯽魚樣品測試分析

將鯽魚樣品在室溫條件下分別貯藏不同時間后，用所構(gòu)建的傳感器進行檢測，并與HPLC進行比對。如圖9所示，貯藏10 h后，從魚肉樣品中Mn（VII）/Mn（II）介導磁弛豫生物傳感器檢測到的次黃嘌呤超過375 μmol/L（102 mg/kg），組胺均超過100 μmol/L（100 mg/kg），這意味著在室溫下存儲，次黃嘌呤和組胺持續(xù)產(chǎn)生，導致魚肉開始變質(zhì)。在貯藏20 h后，Mn（VII）/Mn（II）介導的磁弛豫生物傳感器檢測到的次黃嘌呤超過529 μmol/L（144 mg/kg），表明魚肉已經(jīng)完全變質(zhì)。此外，本研究所構(gòu)建的順磁離子介導的磁弛豫生物傳感器與HPLC檢測結(jié)果具有良好的一致性，表明本方法具有良好的準確性和實際應用潛力。

圖9 順磁離子介導的磁弛豫生物傳感器和HPLC檢測魚肉樣品中的次黃嘌呤（A）和組胺（B）Fig.9 Results of paramagnetic ions-mediated magnetic relaxation switching biosensor and HPLC for hypoxanthine (A) and histamine (B)in fish samples

2.6 順磁離子介導磁弛豫生物傳感器檢測不同貯藏方式下魚肉品質(zhì)的變化

如圖10所示，在25 ℃真空包裝貯藏20 h后，魚肉中次黃嘌呤的含量超過了102 mg/kg（開始變質(zhì)），組胺含量未超過100 mg/kg，這表明真空包裝可以有效地控制魚的質(zhì)量，原因可能是真空包裝可以降低氧氣濃度，從而減弱了三磷酸腺苷的降解速度和微生物的作用。而4 ℃常規(guī)包裝貯藏時，次黃嘌呤和組胺含量均未超標。進一步研究4 ℃真空包裝貯藏對魚肉的保鮮效果，發(fā)現(xiàn)貯藏20 h后，次黃嘌呤與組胺含量低于4 ℃常規(guī)包裝貯藏。因此，4 ℃真空包裝是一種有效保證魚肉品質(zhì)的方式。

圖10 順磁離子介導磁弛豫生物傳感器檢測不同貯藏方式下魚肉樣品中次黃嘌呤和組胺的變化Fig.10 Changes in hypoxanthine and histamine contents in fish samples during storage under different conditions as detected by paramagnetic ions-mediated magnetic relaxation switching biosensor

3 結(jié)論

構(gòu)建一種順磁離子價態(tài)轉(zhuǎn)換介導的磁弛豫生物傳感器，通過酶催化反應產(chǎn)生HO實現(xiàn)生物信號的轉(zhuǎn)化，進而結(jié)合氧化還原反應實現(xiàn)順磁離子的價態(tài)轉(zhuǎn)換，最終實現(xiàn)磁弛豫信號的高效讀出。本方法實現(xiàn)了魚肉中次黃嘌呤（LOD為0.17 μmol/L）和組胺（LOD為2.34 μmol/L）的高靈敏快速檢測，線性范圍分別為0.525～1 050 μmol/L和5～1 000 μmol/L，且與HPCL檢測結(jié)果一致，可用于魚肉品質(zhì)的高效評價。與傳統(tǒng)的HPLC分析相比，本研究所構(gòu)建的順磁離子介導的磁弛豫生物傳感器不需要精密昂貴的儀器和專業(yè)的檢測人員，所用設備簡單，極大簡化了次黃嘌呤和組胺的檢測過程和檢測費用，在魚肉品質(zhì)評定方面具有良好的應用潛力。